本文介绍了一种通过成年小鼠小脑延髓池途径感染以诱导脑膜炎奈瑟菌性脑膜炎的方法。我们提供了一个从接种物制备到小脑延髓池感染的脑膜炎奈瑟菌感染逐步实验方案；随后记录动物存活情况，并评估小鼠组织中的细菌载量。
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本文内容
摘要
摘要
Neisseria meningitidis（脑膜炎奈瑟菌）是一种宿主范围狭窄的微生物，全球公认是细菌性脑膜炎的主要致病原因。脑膜炎奈瑟菌可短暂定植于约10%健康人群的鼻咽部。在特定情况下，该菌可获得侵袭能力，穿透黏膜屏障进入血液，引发败血症。在此类病例中，即使未继发脑膜炎，也可能出现暴发性败血症。相反，细菌在血液中增殖有限，但可穿越血脑屏障，侵入中枢神经系统，导致暴发性脑膜炎。细菌性脑膜炎的小鼠模型是研究宿主与病原体相互作用以及分析该致命疾病发病机制的有力工具。尽管过去几十年已评估了多种实验模型系统，但均未能成功再现脑膜炎球菌病的典型病理过程。在本实验方案中，我们详细描述了一种通过脑池内接种细菌在小鼠中诱导脑膜炎球菌性脑膜炎的方法。通过评估临床参数（如体温、体重）、生存率分析、微生物学检测以及脑组织损伤的组织学检查，在小鼠宿主中记录到了类似人类脑膜炎的特异性表现。采用脑池内（i.cist.）接种时，脑膜炎球菌可直接完全递送至小脑延髓池, 导致细菌在脑组织中高效复制。大约18小时内，活菌数量可增加1000倍。此外，在感染小鼠的脾脏和肝脏中也检测到脑膜炎球菌，提示肝脏可能是脑膜炎球菌复制的靶器官。
引言
Neisseria meningitidis 是一种仅存在于人类宿主中的革兰氏阴性β-变形菌，是全球人群中引起脑膜炎和败血症最常见的病原体之一。该菌可定植于健康且无症状携带者（占人群的2-30%）的上呼吸道（鼻腔和咽喉），但有时会逃逸宿主多种免疫防御机制，进入血液并扩散至脑部，引发不受控制的局部炎症，即脑膜炎球菌性脑膜炎。宿主因素与细菌因素的共同作用似乎促成了该菌从共生状态向侵袭性行为的转变1。
N. meningitidis 专门定植和感染人类，宿主范围狭窄，因此由于缺乏能够模拟人类脑膜炎球菌病的合适动物模型，其体内致病机制的研究受到限制。这导致人们对脑膜炎球菌引起败血症和脑膜炎的致病过程仍存在根本性的认知空白。近几十年来，多种体外系统的建立使得研究人员得以鉴定出若干脑膜炎球菌的毒力因子2,3,4。尽管这些重要的研究为理解这些因子在成功感染中的作用提供了关键线索，但这些模型无法评估细菌与体液免疫系统、细胞免疫系统乃至整个组织相互作用所产生的后果。体内感染动物模型对于评估疫苗制剂所提供的保护效力同样具有重要意义。作为一种嗜人病原体，脑膜炎球菌具备成功感染所需的各种适应性决定因子，例如表面结构（如IV型菌毛和不....
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方案
本方案的实施旨在尽量减少动物痛苦，并根据1986年11月24日欧洲共同体理事会指令（86/609/EEC）减少实验小鼠的使用数量。本研究中涉及的动物活体实验已获得动物伦理护理与使用委员会（批准编号2，2012年12月14日）和意大利卫生部（批准编号0000094-A-03/01/2013）的批准。所有操作均应在生物安全二级（BSL2）实验室的生物安全柜2级（BSC2）内进行，潜在感染性废弃物应丢弃至专用容器中。
1. 用C群N. meningitidis菌株感染小鼠
注意：N. meningitidis 可能是一种有害病原体，在处理该微生物时必须采取所有必要的预防措施。整个实验需要在生物安全二级（BSL2）条件下进行。参与动物实验的研究人员在实验期间应穿戴一次性个人防护装备（PPE）。
- 体内感染研究用细菌的制备
- 从新鲜的平板上挑取单个菌落 Neisseria meningitidis 在添加了1%（体积比）Polyvitox补充剂的GC（淋球菌）琼脂平板上培养，并接种于10 mL GC肉汤中。
- 在37 °C、220 rpm的恒温摇床中培养细菌。使用分光光度计定期检测菌液的O.D.值，将菌液培养至对数生长期早期，此时光密度OD
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结果
感染小鼠的存活情况 N. meningitidis 野生型及同基因型突变株
The 脑膜炎奈瑟菌 在这些代表性结果中使用的菌株为C群参考菌株93/4286（ET-37）及其等基因突变株93/4286ΩcssA 通过插入失活获得的 cssA 编码UDP-N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶的基因，位于荚膜合成位点25. 为评估毒力程度的 cssA-缺陷菌株在当前的小鼠模型中，能够导致50%感染动物死亡的致死剂量（LD50) 进行了评估。为此，将三组动物通过小脑延髓池内注射的方式，以不同剂量（范围从10）进行感染4 至 106 野生型菌株93/4286及突变株93/4286Ω不同剂量的CFUcssA 10 之间7 至 109 CFU。通常，临床参数（如体重和体温）的降低以及死亡率的升高发生在感染后的前72小时内。LD50 对.......
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讨论
本研究中，我们描述了一种通过脑池内注射（i.cist.）脑膜炎奈瑟菌在成年小鼠中诱导脑膜炎球菌性脑膜炎的实验方案。据我们所知，目前尚未有其他通过脑池内途径感染脑膜炎球菌建立的小鼠脑膜炎模型；过去，该方法曾被用于建立大鼠31和兔32的脑膜炎球菌性脑膜炎模型。众所周知，脑膜炎球菌性疾病发病率最高的群体为幼儿、青少年和年轻成年人33,34,35；因此，在本脑膜炎小鼠模型中，我们未采用新生或幼年动物，而是使用了8周龄的免疫功能健全的小鼠。
在我们的实验模型中，我们选择使用小脑延髓池（i.cist.）接种途径，因为该方法可确保将脑膜炎奈瑟菌直接释放到小脑延髓池（cisterna magna）中，从而促进细菌在脑脊液（CSF）中的复制。与已用于链球菌属（Streptococcus spp........
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究部分得到了PRIN 2012 [资助编号 2012WJSX8K]：“黏膜感染中宿主-微生物相互作用模型：新型治疗策略的开发”以及PRIN 2017 [2017SFBFER]：“综合方法应对适应性、应激条件与难治性病原体耐药性之间相互作用”的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 带外螺纹的1,8裙边冷冻管 | Starlab | E3090-6222 | |
| 50 mL聚丙烯锥形管 | Falcon | 352070 | 30 mm x 115 mm |
| 阿德森镊子 | F.S.T. | 11006-12 | 不锈钢 |
| 报警温度计 | TESTO | 9000530 | |
| BactoTM蛋白胨 | BD | 211693 | |
| BD Micro Fine胰岛素注射器 | BD | 320837 | U-100 胰岛素 |
| BD Plastipak 1 mL 25 G 5/8英寸注射器 | BD | 300014 | 05 mm x 16 mm |
| BD Plastipak 5 mL注射器 | BD | 308062 | 07 mm x 30 mm |
| BIOHAZARD AURA B 垂直层流生物安全柜 | Bio Air s.c.r.l. | Aura B3 | |
| 分光光度计 | Eppendorf | 型号 #6131 | |
| D型瓶 | Tecniplast | D | 刻度至：400 mL，总体积450 mL，72 mm x 72 mm x 122 mm |
| C150 CO2 培养箱 | Binder | 9040-0078 | |
| 欧洲标准II型笼体 | Tecniplast | 1264C | 267 x 207 x 140 mm3，底面积370 cm2 |
| 带盖细胞培养培养皿 | Thermo Scientific | 150288 | 工作体积：5 mL |
| 离心机 | Eppendorf | Microcentrifuge 5415R | |
| 半微量比色皿（L型） | Kartell S.p.A. | 01938-00 | |
| 三水合二氢磷酸氢二钾 | Carlo erba | 471767 | |
| 无水磷酸氢二钠 ACS分析纯 | Carlo Erba | 480141 | g1000 |
| 标准饲料认证 | Mucedola s.r.l. | 4RF21 | 动物饲料颗粒 |
| Dumont Hp 5号不锈钢镊子 | F.S.T. by DUMONT | AGT5034 | 0.10 x 0.06 mm2 尖端 |
| 电子天平 | Gibertini | EU-C1200 | 最大称量1200 g，d = 0.01 g，T = -1200 g |
| Eppendorf Safe-Lock微量离心管 | Eppendorf | T3545-1000EA | |
| 红霉素 | Sigma-Aldrich | E-6376 | 25 g |
| 超细邦剪 | F.S.T. | 14084-08 | 不锈钢 |
| 滤膜顶盖（迷你隔离器），H-Temp带锁紧夹 | Tecniplast | 1264C400SUC | |
| GC琼脂基础培养基 | OXOID | CM0367 | |
| Gillies镊子 1×2齿 | F.S.T. | 11028-15 | 不锈钢 |
| 甘油 RPE | Carlo Erba | 453752 | 1 L |
| Graefe镊子 | F.S.T. | 11052-10 | 锯齿尖端宽度：0.8 mm |
| 内盖 | Tecniplast | 1264C116 | |
| 右旋糖酐铁溶液 | Sigma-Aldrich | D8517-25ML | |
| 氯胺酮 | Intervet | ||
| 微生物安全柜 BH-EN 和 BHG II级 | Faster | BH-EN 2004 | |
| 1.5 mL微量离心管 | BRAND | PP780751 | 聚丙烯螺口盖，带刻度 |
| 小鼠操作镊 | F.S.T. | 11035-20 | 带锯齿橡胶；夹持面：15 mm x 20 mm |
| Mucotit-F2000 | MERZ | 61846 | 2000 mL |
| 天然乳胶手套 | Medica | M101 | |
| New Brunswick Classic C24恒温摇床 | PBI international | C-24 Classic Benchtop Incubator Shaker | |
| PS培养皿 | VWR | 391-0453 | 90 x 14.2 mm2 |
| Pipetman Classic P20移液器 | Gilson | F123600 | 2–20 μL |
| Pipetman Classic P200移液器 | Gilson | F123601 | 20–200 μL |
| Pipetman Classim P1000移液器 | Gilson | F123602 | 200–1,000 μL |
| Polyvitox | OXOID | SR0090A | |
| 氯化钾 | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0208 | 250 g |
| 磷酸二氢钾 | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0240 | 1 kg |
| 一次性PS镊子 | VWR | 232-0191 | |
| 可拆分隔板 | Tecniplast | 1264C812 | |
| 圆底聚丙烯管 | Falcon | 352063 | 5 mL |
| 氯化钠 | MOLEKULA | 41272436 | |
| 不锈钢固定环和聚酯滤膜片 | Tecniplast | 1264C | |
| 标准型镊子 | F.S.T. | 11000-12 | 不锈钢 |
| Stevens肌腱剪 | F.S.T. | 14066-11 | 不锈钢 |
| 外科剪 - ToughCut | F.S.T. | 14130-17 | 不锈钢 |
| Touch N Tuff一次性丁腈手套 | Ansell | 92-500 | |
| 超低温（ULT）冰箱 | Haier | DW-86L288 | 容积 = 288 L |
| Wagner剪 | F.S.T. | 14070-12 | 不锈钢 |
| 赛拉嗪 | Intervet |
参考文献
- van Deuren, M., Brandtzaeg, P., van der Meer, J. W. Update on meningococcal disease with emphasis on pathogenesis and clinical management. Clinical Microbiology Reviews. 13, 144-166 (2000).
- Colicchio, R., et al.
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