本方案描述了一种从小鼠体内分离带有眼睑、眼表、前段和后段且相对完整的眼球的方法。
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本文内容
摘要
摘要
眼表（OS）由一个上皮层构成，包含三个相连的部分：睑结膜、球结膜和角膜上皮。眼表结构的破坏可导致角膜炎、结膜炎或两者同时发生（即角结膜炎）。在具有特定基因修饰或人工操作的实验动物模型中，平行检测眼表上皮层各部分的相对病理变化具有重要意义。然而，完整地分离整个眼表组织而不造成变形或损伤一直存在挑战，主要原因在于眼表组织柔软且菲薄，并附着于物理上分离但可活动的眼睑和眼球上。此外，由坚硬的颅骨/眼眶骨形成的眼窝几乎被眼球完全占据，可供解剖操作的空间极为有限。因此，从面部方向直接解剖带有相关眼表组织的眼球常导致组织损伤，尤其是睑结膜和球结膜。在本方案中，我们描述了一种方法：将小鼠头部沿中线切开后，依次去除颅骨和眼眶骨，从而完整保留眼睑、眼表、晶状体和视网膜为一体。眼表上皮层的完整性得以良好维持，并可在单一切片中通过组织学或免疫染色进行检测。
引言
眼表由连续的区域性上皮组织构成，包括睑结膜、球结膜和角膜1。许多腺体结构与眼表上皮相关，共同产生一层泪膜，保护角膜表面免受干燥和外界环境侵袭2。眼表（OS）的破坏可导致角膜炎、结膜炎或两者同时发生（角结膜炎）。遗传因素、环境刺激物或其相互作用均可引起眼表的病理性改变3,4。因此，已有多种通过基因工程构建或物理、化学诱导的动物模型被用于研究人类眼表疾病的发生过程。
小鼠眼表的结构和功能在许多方面与人类相似。眼腺分泌的泪膜成分在小鼠和人类之间也具有相似性。已有大量研究利用小鼠模型来阐明人类眼表疾病的发生机制5,6,7。在许多情况下，为了在相同实验处理下获得全面的信息，分析眼表整体而非局部的分子变化至关重要。因此，需要制备完整性良好的样本，以确保眼表各部分能够同时被分析。
小鼠的眼表组织（OS）与嵌于眼窝/眼眶（由多块不同颅骨构成的骨性凹窝）内的眼球紧密相连，并通过细薄的结缔组织与其相连接。在不损伤睑结膜或球结膜的前提下完整分离整个....
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方案
所有涉及小鼠的操作均经中山眼科中心动物护理与使用委员会批准，并遵循ARVO关于眼科与视觉研究中动物使用的规定。
1. 完整眼表和眼睑的眼球解剖
- 解剖头部。
- 通过颈椎脱位法处死出生后第10天（P10）和P28的小鼠（小鼠品系见材料表），然后用一把锋利的剪刀将头部从颈部剪下。
- 使用直剪刀沿矢状中线将头部一分为二，从顶间骨前部开始，向前至鼻部（图1A,B）。
注意：随着小鼠年龄增长，颅骨会逐渐变硬，操作时应尽量保持剪切路径沿中线进行。 - 将头部的每一半置于洁净的培养皿中，先用锋利的剪刀剪除下颌和舌头。在视交叉位置之前切断视神经以游离该神经，并清除附着于颅骨壁上的所有脑组织，包括嗅球。
- 此时剩余组织应包含与眼球相连的所有颅骨/眶骨结构（图1C,D）。用PBS冲洗剩余部分，以清除血液和毛发碎屑。
- 将组织置于含有4%多聚甲醛（PFA，溶于磷酸盐缓冲液[PBS]，pH 7.4）的50 mL锥形管中，在室温（RT）下旋转固定。大致固定时间如下：P0至P7约为10分钟；P8至P28约为20分钟；P29及以上约为30分钟。
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结果
从不同角度观察的主要颅骨如图1A-E所示，不同颜色代表不同的骨骼。我们使用四周龄动物来演示解剖过程。在完成解剖步骤1.1.1-1.1.3以及短暂的前固定（步骤1.1.4）后，可见附着面部骨骼的眼球，如图1E所示。进一步修剪去除前部（鼻骨和前上颌骨）和后部（如顶骨）以及筛骨后，获得主要包含上颌骨和额骨覆盖在眼球上方的组织块（图1F）。根据图1F中标示的区域依次去除这些骨骼，暴露出下方的泪骨和颧骨以及哈德氏腺（图1G）。附着于眼球的哈德氏腺作为解剖标志（图1
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讨论
制备完整眼球时的一个关键提示是，必须彻底清除所有眶骨，尤其是位于眼窝底部附近的小骨——蝶骨和泪骨。任何残留的骨骼都可能给后续的组织学切片带来困难。如果在解剖过程中不慎遗留了微小骨片，可用尖头镊子从包埋的石蜡块中将其取出。操作后留下的空隙应以熔化的石蜡填充。
处理晶状体时应格外小心。晶状体的破碎碎片通常会散落在整个切片中，这将严重影响显微镜检查和图像分析。尝试移除晶状体会损害眼球表面（若从面部方向操作）或视网膜（若从视盘侧操作）。一种无需解剖即可减轻晶状体组织存在所造成负面影响的替代方法是改变切片方向。例如，为保留眼球表面形态，应从眼球前部向后部对石蜡包埋块进行切片；反之，则从相反方向进行切片。
对于PFA固定石蜡切片，一个重要的注意事项是，通常需要进行抗原修复，以便进行免疫染色，例如使用K12和K14抗体。然而，也存在许多例外情况，抗原修复可能会产生非特异性信号，从而增加背景染色。因此，使用抗原修复技术时应谨慎，如果可能，应在正式实验前通过预实验对抗体进行测试。
通常，从.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢郭荣教授对稿件的审阅，以及所有实验室成员提供的技术支持。本研究获得了国家自然科学基金（NSFC: 31571077；中国北京）、广州市科技计划项目（201707020009；中国广东省广州市）、"中山大学“百人计划”"（8300-18821104；中国广东省广州市）以及中山眼科中心眼科学国家重点实验室研究经费（303060202400339；中国广东省广州市）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1× 磷酸盐缓冲液（PBS） | Transgen Biotech | FG701-01 | |
| 50 ml 离心管 | Corning | 430829 | |
| 粘附性显微镜载玻片 | Various | ||
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | 建议使用浓度 1:500 - 1,000 |
| Alexa Fluor 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | 建议使用浓度 1:500 - 1,000 |
| 抗 K12 抗体 | Abcam | ab124975 | 建议使用浓度 1:1,000 |
| 抗 K14 抗体 | Abcam | ab7800 | 建议使用浓度 1:800 |
| 柠檬酸 | Various | ||
| 盖玻片 | Various | ||
| 弯头镊子 | World Precision Instruments | 14127 | |
| 解剖显微镜 | Olympus | SZ61 | |
| 乙醇 | Various | ||
| 荧光显微镜 | Zeiss | AxioImager.Z2 | |
| Fluoromount-G 封片介质 | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| 直刃显微解剖剪 | World Precision Instruments | 503242 | |
| 微波炉 | Galanz | P70D20TL-D4 | |
| 小鼠品系 | C57/BL6 和 Sv129 混合 | ||
| 4 号直头镊子 | World Precision Instruments | 501978-6 | |
| 正常山羊血清 | Various | ||
| 多聚甲醛（PFA） | Various | 用 1× PBS 配制 4% 溶液，并使用 0.45μm 滤膜过滤 | |
| 组织培养皿 | Various | ||
| 三水合柠檬酸钠 | Various | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | SLBW6818 |
参考文献
- Swamynathan, S. K. Ocular surface development and gene expression. Journal of Ophthalmology. 2013, (2013).
- Arita, R., Fukuoka, S., Morishige, N. Functional Morphology of the Lipid Layer of the Tear Film. Cornea. 36 Suppl 1, S60-S66 (2017).
- Guo, D., et al.
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