本方案描述了一种用于纯化重组无标签钙结合蛋白S100A12及其离子诱导寡聚体的方法，以用于人单核细胞刺激实验。
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摘要
摘要
本方案描述了一种从大肠杆菌（Escherichia coli）培养物中纯化人钙结合蛋白 S100A12 及其离子诱导寡聚体并用于免疫细胞刺激的方法。该方案基于两步层析策略，包括在阴离子交换层析柱上进行蛋白质的初步纯化，随后在疏水相互作用层析柱上进行精细纯化。该策略可在可控成本下获得高纯度和高得率的 S100A12 蛋白。由于功能实验中免疫细胞对内毒素残留极为敏感，因此必须严格监测最终产物中的内毒素污染，并采取进一步清洁步骤以获得无内毒素蛋白。大部分内毒素污染可通过阴离子交换层析去除。为清除残留污染物，本方案还描述了使用离心过滤器进行去除的步骤。根据所处离子强度的不同，S100A12 可形成多种同源多聚体。为研究其结构与功能之间的关系，本方案进一步描述了对 S100A12 蛋白进行离子处理，继而采用化学交联法稳定其寡聚体结构，并通过尺寸排阻层析实现寡聚体的分离。最后，我们介绍了一种基于细胞的检测方法，用于验证纯化蛋白的生物学活性，并确认制备物中不含脂多糖（LPS）。
引言
S100A12 是一种钙结合蛋白，主要由人粒细胞产生。在（系统性）炎症期间，该蛋白表达上调，其血清水平尤其可用于评估系统性幼年特发性关节炎（sJIA）、家族性地中海热（FMF）或川崎病（KD）等（自身）炎症性疾病的疾病活动度及对治疗的反应。根据模式识别受体（PRRs）（如Toll样受体（TLRs））的不同，固有免疫系统可被病原体相关分子模式（PAMPs）（如脂多糖（LPS））或损伤相关分子模式（DAMPs；也称为“警报素”）所激活。DAMPs 是内源性分子，例如细胞蛋白、脂质或核酸1。钙卫蛋白家族成员 S100A8/A9 和 S100A12 的 DAMP 功能已有充分描述2，这些蛋白还被报道可作为二价金属离子螯合的抗菌肽发挥作用3,4,5,6。与其他 S100 家族成员类似，S100A12 可根据可用的离子强度形成不同的同源多聚体，而 S100A12 寡聚化对 PRR 相互作用（特别是 TLR4）的影响在最近之前尚不清楚。
该蛋白的单体形式（92个氨基酸，10.2 kDa）由两个通过柔性连接区相连的EF-手型螺旋-环-螺旋结构组....
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方案
注意：缓冲液和储备溶液的配制请参见补充表1。
1. 蛋白质表达在 E. coli
- 克隆
- 将无标签的人源 S100A12（NCBI 参考序列：NP_005612.1）克隆至原核表达载体 pET11b 中。将构建好的质粒转化至大肠杆菌 E. coli BL21(DE3) 中以进行蛋白表达。
- 培养
- 取单菌落接种于含 100 µg/mL 氨苄青霉素的 5 mL 生长培养基（LB 液体培养基）中，置于 14 mL 圆底试管中，37 °C、220 rpm 振荡培养过夜。将 2−4 mL 过夜培养物转接至 2 L 锥形瓶中的 400 mL 生长培养基中，37 °C、220 rpm 振荡培养。
注意：主培养物的初始密度应为 600 nm 处光密度（OD600）= 0.1。 - 在培养过程中监测 OD600。当 OD600 达到 0.5−0.6 时，加入 1 M 异丙基-ß-D-硫代半乳糖苷（IPTG），使其终浓度为 1 mM，以诱导蛋白表达。继续在 37 °C、220 rp....
- 取单菌落接种于含 100 µg/mL 氨苄青霉素的 5 mL 生长培养基（LB 液体培养基）中，置于 14 mL 圆底试管中，37 °C、220 rpm 振荡培养过夜。将 2−4 mL 过夜培养物转接至 2 L 锥形瓶中的 400 mL 生长培养基中，37 °C、220 rpm 振荡培养。
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结果
经过阴离子交换柱（AIEX）预纯化（图1A-C）以及随后的钙离子依赖性疏水相互作用层析（HIC）（图2A,B）后，获得了高纯度的蛋白（图2C）。此外，内毒素检测结果显示脂多糖（LPS）被成功去除。AIEX步骤后的LPS含量在1:10稀释条件下高于检测限，即高于500 EU/mL。经过50 kDa滤膜的第一次过滤后，LPS含量降低至1 EU/mL。随后使用3 kDa滤膜进行浓缩，并再次通过50 kDa滤膜过滤，最终测得的LPS污染水平为0.08 EU/mL。
作为额外对照，用人源野生型蛋白刺激人单核细胞（图3A,B）。多粘菌素B处理可消除脂多糖（LPS）刺激单核细胞所引起的TNFα释放，但对S100A12无此作用。另一方面，对LPS和S100A12.......
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讨论
在本方案中，我们描述了人源S100A12蛋白的无标签细菌表达、纯化，以及分离为不同离子诱导的寡聚体以用于免疫细胞刺激。与已发表的关于S100A12蛋白纯化的文献相比8,23,24，高浓度CaCl₂的使用2 据我们所知，使用25 mM CaCl₂进行疏水相互作用层析的方法是独特的。尽管已有若干采用1至5 mM浓度的方案能够获得纯化的蛋白质，但我们采用25 mM CaCl₂的策略所获得的蛋白产量显著更高。2 相反，这可能归因于蛋白质与柱材料相互作用的层级关系：S100A12 能够直接与柱材料结合，但过量的 Ca2+ 也可能促进S100A12二聚体与已结合在层析柱上的蛋白质之间的间接结合8因此，高 Ca2+ 浓度可能扩大可用于S100A12纯化的表面。疏水相互作用色谱（HIC）中S100A12的洗脱（采用线性梯度）呈现一个早.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究获得了明斯特大学医学院院内创新医学研究项目（Muenster University medical faculty intramural innovative medical research program，项目编号 KE121201，授予 C.K.）和德国研究基金会（DFG，项目编号 Fo354/3-1，授予 D.F.）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| pET11b 载体 | Novagen | ||
| BL21(DE3) 感受态 E. coli | 新英格兰生物实验室（New England Biolabs） | C2527 | |
| 100 倍非必需氨基酸 | 默克（Merck） | K 0293 | |
| 25% 盐酸 | 卡尔·罗斯（Carl Roth） | X897.1 | |
| 4−20% Mini-PROTEAN TGX 蛋白凝胶 | 伯乐（BioRad） | 4561093 | |
| 氨苄青霉素钠盐 | 卡尔·罗斯（Carl Roth） | HP62.1 | |
| BS3（双（磺基琥珀酰亚胺基）辛二酸酯）- 50 mg | 赛默飞世尔科技（ThermoFisher Scientific） | 21580 | |
| 氯化钙二水合物 | 卡尔·罗斯（Carl Roth） | 5239.1 | |
| 考马斯亮蓝 R250 脱色液 | 伯乐（BioRad） | 1610438 | |
| 考马斯亮蓝 R250 染色液 | 伯乐（BioRad） | 1610436 | |
| EasySep 人单核细胞富集试剂盒 | Stemcell | 19059 | 磁性阴性细胞分离试剂盒 |
| 乙二胺四乙酸二钠盐二水合物 | 卡尔·罗斯（Carl Roth） | 8043.1 | |
| EGTA | 卡尔·罗斯（Carl Roth） | 3054.3 | |
| EndoLISA | Hyglos | 609033 | 内毒素检测试剂盒 |
| 无内毒素超纯水 | 西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich） | TMS-011-A | 用于配制无内毒素缓冲液的超纯水 |
| EndoTrap red | Hyglos | 321063 | 内毒素去除树脂 |
| FBS（热灭活） | 吉布科（Gibco） | 10270 | |
| HBSS，无钙，无镁 | 赛默飞世尔科技（ThermoFisher Scientific） | 14175053 | |
| Hepes | 卡尔·罗斯（Carl Roth） | 9105 | |
| Hepes（高纯度，经内毒素检测） | 西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich） | H4034 | |
| 人 TNF-α - OptEia ELISA 试剂盒 | BD | 555212 | |
| IPTG（异丙基-ß-D-硫代半乳糖吡喃糖苷） | 卡尔·罗斯（Carl Roth） | CN08.1 | |
| L-谷氨酰胺（200 mM） | 默克（Merck） | K 0282 | |
| LB 培养基 | 卡尔·罗斯（Carl Roth） | X968.1 | |
| 来自 E. coli O55:B5 的脂多糖 | 默克（Merck） | L6529 | |
| Pancoll，人源 | PAN Biotech | P04-60500 | 分离液（密度梯度离心） |
| 青霉素/链霉素（10,000 U/mL） | 默克（Merck） | A 2212 | |
| 苯基 Sepharose 高性能树脂 | GE 医疗（GE Healthcare） | 17-1082-01 | 疏水相互作用层析用树脂 |
| 多粘菌素 B | Invivogen | tlrl-pmb | |
| 蛋白酶抑制剂片剂 | 罗氏（Roche） | 11873580001 | |
| Q Sepharose 快速流树脂 | GE 医疗（GE Healthcare） | 17-0510-01 | 阴离子交换层析用树脂 |
| RoboSep 缓冲液 | Stemcell | 20104 | 细胞分离缓冲液（第 5.1.4 节） |
| RPMI 1640 培养基 | 默克（Merck） | F 1215 | |
| 氯化钠（NaCl） | 卡尔·罗斯（Carl Roth） | 3957.2 | |
| 氢氧化钠 | 卡尔·罗斯（Carl Roth） | P031.1 | |
| Tris 碱 | 卡尔·罗斯（Carl Roth） | 4855.3 | |
| 氯化锌 | 卡尔·罗斯（Carl Roth） | T887 | |
| 实验耗材 | |||
| 0.45 µm 注射器滤器 | 默克（Merck） | SLHA033SS | |
| 14 mL 圆底管 | BD | 352059 | |
| 2 L 锥形瓶 | 卡尔·罗斯（Carl Roth） | LY98.1 | |
| 24 孔悬浮培养板 | Greiner | 662102 | |
| 5 L 量杯 | 卡尔·罗斯（Carl Roth） | CKN3.1 | |
| 50 mL 圆锥形离心管 | 康宁（Corning） | 430829 | |
| 50 mL 高速离心管 | 艾本德（Eppendorf） | 3,01,22,178 | |
| Amicon Ultra-15 离心过滤单元，截留分子量 3 kDa | 默克（Merck） | UFC900324 | |
| Amicon Ultra-15 离心过滤单元，截留分子量 50 kDa | 默克（Merck） | UFC905024 | |
| 培养皿（100 mm） | Sarstedt | 83.3902 | |
| 透析袋夹 | Spectrum | 132738 | |
| EasySep 磁力架“Big Easy” | Stemcell | 18001 | |
| 组分收集管（5 mL） | Greiner | 115101 | |
| Lumox 膜，25 µm，305 mm × 40 m | Sarstedt | 94,60,77,316 | 单核细胞培养板用膜 |
| Spectra/Por 透析膜（3.5 kDa） | Spectrum | 132724 | |
| Steritop 滤器单元 | 默克（Merck） | SCGPT01RE | |
| 仪器设备 | |||
| 37 °C 摇床培养箱 | New Brunswick Scientific | Innova 42 | |
| ÄKTA purifier UPC 10 | GE 医疗（GE Healthcare） | FPLC 系统 | |
| 组分收集器 | GE 医疗（GE Healthcare） | Frac-920 | |
| 离心机（配备 A-4-81 转子） | 艾本德（Eppendorf） | 5810R | |
| 固定角转子 | 艾本德（Eppendorf） | F-34-6-38 | |
| Mini Protean Tetra 电泳槽 | 伯乐（BioRad） | 1658000EDU | |
| NanoPhotometer | Implen | P330 | |
| 超声破碎仪 | Brandelin | UW2070 | |
| 荧光读板仪 | Tecan | infinite M200PRO | |
| pH 计 | Knick | 765 |
参考文献
- Liston, A., Masters, S. L. Homeostasis-altering molecular processes as mechanisms of inflammasome activation. Nature Reviews Immunology. 17 (3), 208-214 (2017).
- Kessel, C., Holzinger, D., Foell, D. Phago....
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重印与许可
