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方法文章

利用CRISPR-Cas9在人类多能干细胞中产生特定基因组修饰

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DOI：

10.3791/60085

⸱

2019年9月25日

 ,  ,  , 
1Center for Cellular and Molecular Therapeutics, The Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, The Children's Hospital of Philadelphia, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Pennsylvania

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案提供了一种利用CRISPR-CAS9在人类多能干细胞中实现特定杂合或纯合核苷酸改变的方法。

摘要

人类多能干细胞为研究基因功能以及建立与疾病相关的特定突变模型提供了强大的系统。由于CRISPR-Cas9在第二个等位基因中诱导插入缺失（indel）的形成，实现精确的杂合性遗传修饰具有挑战性。本文展示了一种通过使用两个修复模板来克服这一困难的实验方案，其中仅一个模板表达所需的序列改变，而两个模板均包含沉默突变，以防止再次切割和插入缺失的形成。该方法在对DNA编码区进行基因编辑以生成同基因型对照和突变型人类干细胞系，进而研究人类疾病与生物学方面具有显著优势。此外，本文还优化了转染和筛选方法，以降低基因编辑实验的劳动强度和成本。总体而言，该实验方案可广泛应用于利用人类多能干细胞模型的多种基因组编辑项目。

引言

人胚胎干细胞（hESCs）和诱导性多能干细胞（iPSCs）因其具有自我更新能力，同时能够分化为不同谱系的细胞类型，已成为研究人类疾病的重要工具1,2,3,4。这些模型为研究基因功能以及特定突变与表型如何关联各种疾病提供了可能5,6。然而，为了明确某一特定遗传改变与特定表型之间的关联，使用配对的同基因型对照细胞系和突变细胞系对于控制不同细胞系之间的变异至关重要7,8。转录激活样效应因子核酸酶（TALENs）和锌指核酸酶已被用于在多种遗传模型（包括原代细胞）中产生插入或缺失（indels）突变；但这些核酸酶使用起来较为繁琐且成本较高9,10,11,12,13,14。成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）-Cas9核酸酶的发现极大地推动了该领域的发展，因其在基因组几乎任何区域均可高效产生indel突变，操作简便且成本显著降低15,16,17,18,19。

利用CRISPR-CAS9基因组编辑技术的一个挑战是在不导致第二个等位基因产生插入/缺失（indel）突变的前提下，对其中一个等位基因进行特定突变的引入或校正20。本实验方案的主要目标是通过使用两条单链寡核苷酸（ssODN）修复模板，减少第二个等位基因中indel的形成，从而克服这一挑战。两条ssODN均设计包含沉默突变，以防止CAS9核酸酶的再次切割，但仅其中一条包含目标修饰。该方法可提高在不诱导第二个等位基因产生indel的前提下，实现特定杂合性基因修饰的效率。采用本方案，在六个独立基因组位点开展的基因编辑实验表明，能够在其中一个等位基因中精确引入预期的基因组改变，同时避免在第二个等位基因中形成indel，总体效率约为10%。本方案改编自Maguire等人的研究21。

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方案

1. 向导RNA（gRNA）的设计与构建

注意：每个 gRNA 由两条 60 个碱基对（bp）的寡核苷酸组成，通过退火形成一条 100 bp 的双链（ds）寡核苷酸（图 1A-C）。gRNA 的设计、构建及切割效率检测的整个周期约为 2 周（图 2）。

  1. 选择需要进行基因组编辑的目标DNA区域，并鉴定出3-4个符合5'-G(N19)NGG-3'格式的23 bp序列。这些序列应位于目标区域20 bp范围内。
    注意：可在正义链或反义链上进行靶向。
  2. 使用CRISPOR等工具（http://crispor.tefor.net）评估gRNA序列的基因组冗余性和脱靶概率。
  3. 将20 bp的靶序列（不含原间隔序列邻近基序PAM）插入两条60-mer寡核苷酸中，如图所示（序列为5'至3'方向，红色和绿色部分为互补反向序列，见图1C）。
  4. 从选定供应商处订购这两条60 bp的寡核苷酸。收到后，用ddH2O将每条寡核苷酸重悬至终浓度100 µM，并配制10 µM的工作液。
  5. 将两条寡核苷酸退火，并使用DNA聚合酶（材料表）生成100 bp的双链DNA片段。在PCR条管中混合5 µL 10 µM的正向寡核苷酸和5 µL 10 µM的反向寡核苷酸，于95 °C孵育5分钟，然后在室温（RT）下冷却10分钟。
  6. 按照表1所述设置PCR反应。在热循环仪中使用表2列出的参数进行PCR扩增。
  7. 在1.5%（w/v）溴化乙锭（EtBr）琼脂糖凝胶上以80-100 V电泳40分钟，观察PCR产物。在LED灯箱下用刀片切下凝胶中100 bp条带（见图3A），并使用凝胶回收试剂盒（材料表）进行纯化。

2. 用于筛选的PCR引物设计

  1. 使用专门设计用于扩增目的基因400-500 bp区域的正向和反向PCR引物对编辑后的DNA进行筛选（表2）。在进行筛选PCR时，使用从任何对照iPSC细胞系中分离的DNA以确认获得清晰的扩增产物。
  2. PCR产物经80-100 V电压电泳1小时后，在1.5%（w/v）琼脂糖凝胶上进行可视化检测。
    注意：在确认筛选引物组的有效性后，使用嵌套引物对编辑克隆进行测序。样品送至商业测序机构进行测序。

3. gRNA克隆载体质粒的制备

  1. 为线性化克隆载体，取一个1.5 mL离心管，加入1–5 µg的gRNA克隆载体DNA、4 µL AflII限制性内切酶缓冲液和1.5 µL AflII限制性内切酶。用ddH2O补至总体积24 µL。通过移液器吹打混匀反应体系。在37 °C下孵育过夜（O/N）。
  2. 在1%琼脂糖凝胶中以80–100 V电泳1小时，切下条带（预期条带大小约为3519 bp）。
  3. 按照步骤1.6进行提取和纯化。

4. gRNA 载体的构建

  1. 按照 材料表 中的组装试剂盒说明，将经 AflII 酶切的 gRNA 克隆载体与 100 bp 琼脂糖凝胶纯化的插入片段以 1:5 的比例设置反应并组装 DNA 片段，具体如 表 3 所述。
  2. 在 50 °C 下孵育反应体系 15 分钟。用 ddH2O 将反应产物按 1:3 比例稀释，取 3 µL 用于细菌转化，操作遵循制造商说明（材料表）。将细胞涂布于含卡那霉素的 LB/琼脂平板上。
  3. 每条 gRNA 挑选 3–5 个单菌落，分别接种至 4 mL LB 培养基中，在 37 °C 摇床培养箱中过夜培养。
  4. 使用质粒小提试剂盒纯化质粒 DNA，并使用以下引物对每条 gRNA 进行测序，以确认克隆成功：正向引物：GTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAGG；反向引物：TGCCAACTTTGTACAAGAAAGCT。

5. 检测gRNA切割效率

  1. 按照先前所述方法21，将人胚胎干细胞（hESCs）接种于经照射的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）上，置于6孔板中培养。当细胞融合度达到70-80%时，配制 表4 中所述的转染主混合液。
  2. 用移液器轻轻混匀，室温孵育15分钟。将混合液逐滴加入细胞中，于37 °C继续孵育48小时（在24小时后更换培养基）。
  3. 转染48小时后收集细胞用于分选：
    1. 使用酶法（材料表）在室温下孵育3分钟，去除MEFs。
    2. 用hESC培养基（表5）清洗细胞一次，刮取细胞并重悬于含10 µM Y-27632二盐酸盐的hESC培养基中（材料表）。
    3. 在300 × g 离心3分钟收集细胞，重悬于0.5 mL含10 µM Y-27632二盐酸盐的hESC培养基中。
    4. 通过带有35 µm细胞筛网帽的滤器过滤至5 mL离心管中。
  4. 采用荧光激活细胞分选（FACS）技术，圈选活细胞，并分选绿色荧光蛋白（GFP）阳性细胞。
  5. 将最多1.5 × 104个分选后的细胞直接转移至经1:3基底膜基质（材料表）包被并铺有经照射MEFs的10 cm2培养皿中，培养基为含Y-27632二盐酸盐的hESC培养基（表5）。
  6. 每日更换不含Y-27632二盐酸盐的hESC培养基（表5），在10-15天后手动挑选克隆，此时克隆直径约为1 mm。
    1. 在显微镜下使用P200移液器，小心刮取单个克隆，并将细胞吸入移液器中。
    2. 在96孔板中，用吸取克隆时所带的培养基轻柔吹打3-4次，使细胞分散。
    3. 将细胞转移至PCR条状管中用于筛选，于10,000 × g 离心5分钟收集细胞。每条gRNA挑选20个克隆。

6. 克隆筛选

  1. 通过将细胞沉淀在 20 µL 蛋白酶 K 缓冲液（表 5）中孵育（55 °C 下 1 小时，95 °C 下 10 分钟）并剧烈涡旋来提取 DNA。在 10,000 x g 下离心 5 分钟，收集上清液。
  2. 使用包含特异性引物（用于扩增目标区域）和 5 µL 蛋白酶 K 消化产物的预混液，在 20 µL 总反应体系中进行筛选性 PCR（第 2 节）。以经基因编辑的细胞系中提取的基因组 DNA 作为对照。
  3. 在 2.5%（w/v）琼脂糖凝胶上以 70–90 V 电泳 1 小时后，评估 PCR 产物的大小变化（图 3B,C）。任何大小差异均提示存在切割效应。

7. 利用单链寡核苷酸DNA（ssODNs）在多能干细胞中进行精确基因组编辑

  1. 设计长度为100 bp的单链寡核苷酸（ssODN），使其序列中心位于已确定具有最佳切割效率的最有效gRNA序列处。
  2. 通过在gRNA序列中引入同义突变，防止重组后的寡核苷酸被再次切割。在PAM序列中引入单个同义突变通常已足够；若不可行，则引入3-4个同义突变亦可。
    注意：为便于对靶向克隆进行筛选，在gRNA序列附近约20 bp范围内引入一个限制性酶切位点是理想选择。
  3. 设计一条包含目标碱基改变（们）的ODN以产生感兴趣的突变，同时设计一条不含该碱基改变（们）的ODN作为对照。
    注意：这些碱基改变应位于预测的CRISPR/Cas9切割位点约20 bp范围内，因为随着距离增加，同源重组效率会显著下降。
  4. 从选定供应商处订购这两条ssODN，并用无菌水重悬，配制成1 µg/µL的储存液，于-20 °C保存。

8. 转染设置

  1. 为了转染ssODN和CRISPR-CAS9质粒，将目标细胞系接种于含照射过的MEF的6孔板中，过夜培养后使细胞融合度达到70-80%。
  2. 按照表6所述设置转染反应体系。用移液器混匀反应液，在室温下孵育15分钟。将转染反应混合物逐滴加入细胞中。
  3. 转染48小时后，按照第5.3节所述方法准备细胞进行分选。
  4. 单细胞铺板约10天后，使用200 μL移液器挑取克隆。将100 μL细胞转移至已包被明胶并含有照射过的MEF的24孔或48孔板中的一个孔内，培养基为含Y-27632二盐酸盐的hESC培养基。剩余的100 μL用于DNA提取，方法见第6节。

9. 检测单菌落中的突变

  1. 为检测ssODN是否成功整合，从每个菌落中提取5 µL DNA，使用第2节中设计的筛选引物进行PCR扩增。纯化PCR产物（材料表），并利用ssODN中引入的特异性限制性酶切位点进行限制性内切酶消化反应。
    注意：该酶切反应体系总体积为40 µL，包含限制性内切酶缓冲液及厂家推荐浓度的限制性内切酶。
  2. 通过移液混匀反应体系，并在厂家推荐温度下孵育1–3小时。
  3. 将酶切后的PCR产物在含溴化乙锭（EtBr）的1.5%（w/v）琼脂糖凝胶中以80–100 V电泳40分钟进行检测。若ssODN成功整合，使用嵌套引物对目标序列进行测序验证。

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结果

gRNA 的生成与插入缺失筛选

每个gRNA将被克隆到质粒载体中，并利用U6启动子进行表达。使用AflII限制性内切酶对质粒（addgene #41824）进行线性化处理，该酶切位点位于U6启动子之后。将两条60 bp的寡核苷酸退火后产生100 bp的条带，通过DNA组装方法将其克隆至gRNA表达载体中。gRNA质粒构建完成后，与CRISPR-CAS9 GFP质粒（addgene #44719）共同转染入人胚胎干细胞（hESCs）或诱导多能干细胞（iPSCs）中。转染2天后，分选GFP阳性细胞以富集转染成功的细胞，并进行铺板培养（见第5节）。10至14天后，挑取由单细胞形成的克隆，提取DNA，用于检测每个gRNA所诱导的插入缺失（indel）突变。采用跨越gRNA靶位点的引物进行PCR扩增，通过含溴化乙锭（EtBr）的2.5%（w/v）琼脂糖凝胶电泳（70–90 V，1小时）观察插入缺失的形成情况。

生成100 bp的ssODN以引入特定突变...

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讨论

本方案展示了在人多能干细胞中利用CRISPR-Cas9系统结合两个ssODN修复模板，以实现特异性杂合或纯合基因组修饰的方法。该方法成功构建了表达杂合基因组改变的同基因型细胞系，效率接近10%。本方案已针对在经辐照的MEF饲养层上培养的人胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）进行了优化，此类饲养层可在细胞分选后低密度培养条件下支持细胞生长与存活。通过在培养中添加10 ng/mL bFGF和Y-27632二盐酸盐，可最大限度减少细胞死亡。本方案可能适用于无饲养层的培养系统，但可能需要进一步优化。

转染效率因细胞系而异，但通常使用 3 µg DNA 和 3 µL 脂质转染试剂可获得最佳效果，转染效率在 0.5–2% 之间。然而，如果转染效率较低，可对 DNA 和脂质试剂的用量进行优化。研究者也可尝试其他转染试剂。

不同gRNA的插入缺失（indel）产生效率会有所不同，并可能受到基因组位置的影响。在绝大多数情况下，若设计四种gRNA，通常至少有一种、很多时候为两到三种能够高效发挥作用。此外，在测试gRNA之前，优化P...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所（NHLBI）通过资助项目U01HL099656（P.G. 和 D.L.F.）和U01HL134696（P.G. 和 D.L.F.）提供资金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5 ml 聚苯乙烯圆底试管，带细胞筛滤帽Corning352235
6 孔聚苯乙烯组织培养板Corning353046
AflII 限制性内切酶New England BiolabsR0520
琼脂糖VWRN605
DMEM/F12 培养基ThermoFisher11320033
dNTPsRoche11969064001
荧光激活细胞分选仪（FACS）装置
凝胶回收试剂盒Macherey-Nagel740609
Gibson 组装试剂盒New England BiolabsE2611
gRNA 克隆载体Addgene41824
含 50 μg/ml 卡那霉素的 LB 琼脂平板
Lipofectamine Stem 转染试剂ThermoFisher(STEM00001)
生长因子减少型 Matrigel（GFR）Corning354230
小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）
Nucleospin 凝胶回收与 PCR 产物纯化试剂盒Macherey-Nagel740609
轨道摇床培养箱
pCas9_GFP 载体Addgene44719
PCR 条状管USA Scientific1402-2900
Phusion 高保真 DNA 聚合酶及 5× Phusion 缓冲液New England BiolabsM0530
PurelinkTM 快速质粒小提试剂盒InvitrogenK210011
蛋白酶 KQiagenQiagen 19133
StellarTM 电转感受态大肠杆菌细胞Takara636763
SOC 培养基New England BiolabsB9020S
TrypLE Express 酶ThermoFisher12605036
Y-27632 二盐酸盐/ROCK 抑制剂（ROCKi）Tocris1254

参考文献

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