在本实验方案中，将淋巴细胞置于跨膜迁移系统的上室，上室与下室之间由多孔膜隔开。在下室中加入趋化因子，以诱导淋巴细胞沿趋化因子浓度梯度进行主动迁移。48小时后，分别计数两个室中的淋巴细胞，以定量分析跨膜迁移情况。
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本文内容
摘要
摘要
本文介绍了一种高效的方法，仅需基础的实验技能和材料，即可在离体跨膜迁移系统中评估淋巴细胞的趋化运动。2型固有淋巴细胞（ILC2）和CD4+ 从经鸡卵清蛋白（OVA）激发的 BALB/c 小鼠脾脏和肺组织中分离出辅助性 T 细胞。我们证实了 CCR4 在 CD4+ T细胞与ILC2的比较。CCL17和CCL22是CCR4的已知配体；因此，利用该离体跨膜迁移方法，我们检测了CCL17- CCL22诱导的CCR4细胞迁移+ 淋巴细胞。为了建立趋化因子梯度，将CCL17和CCL22置于跨膜迁移系统的下室中。分离的淋巴细胞随后被加入上室，在48小时期间，淋巴细胞主动通过3 µm孔径向位于下室的趋化因子迁移。该系统可用于有效评估淋巴细胞的趋化动力学，但显然无法完全模拟体内器官微环境的复杂性。这是该方法的一个局限性，可通过结合对目标器官和淋巴细胞的原位成像技术加以克服。相比之下，该方法的优势在于可由初级技术人员操作，且成本远低于活体成像。随着能够增强迁移（例如促进肿瘤浸润性细胞毒性免疫细胞迁移）或抑制迁移（例如在存在免疫病理损伤风险的自身免疫性疾病中）的治疗化合物不断出现，该方法可作为筛选工具使用。通常情况下，若目标趋化因子诱导的趋化动力学水平持续显著高于培养基对照组，则表明该方法有效；在此基础上，亦可进一步确定特定化合物对迁移的抑制或增强程度。
引言
这种最初的跨膜迁移方法由 Stephen Boyden 于 1962 年在《实验医学杂志》（Journal of Experimental Medicine）中首次提出1。若无 Boyden 小室的发展，我们对趋化性与趋化动力学的许多认知将无法实现。在 1977 年首个趋化因子被发现之前，体外跨膜迁移系统已被用于研究能够抑制巨噬细胞运动同时增强中性粒细胞细胞运动性的血清因子1,2。目前，关于免疫细胞迁移的知识已极大丰富，迄今为止已发现 47 种趋化因子及 19 种相应受体3,4。此外，大量针对这些趋化因子通路的抑制剂或增强剂已被开发用于治疗目的5,6,7,8。其中许多化合物已在类似的跨膜迁移小室中进行测试，以研究这些化合物与免疫细胞对特定趋化因子反应性之间的直接相互作用9。
迁移....
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方案
本文所述所有方法均经内布拉斯加医学中心大学（UNMC）和犹他大学的机构动物护理与使用委员会审查并批准。
1. 试剂的配制与准备
- 配制完全 RPMI（Roswell Park Memorial Institute）培养基。
- 将 10 mL 热灭活的胎牛血清（FBS）加入 90 mL RPMI 中。
- 向 100 mL 含 10% FBS 的 RPMI 培养基中加入 1 mL 100 倍浓度的青霉素-链霉素-谷氨酰胺（Penicillin-Streptomycin-Glutamine）。
- 配制 ILC2 扩增培养基。
- 向 10 mL 完全 RPMI 培养基中加入 IL-2 和 IL-33（每种细胞因子终浓度为 20 ng/mL）。
- 若储备液浓度为 10 µg/mL，则用移液器吸取 20 µL IL-2 和 20 µL IL-33，加入含有 10 mL 完全 RPMI 培养基的 15 mL 离心管中。
- 配制肺组织解离培养基。
- 将 50 mg I 型胶原酶（type 1 collagenase）加入 250 mL 无添加物的 RPMI 培养基中。
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结果
CD4+ T 细胞和 ILC2 上的 CCR4 表达。
为了确保体外迁移实验的成功，必须确定淋巴细胞是否通过 CCR4 对 CCL17 和 CCL22 产生应答；因此，我们通过流式细胞术检测了 CD4+ T 细胞和 ILC2 上 CCR4 的表达情况。尽管已知卵清蛋白特异性的 CD4+ 辅助性 T 细胞表达 CCR4，但关于 ILC2 是否表达 CCR4 的研究尚少。图 1 展示了来自雄性和雌性 OVA 激发的 BALB/c 小鼠的 CD4+ T 细胞（图 1A,C）与 ILC2（图 1B,D）中 CCR4 表达的代表性结果。采用与别藻蓝蛋白（APC）偶联的单克隆抗体，通过流式细胞术检测 CCR4 的表达。通过单因素方差分析（One-Way.......
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讨论
本文介绍了一种成熟的体外跨膜迁移系统，用于评估趋化因子诱导的淋巴细胞迁移。该实验方案包含多个关键步骤，首要步骤是验证实验中所用免疫细胞是否正确表达相应的趋化因子受体。在本研究中，我们选择CCR4，原因在于已有大量文献表明CCR4在Th2辅助性T细胞介导的过敏性炎症中具有重要作用。既往研究表明，卵清蛋白诱导的炎症可被至少两种CCR4拮抗剂所抑制24,25；然而，这些研究均在2型固有淋巴细胞（ILC2）被发现之前完成26,27。我们获得了新的数据，显示ILC2细胞表达的CCR4水平高于CD4+ T细胞，并且这些细胞对CCL22具有持续的应答能力。
在本实验方案中，第二个关键步骤是确保细胞在开始迁移实验前，始终处于最佳培养基中进行培养。以ILC2为例，我们必须将这些细胞培养在含有IL-2和IL-33的ILC2扩增培养基中。文献报道，I.......
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披露
作者无任何财务披露或利益冲突需要声明。
致谢
本工作由美国肺脏协会（K.J.W.）、授予T.A.W.和K.J.W.的纪念Eugene Kenney基金、犹他大学为K.J.W.提供的慷慨启动资金，以及美国退伍军人事务部对T.A.W.的资助（VA I01BX0003635）提供支持。T.A.W.获得了美国退伍军人事务部的研究职业科学家奖（IK6 BX003781）。作者谨此感谢Lisa Chudomelka女士提供的编辑协助。作者感谢内布拉斯加医学中心大学流式细胞术核心实验室在本论文所生成的流式细胞术数据采集过程中提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.4% 台盼蓝 | Sigma-Aldrich | 15250061 | |
| 1 mL 注射器 | BD生物科学 | 329424 | U-100 注射器 Micro-Fine 28 G 1/2" 1 cc |
| 100倍青霉素-链霉素，L-谷氨酰胺 | Gibco | 10378-016 | 用RPMI培养基稀释至1倍浓度 |
| 15 mL 圆锥形离心管 | 奥林巴斯塑料公司 | 28-101 | 聚丙烯管 |
| 3 μm transwell 插件 | Genesee Scientific | 25-288 | 含12个Transwell小室的24孔板 |
| 3x 稳定性固定剂 | BD Pharmigen | 338036 | 根据制造商说明书配制1x溶液 |
| 5 mL 聚苯乙烯管 | 干细胞技术 | 38007 | |
| 50 mL 离心管 | 奥林巴斯塑料公司 | 28-106 | 聚丙烯管 |
| 8孔简易分离磁铁 | 干细胞技术 | 18103 | |
| ACK裂解缓冲液 | Life Technologies Corporation | A1049201 | |
| 高级细胞筛，40 μm | Genesee Scientific | 25-375 | 尼龙网，40 μm 细胞筛 |
| 氢氧化铝，试剂级 | Sigma-Aldrich | 239186-25G | 20 mg/mL |
| 抗小鼠 CCR4；APC 标记 | Biolegend | 131211 | 0.5 μg/测试 |
| 抗小鼠 CD11b | BD Pharmigen | 557396 | 0.5 μg/test |
| 抗小鼠 CD11c；PE eFluor 610 | 赛默飞世尔科技 | 61-0114-82 | 0.25 μg/测试 |
| 抗小鼠 CD16/32，Fc 封闭 | BD Pharmigen | 553141 | 0.5 μg/测试 |
| 抗小鼠 CD19；APC-eFluor 780 标记 | 赛默飞世尔科技 | 47-0193-82 | 0.5 μg/测试 |
| 抗小鼠 CD3；PE Cy7 标记 | BD Pharmigen | 552774 | 0.25 μg/测试 |
| 抗小鼠 CD45；PE 偶联 | BD Pharmigen | 56087 | 0.5 μg/测试 |
| 抗小鼠 ICOS（CD278） | BD Pharmigen | 564070 | 0.5 μg/test |
| 抗小鼠 NK1.1（CD161）；FITC 标记 | BD Pharmigen | 553164 | 0.25 μg/test |
| 抗小鼠ST2（IL-33R）；PerCP Cy5.5标记 | Biolegend | 145311 | 0.5 μg/测试 |
| 自动细胞计数仪 | BIORAD | 1450102 | |
| 自动解离仪 | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| 牛血清白蛋白，冻干粉 | Sigma-Aldrich | A2153-10G | 无血清RPMI中的0.5% |
| 细胞计数仪 Clides | BIORAD | 1450015 | |
| 鸡卵清蛋白，V级 | Sigma-Aldrich | A5503-10G | 500 μg/mL |
| 胶原酶 1 型，过滤 | 沃辛顿生化公司 | CLSS-1，购买规格为5瓶×50 mg（货号LS004216） | 25 U/mL，RPMI |
| 补偿微珠 | Affymetrix | 01-1111-41 | 每对照管1滴 |
| 解离管 | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-335 | |
| FACS 缓冲液 | BD Pharmigen | 554657 | 1× PBS + 2% FBS，含叠氮化钠；4 ℃保存 °C |
| 热灭活胎牛血清 | Genesee Scientific | 25-525H | 10% 完全RPMI培养基 & ILC2 扩增培养基 |
| 小鼠CCL17 | GenScript | Z02954-20 | 50 ng/mL |
| 小鼠 CCL22 | GenScript | Z02856-20 | 50 ng/mL |
| 小鼠 CD4+ T细胞富集试剂盒 | 干细胞技术 | 19852 | |
| 小鼠 IL-2 | GenScript | Z02764-20 | 20 ng/mL |
| 小鼠ILC2富集试剂盒 | 干细胞技术 | 19842 | |
| 小鼠重组IL-33 | 干细胞技术 | 78044 | 20 ng/mL |
| RPMI | Life Technologies Corporation | 22400071 | |
| 分离缓冲液 | 干细胞技术 | 20144 | 1x PBS + 2% FBS；4℃保存 °C |
| 小型动物雾化器与雾化舱 | Data Sciences International | ||
| 无菌生理盐水 | Baxter | 2F7124；NDC 0338-0048-04 | 0.9% 氯化钠 |
参考文献
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Moser, B. Editorial: History of Chemoattractant Research. Frontiers in Imm....
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重印与许可
