本方案提供了一种利用CRISPR-CAS9在人类多能干细胞中实现特定杂合或纯合核苷酸改变的方法。
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方法文章
利用CRISPR-Cas9在人类多能干细胞中产生特定基因组修饰
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
人类多能干细胞为研究基因功能以及建立与疾病相关的特定突变模型提供了强大的系统。由于CRISPR-Cas9在第二个等位基因中诱导插入缺失（indel）的形成，实现精确的杂合性遗传修饰具有挑战性。本文展示了一种通过使用两个修复模板来克服这一困难的实验方案，其中仅一个模板表达所需的序列改变，而两个模板均包含沉默突变，以防止再次切割和插入缺失的形成。该方法在对DNA编码区进行基因编辑以生成同基因型对照和突变型人类干细胞系，进而研究人类疾病与生物学方面具有显著优势。此外，本文还优化了转染和筛选方法，以降低基因编辑实验的劳动强度和成本。总体而言，该实验方案可广泛应用于利用人类多能干细胞模型的多种基因组编辑项目。
引言
人胚胎干细胞（hESCs）和诱导性多能干细胞（iPSCs）因其具有自我更新能力，同时能够分化为不同谱系的细胞类型，已成为研究人类疾病的重要工具1,2,3,4。这些模型为研究基因功能以及特定突变与表型如何关联各种疾病提供了可能5,6。然而，为了明确某一特定遗传改变与特定表型之间的关联，使用配对的同基因型对照细胞系和突变细胞系对于控制不同细胞系之间的变异至关重要7,8。转录激活样效应因子核酸酶（TALENs）和锌指核酸酶已被用于在多种遗传模型（包括原代细胞）中产生插入或缺失（indels）突变；但这些核酸酶使用起来较为繁琐且成本较高9,10,11,12,
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方案
1. 向导RNA（gRNA）的设计与构建
注意：每个 gRNA 由两条 60 个碱基对（bp）的寡核苷酸组成，通过退火形成一条 100 bp 的双链（ds）寡核苷酸（图 1A-C）。gRNA 的设计、构建及切割效率检测的整个周期约为 2 周（图 2）。
- 选择需要进行基因组编辑的目标DNA区域，并鉴定出3-4个符合5'-G(N19)NGG-3'格式的23 bp序列。这些序列应位于目标区域20 bp范围内。
注意：可在正义链或反义链上进行靶向。 - 使用CRISPOR等工具（http://crispor.tefor.net）评估gRNA序列的基因组冗余性和脱靶概率。
- 将20 bp的靶序列（不含原间隔序列邻近基序PAM）插入两条60-mer寡核苷酸中，如图所示（序列为5'至3'方向，红色和绿色部分为互补反向序列，见图1C）。
- 从选定供应商处订购这两条60 bp的寡核苷酸。收到后，用ddH2O将每条寡核苷酸重悬至终浓度100 µM，并配制10 µM的工作液。
- 将两条寡核苷酸退火，并使用....
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结果
gRNA 的生成与插入缺失筛选
每个gRNA将被克隆到质粒载体中，并利用U6启动子进行表达。使用AflII限制性内切酶对质粒（addgene #41824）进行线性化处理，该酶切位点位于U6启动子之后。将两条60 bp的寡核苷酸退火后产生100 bp的条带，通过DNA组装方法将其克隆至gRNA表达载体中。gRNA质粒构建完成后，与CRISPR-CAS9 GFP质粒（addgene #44719）共同转染入人胚胎干细胞（hESCs）或诱导多能干细胞（iPSCs）中。转染2天后，分选GFP阳性细胞以富集转染成功的细胞，并进行铺板培养（见第5节）。10至14天后，挑取由单细胞形成的克隆，提取DNA，用于检测每个gRNA所诱导的插入缺失（indel）突变。采用跨越gRNA靶位点的引物进行PCR扩增，通过含溴化乙锭（EtBr）的2.5%（w/v）琼脂糖凝胶电泳（70–90 V，1小时）观察插入缺失的形成情况。
生成100 bp的ssODN以引入特定突变.......
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讨论
本方案展示了在人多能干细胞中利用CRISPR-Cas9系统结合两个ssODN修复模板，以实现特异性杂合或纯合基因组修饰的方法。该方法成功构建了表达杂合基因组改变的同基因型细胞系，效率接近10%。本方案已针对在经辐照的MEF饲养层上培养的人胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）进行了优化，此类饲养层可在细胞分选后低密度培养条件下支持细胞生长与存活。通过在培养中添加10 ng/mL bFGF和Y-27632二盐酸盐，可最大限度减少细胞死亡。本方案可能适用于无饲养层的培养系统，但可能需要进一步优化。
转染效率因细胞系而异，但通常使用 3 µg DNA 和 3 µL 脂质转染试剂可获得最佳效果，转染效率在 0.5–2% 之间。然而，如果转染效率较低，可对 DNA 和脂质试剂的用量进行优化。研究者也可尝试其他转染试剂。
不同gRNA的插入缺失（indel）产生效率会有所不同，并可能受到基因组位置的影响。在绝大多数情况下，若设计四种gRNA，通常至少有一种、很多时候为两到三种能够高效发挥作用。此外，在测试gRNA之前，优化P.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所（NHLBI）通过资助项目U01HL099656（P.G. 和 D.L.F.）和U01HL134696（P.G. 和 D.L.F.）提供资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5 ml 聚苯乙烯圆底试管，带细胞筛滤帽 | Corning | 352235 | |
| 6 孔聚苯乙烯组织培养板 | Corning | 353046 | |
| AflII 限制性内切酶 | New England Biolabs | R0520 | |
| 琼脂糖 | VWR | N605 | |
| DMEM/F12 培养基 | ThermoFisher | 11320033 | |
| dNTPs | Roche | 11969064001 | |
| 荧光激活细胞分选仪（FACS）装置 | |||
| 凝胶回收试剂盒 | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Gibson 组装试剂盒 | New England Biolabs | E2611 | |
| gRNA 克隆载体 | Addgene | 41824 | |
| 含 50 μg/ml 卡那霉素的 LB 琼脂平板 | |||
| Lipofectamine Stem 转染试剂 | ThermoFisher | (STEM00001) | |
| 生长因子减少型 Matrigel（GFR） | Corning | 354230 | |
| 小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs） | |||
| Nucleospin 凝胶回收与 PCR 产物纯化试剂盒 | Macherey-Nagel | 740609 | |
| 轨道摇床培养箱 | |||
| pCas9_GFP 载体 | Addgene | 44719 | |
| PCR 条状管 | USA Scientific | 1402-2900 | |
| Phusion 高保真 DNA 聚合酶及 5× Phusion 缓冲液 | New England Biolabs | M0530 | |
| PurelinkTM 快速质粒小提试剂盒 | Invitrogen | K210011 | |
| 蛋白酶 K | Qiagen | Qiagen 19133 | |
| StellarTM 电转感受态大肠杆菌细胞 | Takara | 636763 | |
| SOC 培养基 | New England Biolabs | B9020S | |
| TrypLE Express 酶 | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 二盐酸盐/ROCK 抑制剂（ROCKi） | Tocris | 1254 |
参考文献
- Srivastava, D., Dewitt, N. Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation. Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).
- Clevers, H. Review Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Murry, C. E., Keller, G.
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重印与许可
