本文介绍了一种在已建立的主动脉缩窄小鼠模型中进行外科主动脉去绑扎的逐步操作方案。该手术不仅可用于研究左心室逆向重构和肥厚消退的潜在机制，还可用于测试可能加速心肌功能恢复的新型治疗策略。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
为了更好地理解左心室（LV）逆向重构（RR），我们描述了一种啮齿类动物模型，即在主动脉缩窄诱导的左心室重构后，通过解除主动脉缩窄使小鼠发生逆向重构。本文中，我们详细阐述了在小鼠中实施微创外科主动脉去缩窄手术的逐步操作流程。随后采用超声心动图评估左心室重构及逆向重构过程中心脏肥厚与功能障碍的程度，并据此确定最佳的主动脉去缩窄时机。在实验方案结束时，进行终末期血流动力学检测以评估心脏功能，并采集样本用于组织学研究。结果显示，去缩窄手术的术后存活率可达70–80%。此外，在去缩窄两周后，心室后负荷显著降低，触发心室肥厚（约减少20%）和纤维化（约减少26%）的消退，并通过左心室充盈压和舒张末期压力（E/e' 和 LVEDP）的正常化，实现舒张功能障碍的恢复。主动脉去缩窄是一种研究啮齿类动物左心室逆向重构的有效实验模型。不同个体间心肌恢复程度存在差异，从而模拟了临床情境下（如主动脉瓣置换术）所观察到的逆向重构多样性。我们总结认为，主动脉缩窄/去缩窄模型是揭示逆向重构机制（特别是心肌肥厚消退和舒张功能恢复）的重要工具。
引言
在小鼠中对横行或升主动脉进行缩窄是一种广泛使用的实验模型，用于研究压力超负荷诱导的心肌肥厚、舒张功能障碍和收缩功能障碍以及心力衰竭1,2,3,4。主动脉缩窄最初会引起代偿性左心室（LV）向心性肥厚，以使室壁应力恢复正常1。然而，在某些情况下，例如长期心脏超负荷，这种肥厚不足以降低室壁应力，从而引发舒张和收缩功能障碍（病理性肥厚）5。与此同时，细胞外基质（ECM）发生改变，导致胶原沉积和交联，这一过程称为纤维化，可进一步分为替代性纤维化和反应性纤维化。在大多数情况下，纤维化是不可逆的，并会影响超负荷解除后心肌功能的恢复6,7。然而，近期的心脏磁共振成像研究表明，反应性纤维化在长期过程中可能有所消退8。总体而言，纤维化、肥厚和心脏功能障碍共同构成了一种称为心肌重构的过程，该过程会迅速进展为心力衰竭（HF）。
了解心肌重构的特征已成为限制或逆转其进展的主要目标，后者被称为....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有动物实验均符合《实验动物护理和使用指南》（NIH 出版物编号 85–23，2011 年修订版）以及葡萄牙动物福利法（DL 129/92，DL 197/96；P 1131/97）。本实验方案已获得主管地方当局批准（编号 018833）。7 周龄雄性 C57B1/J6 小鼠饲养在合适的笼具中，环境保持 12/12 小时光照-黑暗循环，温度 22 °C，湿度 60%，可自由获取饮水和标准饲料。
1. 手术区域的准备
- 用70%酒精消毒手术部位，并在手术区域铺上一次性手术台布。
- 手术前对所有器械进行灭菌。
注意：本操作需要以下器械：显微外科剪刀、2把精细弯头镊子、3把精细直头镊子、手术刀、小镊子、角形解剖剪刀、持针器、超细结扎辅助工具、2把止血钳，最后强烈推荐使用磁性固定牵开系统（图1A）。 - 将26 G钝头针的尖端弯曲成90°，以便更方便地接近主动脉。26 G针可在主动脉上造成直径为0.45 mm的狭窄（图1B）。
- 将加热垫温度调节至37 ± 0.1 °C。
2. 小鼠准备与插管
- 将年轻的 C57B1/J6 ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
术后及远期生存率
缩窄术的围手术期存活率为80%，术后第一个月内的死亡率通常为 <20%。如前所述，去环手术的成功率在很大程度上取决于先前手术的侵入程度。经过学习曲线后，去环手术过程中的死亡率约为25%。该死亡率主要归因于手术过程中发生的死亡事件，包括主动脉或左心房破裂（在大鼠中，两种手术的存活率均较高）。
主动脉缩窄与心肌重塑
通过左心室收缩末期压力（LVESP）升高以及多普勒主动脉血流速度 >2.5 m/s 来验证主动脉缩窄手术的成功，后者根据改良伯努利方程对应于25 mmHg的压力阶差（图5）。与假手术小鼠相比，在术后7周内，缩窄导致左心室肥厚，表现为左心室质量增加（表1 和 图5），并伴有舒张功能受损，表现为充盈压升高（二尖瓣早期充盈峰值流速（E）与早期舒张期二尖瓣环速度（E'）的比值（E/e'）、左心室舒张末期压力（LVEDP）升高.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文提出的模型分别模拟了主动脉缩窄及去缩窄后左心室重构和心功能恢复的过程。因此，该模型是深入研究不良左心室重构相关分子机制以及验证可促进此类患者心肌功能恢复的新型治疗策略的理想实验模型。本方案详细阐述了如何采用一种微创且高度保守的外科技术，建立啮齿类动物主动脉缩窄及去缩窄的动物模型，以减少手术创伤。
该方案中最关键的步骤与主动脉缩窄术中的手术侵入程度有关。后续主动脉去缩窄手术的成功在很大程度上依赖于一种微创的缩窄操作，该操作应避免对主动脉周围组织造成损伤和纤维化，因此必须采用创伤更小的方法（表 2）。缝线内埋与更轻度的左心室肥厚和更好的心脏功能相关16（表 2），但也使得去缩窄操作在不引起主动脉破裂的情况下难以实施。在本研究中，我们尝试使用丝线，因为它在缩窄部位会产生更多的瘢痕组织，从而诱发更稳定的压力超负荷状态。然而，在我们的操作中，使用丝线时去缩窄手术更具挑战性，因为丝线为多股缝线，使其从主动脉上完全移除更加困难。尽管如此，这些问题属于技术性因素，具有显著的方案依.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
作者感谢葡萄牙科学技术基金会（FCT）、欧盟、国家战略参考框架（QREN）、欧洲区域发展基金（FEDER）以及竞争力操作计划（COMPETE）对UnIC（UID/IC/00051/2013）研究单位的资助。本项目获得FEDER通过COMPETE 2020——竞争力与国际化操作计划（POCI）的支持，以及由葡萄牙2020合作协议框架下北部葡萄牙地区运营计划（NORTE 2020）资助的DOCNET项目（NORTE-01-0145-FEDER-000003）的支持，并通过欧洲区域发展基金（ERDF）以及欧洲结构和投资基金支持的NETDIAMOND项目（POCI-01-0145-FEDER-016385）和里斯本地区2020运营计划获得资助。Daniela Miranda-Silva 和 Patrícia Rodrigues 由葡萄牙科学技术基金会（FCT）提供博士研究奖学金资助（编号分别为SFRH/BD/87556/2012 和 SFRH/BD/96026/2013）。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 吸收棒 | F.S.T | 18105-03 | 用于手术过程中吸收液体 |
| 刀片 | F.S.T | 10011-00 | 用于进行皮肤切口 |
| 布托啡诺 | Buprelieve | 镇痛药物 | |
| 电凝器 | F.S.T | 18010-00 | 用于防止失血过多 |
| 电凝器头端 | F.S.T | 18010-01 | 用于防止失血过多 |
| 棉签 | Johnson's | 用于手术过程中吸收液体 | |
| 脱毛膏 | Veet | 用于动物脱毛 | |
| 一次性手术台覆盖布 | MEDKINE | DYND4030SB | 用于覆盖手术区域 |
| 超声探头 | Siemens | Sequoia 15L8W | 超声信号采集 |
| 超声心动图仪 | Siemens | Acuson Sequoia C512 | 超声信号采集 |
| 呼气末 CO2 监测仪 | Kent Scientific | CapnoStat | 用于监测呼出气体饱和度 |
| 镊子 | F.S.T | 11255-20 | 用于分离组织和主动脉 |
| 镊子 | F.S.T | 11272-30 | 用于分离组织和主动脉 |
| 镊子 | F.S.T | 11151-10 | 用于分离组织和主动脉 |
| 镊子 | F.S.T | 11152-10 | 用于分离组织和主动脉 |
| 气体麻醉系统 | Penlon Sigma Delta | 用于麻醉和机械通气 | |
| 止血钳 | F.S.T | 13010-12 | 用于在收紧主动脉前固定缝线 |
| 止血钳 | F.S.T | 13011-12 | 用于在收紧主动脉前固定缝线 |
| 结扎辅助工具 | F.S.T | 18062-12 | 用于在主动脉周围放置缝线 |
| 磁性牵开器 | F.S.T | 18200-20 | 用于帮助动物保持正确体位 |
| 持针器 | F.S.T | 12503-15 | 用于缝合动物 |
| 26G 针头 | B-BRAUN | 4665457 | 用作主动脉缩窄直径的模具 |
| 氧气 | Air Liquide | 用于麻醉和机械通气 | |
| 聚丙烯缝线 | Vycril | W8304/W8597 | 用于动物缝合及进行缩窄操作 |
| 聚维酮碘溶液 | Betadine® | 皮肤消毒剂 | |
| PowerLab | Millar instruments | ML880 PowerLab 16/30 | PV 环信号采集 |
| 脉搏血氧仪 | Kent Scientific | MouseStat | 用于监测心率和血液氧饱和度 |
| PVAN 软件 | Millar Instruments | 用于分析血流动力学数据 | |
| PV 环导管 | Millar instruments | SPR-1035. 1.4 F | PV 环信号采集 |
| 牵开器 | F.S.T | 17000-01 | 用于更好地暴露主动脉视野 |
| 手术刀柄 | F.S.T | 10003-12 | 用于进行皮肤切口 |
| 剪刀 | F.S.T | 15070-08 | 用于去缩窄手术中剪断缝线 |
| 剪刀 | F.S.T | 14084-09 | 用于手术过程中剪切其他材料，例如缝线、纸张 |
| 七氟烷 | Baxter | 533-CA2L9117 | |
| 温度控制模块 | Kent Scientific | RightTemp | 用于控制动物体温 |
| 呼吸机 | Kent Scientific | PhysioSuite | 用于动物通气 |
| 水浴锅 | Thermo Scientific™ | TSGP02 | 用于维持适宜水温以加热 P-V 环导管 |
参考文献
- Arany, Z., et al. Transverse aortic constriction leads to accelerated heart failure in mice lacking PPAR-gamma coactivator 1alpha. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (26), 10086-10091 (2006).
- Tavakoli, R., Nemska, S., Jamshidi, P., Gassmann, M., Frossard, N.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
