本方案描述了一种从小鼠体内分离带有眼睑、眼表、前段和后段且相对完整的眼球的方法。
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摘要
摘要
眼表（OS）由一个上皮层构成，包含三个相连的部分：睑结膜、球结膜和角膜上皮。眼表结构的破坏可导致角膜炎、结膜炎或两者同时发生（即角结膜炎）。在具有特定基因修饰或人工操作的实验动物模型中，平行检测眼表上皮层各部分的相对病理变化具有重要意义。然而，完整地分离整个眼表组织而不造成变形或损伤一直存在挑战，主要原因在于眼表组织柔软且菲薄，并附着于物理上分离但可活动的眼睑和眼球上。此外，由坚硬的颅骨/眼眶骨形成的眼窝几乎被眼球完全占据，可供解剖操作的空间极为有限。因此，从面部方向直接解剖带有相关眼表组织的眼球常导致组织损伤，尤其是睑结膜和球结膜。在本方案中，我们描述了一种方法：将小鼠头部沿中线切开后，依次去除颅骨和眼眶骨，从而完整保留眼睑、眼表、晶状体和视网膜为一体。眼表上皮层的完整性得以良好维持，并可在单一切片中通过组织学或免疫染色进行检测。
引言
眼表由连续的区域性上皮组织构成，包括睑结膜、球结膜和角膜1。许多腺体结构与眼表上皮相关，共同产生一层泪膜，保护角膜表面免受干燥和外界环境侵袭2。眼表（OS）的破坏可导致角膜炎、结膜炎或两者同时发生（角结膜炎）。遗传因素、环境刺激物或其相互作用均可引起眼表的病理性改变3,4。因此，已有多种通过基因工程构建或物理、化学诱导的动物模型被用于研究人类眼表疾病的发生过程。
小鼠眼表的结构和功能在许多方面与人类相似。眼腺分泌的泪膜成分在小鼠和人类之间也具有相似性。已有大量研究利用小鼠模型来阐明人类眼表疾病的发生机制5,6,7。在许多情况下，为了在相同实验处理下获得全面的信息，分析眼表整体而非局部的分子变化至关重要。因此，需要制备完整性良好的样本，以确保眼表各部分能够同时被分析。
小鼠的眼表组织（OS）与嵌于眼窝/眼眶（由多块不同颅骨构成的骨性凹窝）内的眼球紧密相连，并通过细薄的结缔组织与其相连接。在不损伤睑结膜或球结膜的前提下完整分离整个眼表组织，存在巨大挑战。这些挑战主要源于以下两点：（i）眼表组织柔软且纤薄，并附着于物理上分离但可活动的眼睑和眼球，因此极易发生形变和损伤；（ii）眼眶骨与眼球之间的空间极为有限，限制了分离操作的进行。对于成年小鼠而言，这些挑战更为严峻。在胚胎小鼠中，眼眶骨的骨化尚未完成，周围组织相对疏松8。此时可将头部完整切除并沿中线剖开，随后直接进行多聚甲醛（PFA）固定和包埋9。相比之下，出生后及成年小鼠的眼眶骨已完全骨化，且周围组织较厚，导致固定剂渗透效率降低。此外，眼眶/颅骨坚硬而脆，在石蜡等软质包埋介质中切片时容易碎裂。骨碎片会一致地撕扯邻近组织，造成组织形态学质量下降。
许多已发表的研究通常仅展示部分眼表结构，这可能已满足其特定研究目的10,11。对文献的总体分析发现，仅有少数研究展示了完整且未受损的眼表结构，但并未详细描述相应的解剖操作步骤12,13。在本实验方案中，我们详细阐述了一种获取整体出生后眼表组织的解剖方法，通过有序去除眶骨和颅骨，保留完整的眼表结构及其眼球和眼睑，最大限度地减少物理性损伤。进一步地，我们利用该方案制备的组织切片对眼表进行了组织学检查，并开展了免疫组织化学分析。
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方案
所有涉及小鼠的操作均经中山眼科中心动物护理与使用委员会批准，并遵循ARVO关于眼科与视觉研究中动物使用的规定。
1. 完整眼表和眼睑的眼球解剖
- 解剖头部。
- 通过颈椎脱位法处死出生后第10天（P10）和P28的小鼠（小鼠品系见材料表），然后用一把锋利的剪刀将头部从颈部剪下。
- 使用直剪刀沿矢状中线将头部一分为二，从顶间骨前部开始，向前至鼻部（图1A,B）。
注意：随着小鼠年龄增长，颅骨会逐渐变硬，操作时应尽量保持剪切路径沿中线进行。 - 将头部的每一半置于洁净的培养皿中，先用锋利的剪刀剪除下颌和舌头。在视交叉位置之前切断视神经以游离该神经，并清除附着于颅骨壁上的所有脑组织，包括嗅球。
- 此时剩余组织应包含与眼球相连的所有颅骨/眶骨结构（图1C,D）。用PBS冲洗剩余部分，以清除血液和毛发碎屑。
- 将组织置于含有4%多聚甲醛（PFA，溶于磷酸盐缓冲液[PBS]，pH 7.4）的50 mL锥形管中，在室温（RT）下旋转固定。大致固定时间如下：P0至P7约为10分钟；P8至P28约为20分钟；P29及以上约为30分钟。
注意：预固定可增加组织硬度，使后续解剖更易操作。此外，预固定可避免在解剖完成前新鲜组织长时间暴露而未被固定。
警告：PFA具有危害性，必须小心操作。
- 去除颅骨/眶骨。
- 预固定后，迅速用PBS清洗解剖好的头部三次，以进一步去除残留的毛发和固定剂，以便进行后续解剖。
警告：解剖过程中接触固定剂可能对健康造成损害。 - 将组织置于10 cm培养皿中，沿图1D,E所示平面将颅骨切成三部分。眼眶中的眼球隐藏在筛骨、额骨和上颌骨下方的颅骨中部（图1D,E）。
- 使用两把4号直镊小心剥离筛骨，充分暴露额骨和上颌骨（图1F）。
- 将颅骨表面（包括上颌骨和额骨）按解剖位置划分为4个区域（图1F）。将弯镊尖端水平插入每个区域，依次去除上颌骨和额骨（图1F）。
注意：上颌骨无法一次性完全去除，需耐心逐块解剖。额骨通过软性结缔组织直接连接眼球，去除时需格外小心，避免牵拉眼球或损伤结膜。 - 去除部分上颌骨及全部额骨后，下方的泪骨和颧骨将暴露出来（图1G）。清除这两块骨骼及其周围附着的眼球周围皮下肌肉和脂肪组织，将带有眼睑和皮肤的眼球修剪成小的方形组织块，以减少组织体积，便于包埋时定向（图1H）。
- 将眼球及相关组织重新放入4% PFA中，在4 °C下继续固定过夜。固定后的组织可在含0.02% NaN3的PBS中于4 °C保存至少一个月。或者，可立即进行组织学分析。
注意：若需长期保存，可将组织直接存放在70%乙醇中。
- 预固定后，迅速用PBS清洗解剖好的头部三次，以进一步去除残留的毛发和固定剂，以便进行后续解剖。
2. 组织学分析
- 石蜡切片与苏木精-伊红（H&E）染色
- 按照其他文献中描述的标准方案进行石蜡包埋和切片9。
- 免疫组织化学（IHC）
- 使用二甲苯脱蜡石蜡切片，并通过梯度酒精（100%、95%、80%）将切片水化至蒸馏水（dH2O）中。
- 将组织切片置于玻璃切片缸中的0.01 M柠檬酸缓冲液（每升双蒸H2O含3 g三钠柠檬酸盐和0.4 g柠檬酸）中，采用低功率（120 W）微波处理进行抗原修复。总处理时间为5–10分钟，能量间歇性释放，每次间隔约2分钟。
注意：高功率微波或持续加热可能导致组织切片从载玻片上脱落。 - 从玻璃缸中取出切片，用纸巾小心擦去每个切片周围的残留液体，将其放置于组织学染色盒中的载玻片架上。使用防水组织学笔在每个切片周围画出方框。在每个方框内加入100 µL封闭缓冲液（含0.1% Triton X-100和10%驴血清的1×PBS），室温孵育30分钟。
- 用真空泵小心吸除封闭液，加入用封闭缓冲液按适当比例稀释的一抗（见材料表），继续在4 °C孵育24小时或更长时间。
注意：用于IHC的每种一抗浓度各不相同，需通过预实验确定最佳浓度。 - 用PBST（含0.1% Triton的PBS）洗涤组织切片三次，每次10分钟。重复步骤2.2.4，使用二抗（见材料表）并以4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）替代封闭缓冲液，继续在室温下孵育至少4小时或更长时间。
- 移除二抗，用PBST溶液洗涤组织切片三次，每次10分钟，再用新鲜PBS洗涤5分钟。
- 擦去组织切片周围的残留PBS，用封片剂将盖玻片封固于切片上。进行荧光显微镜成像（见材料表）。
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结果
从不同角度观察的主要颅骨如图1A-E所示，不同颜色代表不同的骨骼。我们使用四周龄动物来演示解剖过程。在完成解剖步骤1.1.1-1.1.3以及短暂的前固定（步骤1.1.4）后，可见附着面部骨骼的眼球，如图1E所示。进一步修剪去除前部（鼻骨和前上颌骨）和后部（如顶骨）以及筛骨后，获得主要包含上颌骨和额骨覆盖在眼球上方的组织块（图1F）。根据图1F中标示的区域依次去除这些骨骼，暴露出下方的泪骨和颧骨以及哈德氏腺（图1G）。附着于眼球的哈德氏腺作为解剖标志（图1
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讨论
制备完整眼球时的一个关键提示是，必须彻底清除所有眶骨，尤其是位于眼窝底部附近的小骨——蝶骨和泪骨。任何残留的骨骼都可能给后续的组织学切片带来困难。如果在解剖过程中不慎遗留了微小骨片，可用尖头镊子从包埋的石蜡块中将其取出。操作后留下的空隙应以熔化的石蜡填充。
处理晶状体时应格外小心。晶状体的破碎碎片通常会散落在整个切片中，这将严重影响显微镜检查和图像分析。尝试移除晶状体会损害眼球表面（若从面部方向操作）或视网膜（若从视盘侧操作）。一种无需解剖即可减轻晶状体组织存在所造成负面影响的替代方法是改变切片方向。例如，为保留眼球表面形态，应从眼球前部向后部对石蜡包埋块进行切片；反之，则从相反方向进行切片。
对于PFA固定石蜡切片，一个重要的注意事项是，通常需要进行抗原修复，以便进行免疫染色，例如使用K12和K14抗体。然而，也存在许多例外情况，抗原修复可能会产生非特异性信号，从而增加背景染色。因此，使用抗原修复技术时应谨慎，如果可能，应在正式实验前通过预实验对抗体进行测试。
通常，从...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢郭荣教授对稿件的审阅，以及所有实验室成员提供的技术支持。本研究获得了国家自然科学基金（NSFC: 31571077；中国北京）、广州市科技计划项目（201707020009；中国广东省广州市）、"中山大学“百人计划”"（8300-18821104；中国广东省广州市）以及中山眼科中心眼科学国家重点实验室研究经费（303060202400339；中国广东省广州市）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1× 磷酸盐缓冲液（PBS） | Transgen Biotech | FG701-01 | |
| 50 ml 离心管 | Corning | 430829 | |
| 粘附性显微镜载玻片 | Various | ||
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | 建议使用浓度 1:500 - 1,000 |
| Alexa Fluor 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | 建议使用浓度 1:500 - 1,000 |
| 抗 K12 抗体 | Abcam | ab124975 | 建议使用浓度 1:1,000 |
| 抗 K14 抗体 | Abcam | ab7800 | 建议使用浓度 1:800 |
| 柠檬酸 | Various | ||
| 盖玻片 | Various | ||
| 弯头镊子 | World Precision Instruments | 14127 | |
| 解剖显微镜 | Olympus | SZ61 | |
| 乙醇 | Various | ||
| 荧光显微镜 | Zeiss | AxioImager.Z2 | |
| Fluoromount-G 封片介质 | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| 直刃显微解剖剪 | World Precision Instruments | 503242 | |
| 微波炉 | Galanz | P70D20TL-D4 | |
| 小鼠品系 | C57/BL6 和 Sv129 混合 | ||
| 4 号直头镊子 | World Precision Instruments | 501978-6 | |
| 正常山羊血清 | Various | ||
| 多聚甲醛（PFA） | Various | 用 1× PBS 配制 4% 溶液，并使用 0.45μm 滤膜过滤 | |
| 组织培养皿 | Various | ||
| 三水合柠檬酸钠 | Various | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | SLBW6818 |
参考文献
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