利用内皮集落形成细胞与间充质干细胞共培养球体的三维血管生成检测系统

摘要

三维共培养类球体血管生成检测系统旨在模拟生理性的血管生成过程。该共培养类球体由两种人源血管前体细胞——内皮集落形成细胞（ECFCs）和间充质干细胞（MSCs）——组成，并包埋于胶原凝胶中。该新系统可用于有效评估血管生成调节剂，并能为体内研究提供更相关的生物学信息。

摘要

近几十年来，随着人们认识到血管生成是超过50种不同病理状态（如类风湿性关节炎、眼病、心血管疾病和肿瘤转移）的共同特征，血管生成领域的研究迅速发展。在血管生成药物研发过程中，使用包含适当细胞类型和适宜条件的体外检测系统，以真实反映生理性的血管生成过程，至关重要。为了克服目前主要依赖内皮细胞的体外血管生成检测系统的局限性，我们开发了一种三维（3D）共培养球体出芽检测系统。该共培养球体由两种人源血管前体细胞——内皮集落形成细胞（ECFCs）和间充质干细胞（MSCs）以5:1的比例共同形成。将ECFCs+MSCs球体嵌入I型胶原基质中，以模拟体内细胞外环境。利用实时细胞记录仪连续观察球体血管出芽过程达24小时。同时应用活细胞荧光标记技术，追踪出芽形成过程中每种细胞类型的定位。通过统计出芽数量并测量单个球体产生的出芽总长度，对血管生成潜能进行定量分析。每个实验组随机选取五个球体进行分析。对比实验表明，与仅含ECFCs的球体相比，ECFCs+MSCs球体具有更多的出芽数量和更长的出芽总长度。为进一步验证该新型共培养球体检测系统在抗血管生成药物筛选中的应用潜力，我们测试了美国食品药品监督管理局（FDA）批准的血管生成抑制剂贝伐珠单抗。结果显示，与仅含ECFCs的球体相比，ECFCs+MSCs球体测得的IC₅₀值更接近于异种移植肿瘤小鼠模型中获得的贝伐珠单抗有效血浆浓度。本研究表明，3D ECFCs+MSCs球体血管生成检测系统更贴近生理性血管生成过程，可在动物实验之前预测药物的有效血浆浓度。

引言

全球约有5亿人有望从针对血管畸形相关疾病（如类风湿性关节炎、眼病、心血管疾病和肿瘤转移）的血管生成调节治疗中受益¹。因此，开发调控血管生成的药物已成为制药行业的重要研究领域。在药物研发过程中，体内动物实验对于探索候选药物对生理功能的影响以及器官间的系统性相互作用至关重要。然而，伦理和成本问题使得人们对动物实验的担忧日益增加²。因此，亟需改进体外检测系统，以在开展动物实验前获得更准确、更具预测性的数据，从而支持更科学的决策。目前的体外血管生成检测通常通过在二维（2D）培养板中接种内皮细胞（ECs），来评估细胞的增殖、侵袭、迁移或管状结构形成能力³。这些2D血管生成检测方法快速、简便、可定量且成本较低，已显著推动了血管生成调节药物的发现。然而，仍存在若干问题有待改进。

此类二维体外检测系统无法反映在体内生理条件下发生的血管生成的复杂多步骤过程，导致结果不准确，从而引起体外检测数据与临床试验结果之间的差异⁴。二维培养条件还会诱导细胞表型的改变。例如，在二维培养板中增殖后，内皮细胞（ECs）表现出较弱的细胞表型，表现为CD34及多种调控细胞反应的信号分子表达下调^5,6。为了克服基....

方案

人ECFCs按照先前报道的方法从人外周血中分离获得²⁷。简言之，使用Ficoll-Paque Plus从全血中分离单个核细胞层，并在适当的培养基中培养，直至出现内皮样集落。收集集落后，使用CD31包被的磁珠分离ECFCs。MSCs从成人骨髓来源的贴壁单个核细胞（MNC）组分中分离获得。本研究方案经德成女子大学机构审查委员会批准（IRB编号：2017-002-01）。

1. 细胞培养

1. 准备内皮集落形成细胞（ECFCs）和间充质干细胞（MSCs）培养基并包被培养板
   1. 制备内皮细胞生长培养基MV2（ECGM-MV2，不含氢化可的松），添加10%胎牛血清（FBS）和1%谷氨酰胺-青霉素-链霉素（GPS）。
   2. 制备含10% FBS和1% GPS的间充质干细胞生长培养基-2（MSCGM-2）。
   3. 对于ECFC培养，使用1%明胶溶液包被细胞培养板。配制1%明胶溶液时，将1 g明胶粉末溶于500 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，磁力搅拌器搅拌溶解后，高压灭菌。可使用3 mL/60 mm、5 mL/100 mm或15 mL/150 mm的1%明胶溶液进行包被。将包被后的培养板置于细胞培养箱中（37 °C和5% CO₂）孵育15分钟。随后吸除残留的1%明胶溶液，并用PBS洗涤包被板一次。
   ....

结果

通过使用单培养类球体（仅ECFCs）和共培养类球体（ECFCs+MSCs）进行比较实验，以检测MSCs是否在ECFCs介导的血管生成过程中发挥重要作用。采用实时细胞记录仪对每个类球体的出芽形成情况进行为期24小时的监测，以捕捉类球体血管生成出芽的动态过程。血管生成潜能通过统计每个类球体产生的出芽数量并测量其总出芽长度进行量化。每组实验随机选取五个类球体进行分析。在所有时间点，ECFCs+MSCs类球体的出芽数量和总出芽长度均显著高于仅含ECFCs的类球体（图1A-C）。ECFCs+MSCs类球体的出芽数量和长度在12小时内持续增加，而仅含ECFCs的类球体在6小时后出芽数量和长度不再增加（图1B,C）。此外，无论是否接受VEGF处理，ECFCs+MSCs类球体形成的出芽均比仅含ECFCs的类球体更粗壮且更持久（图1A 和 补充视频 1A,B,D.......

讨论

本研究介绍了一种改进的体外血管生成检测体系，该体系利用两种人血管细胞前体细胞——内皮集落形成细胞（ECFCs）和间充质干细胞（MSCs）共同培养形成的球体。这种共培养球体系统能够模拟体内血管出芽的形成过程，该过程由内皮细胞与周细胞之间的相互作用和整合所介导。与其他仅反映内皮细胞介导的血管生成的体外检测方法相比，该共培养检测体系更能代表生理状态下血管生成的多步骤级联过程，包括细胞间相互作用、出芽、管状结构形成以及血管成熟。新建立的该检测体系还通过将球体接种于I型胶原凝胶中，模拟了体内的细胞外微环境。我们建议，这种三维共培养球体血管生成检测体系具有可靠性高、可重复性强、易于定量分析，且最重要的是具有较高的生理相关性。

进行共培养球体实验时，必须将球体嵌入含有适当浓度中和I型胶原蛋白和胎牛血清（FBS）的凝胶中。中和I型胶原蛋白的最佳终浓度为1.5 mg/mL，FBS的终浓度为2.5%。在预实验中发现，较高的胶原蛋白浓度会导致凝胶过硬，从而影响球体出芽的质量和数量；而较低的胶原蛋白浓度则产生过软且易碎的凝胶，无法维持球体的完整性。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶 EDTA (1x)	Gibco	25300-054
贝伐珠单抗	Roche	NA	商品名：Avastin
杜尔贝科改良伊格尔培养基	Gibco	11885-084	DMEM
杜尔贝科磷酸盐缓冲液 (10x)	Gibco	21600-010	PBS (10x)
杜尔贝科磷酸盐缓冲液 (1x)	Corning	21-031-CVR	PBS (1x)
内皮细胞生长培养基 MV2 试剂盒	Promocell	C-22121	ECGM-MV2
胎牛血清 (FBS)	Atlas	FP-0500A	FBS
明胶	BD Sciences	214340
L-谷氨酰胺–青霉素–链霉素	Gibco	10378-016	GPS
间充质干细胞生长培养基-2	Promocell	C-28009	MSCGM-2
甲基纤维素	Sigma-Aldrich	M0512
PKH26 荧光细胞连接试剂盒	Sigma-Aldrich	MINI26	PKH26
PKH67 荧光细胞连接试剂盒	Sigma-Aldrich	MINI67	PKH67
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	S5881
I型胶原凝胶	Corning	354236
血管内皮生长因子A	R&D	293-VE-010	VEGF