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小鼠右心室系统侵入性血流动力学评估及缺氧诱导的肺动脉高压

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DOI：

10.3791/60090

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2019年10月24日

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1Beijing Key Laboratory of Pre-clinical Research and Evaluation for Cardiovascular Implant Materials, State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Fuwai Hospital, National Centre for Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 2Laboratory Animal Center, Peking University, 3Center of Cardiac Surgery for Adults, State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Fuwai Hospital, National Centre for Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College

本文内容

摘要

本文介绍了一种通过开胸手术方法在小鼠中进行右心室和肺动脉有创血流动力学评估的实验方案。

摘要

肺动脉高压（PAH）是一种慢性且严重的 cardiopulmonary 疾病。小鼠是模拟该疾病的常用动物模型。然而，在小鼠中评估右心室压力（RVP）和肺动脉压力（PAP）在技术上仍具挑战性。由于左心和右心系统在解剖结构上的差异，RVP 和 PAP 的测量比左心室压力更为困难。本文介绍了一种稳定的右心血流动力学测量方法，并利用健康小鼠和 PAH 小鼠对该方法进行了验证。该方法基于开胸手术和机械通气支持，与闭胸操作相比更为复杂。尽管该手术需要经过良好训练的外科操作人员，但其优势在于可同时获得 RVP 和 PAP 参数，因此是评估 PAH 模型的优选方法。

引言

肺动脉高压（PAH）是一种慢性且严重的 cardiopulmonary 疾病，其特征为肺动脉压（PAP）和右心室压（RVP）升高，病因是小肺动脉的细胞增殖和纤维化1。肺动脉导管，也称为 Swan-Ganz 导管2，常用于临床对 RVP 和 PAP 的监测。此外，一种无线 PAP 监测系统已应用于临床3,4,5。为了在小鼠中模拟该疾病以供研究，通常采用低氧环境来复制人类 PAH 的临床表现6。在动物 PAP 评估中，大型动物可通过与人类相同的肺动脉导管技术相对容易地进行监测，而小动物（如大鼠和小鼠）由于体型较小，评估难度较大。利用超小型 1 Fr 导管可实现对小鼠右心室系统的血流动力学测量7。文献中已有报道测量小鼠 RVP 和 PAP 的方法8,9，但该方法缺乏详细的描述。由于左心和右心系统在解剖结构上的差异，RVP 和 PAP 的测量比左心室压更为困难。

为了在同一小鼠中获取肺动脉压（PAP）和右心室压（RVP）参数，我们介绍了一种基于开胸手术的右心血流动力学测量方法，阐述了该方法在健康小鼠和肺动脉高压（PAH）小鼠中的验证过程，并说明了如何在复杂的开胸手术过程中避免产生人为数据。尽管该技术最好由训练有素的外科医生操作，但其优势在于能够在同一只小鼠中同时评估PAP和RVP。

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方案

动物实验方案经中国医学科学院阜外医院机构动物护理和使用委员会审查并批准（编号：0000287）。实验动物的饲养和管理均按照中国动物福利指南进行。

注意：将8至12周龄的雄性C57BL小鼠饲养在12小时黑暗/12小时光照循环的环境中。PAH小鼠在氧浓度为10%的条件下饲养4周，通过氧控型低氧舱维持该环境以诱导肺动脉高压；对照组小鼠在相同条件下饲养于室内空气（21%氧气）中。在低氧刺激4周结束时进行右心室压（RVP）和肺动脉压（PAP）的测量。

1. 术前准备

  1. 在进行血流动力学实验前，将压力传感器导管（规格：1 Fr）浸泡在室温的0.9%生理盐水中至少30分钟。
  2. 使用0.22 μm滤膜过滤2,2,2-三溴乙醇溶液，并储存在4°C冰箱中。
  3. 准备清洁的手术器械和用品，例如手术用手套。
  4. 准备10 mL 1.0%消化酶溶液用于导管清洗。
  5. 将压力传感器导管连接至压力-容积系统。
  6. 在对每只小鼠进行压力测量前，校准压力传感器。
    1. 将校准旋钮调至0 mmHg和25 mmHg，向数据采集软件发送验证压力信号，并在软件中配置校准参数。
    2. 将旋钮转至Transducer位置，并调节Balance旋钮以归零基线。
  7. 设置标准体视显微镜和温控小动物手术台，以在手术期间维持动物体温。
  8. 设置显微手术用照明系统，为手术区域提供充足的光线。

2. 开胸手术与血流动力学测量

  1. 通过腹腔注射（i.p.）给予小鼠 250 mg/kg 的 2,2,2-三溴乙醇进行麻醉。如有需要，可在手术过程中以原剂量的 1/3 至 1/2 追加补充剂量。
  2. 使用剃毛器和脱毛膏去除小鼠胸部和颈部的毛发（图 1A，2A）。
  3. 将每只小鼠仰卧位固定在可调节温度的小动物手术台上，以在手术期间维持其体温（37 °C）。
  4. 用 70% 乙醇清洁手术区域。
  5. 待麻醉起效后，通过脚趾夹捏法确认麻醉深度是否充分。
  6. 在颈部皮肤做正中切口（图 1A）。
  7. 使用弯头镊子分离骨骼肌，并暴露气管（图 1B, 1C）。
  8. 经口插入经改造的 22 G 静脉套管导管进行气管插管。使用镊子确认导管位于气管内（图 1D）。
  9. 将导管连接至小动物呼吸机。根据呼吸机用户手册10中的说明，依据体重计算并设定呼吸频率和潮气量。例如，对于一只 30 g 的小鼠，根据所述计算方法，设定呼吸频率为 133 次/分钟，潮气量为 180 μL。
  10. 使用胶带固定通气导管。
  11. 再次通过脚趾夹捏法确认麻醉深度是否充分。
  12. 在胸部皮肤做正中切口，并使用电凝设备小心分离胸部肌肉（图 2B, 2C）。
  13. 使用剪刀从胸骨中部剪开，暴露胸腔（图 2D）。
  14. 在开胸手术过程中，使用电凝设备控制任何出血。
  15. 使用牵开器暴露右心室（图 2E）。
  16. 用 25 G 针头创建一个小通道，将浸有生理盐水的压力传感器导管插入右心室，以测量右心室压（RVP）（图 2F 和 图 3A, 3C）。
  17. 手持导管电缆，沿肺动脉同轴方向穿过肺动脉瓣。观察压力波形，并获得稳定的肺动脉压（PAP）信号（图 3B, 3D）。
  18. 使用数据采集系统和软件记录血流动力学数据。
  19. 完成最终测量后，通过腹腔注射过量的 2,2,2-三溴乙醇溶液，人道处死小鼠。
  20. 小心地从右心系统取出导管，并将其放入含有 1% 消化酶溶液的 1 mL 注射器中。
  21. 使用蒸馏水持续轻柔冲洗导管，并将其存放于原装盒中。

3. 血流动力学数据分析

注意：血流动力学数据使用分析软件11 （材料表）进行记录和分析。

  1. 对每只小鼠，选择至少10个连续且稳定、无噪声的心跳周期，以获得每个参数的右心室压（RVP）或肺动脉压（PAP）数据的平均值。
  2. 采用学生氏t检验比较正常空气对照组与低氧组。注意：p < 0.05 被认为具有统计学显著性。数据以均值 ± 标准差表示。

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结果

通过25 G针头扩增的隧道将压力换能器导管插入右心室（图3A），获得典型的右心室压力（RVP）波形（图3C）。在导管通过肺动脉瓣时，需持续调整并缓慢推进导管，使其始终保持与肺动脉同轴（图3B）。当压力传感器成功进入肺动脉后，可观察到具有特征性重搏切迹的典型肺动脉压（PAP）波形（图3D）。为避免产生人为数据，需观察波形是否存在噪声（图4），或导管零点是否发生漂移（图5）。若出现上述情况，应进行校正，并将含噪声的波形段排除在数据分析之外。

肺动脉高压（PAH）的特征是肺动脉压（PAP）和右心室压（...

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讨论

气管插管是开胸手术的第一步重要操作。对于大鼠或小鼠等小型动物，传统的气管插管方法是在气管上做T形切口，然后将Y型气管导管直接插入气管内。在实际操作中，我们发现该方法存在操作困难的问题。Y型气管导管对小型动物而言过大，且与气管之间形成夹角，因此难以固定导管。此外，在开胸手术过程中，一旦插管意外脱出气道，通常会导致动物因失去机械通气支持而死亡。因此，我们对经气管插管方法进行了改良14 ：先在皮肤上做切口，分离肌层以暴露气管（图1C），然后通过动物口腔将气管导管直接插入气道。使用镊子夹闭气管可方便地确认导管在气管内的位置（图1D）。拔出导引针后仅保留套管，采用22 G静脉留置针作为插管导管。插管完成后可轻松固定导管。该方法在手术期间管理插管安全可靠，可显著提高小型动物开胸手术的成功率。但该方法需要经过训练和实践掌握。

关于经胸腔闭合方法进行右心血...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由北京协和医学院研究生教育与教学改革项目（10023-2016-002-03）、阜外医院青年基金（2018-F09）以及北京市心血管植入材料临床前研究与评价重点实验室主任基金（2018-PT2-ZR05）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2,2,2-三溴乙醇Sigma-AldrichT48402-5G用于麻醉
动物体温控制器Physitemp Instruments, Inc.TCAT-2LV用于温度控制
解剖镊Fine Science Tools, Inc.11274-20用于手术
Gemini 电凝系统GeminiGEM 5917用于手术
静脉导管（22G）BD angiocath381123用于插管
LabChart 7.3ADInstruments用于数据分析
照明系统Olympus用于手术
Mikro-Tip 导管Millar Instruments, Houston, TXSPR-1000用于压力测量
Millar 压力-容积系统Millar Instruments, Houston, TXMVPS-300用于压力测量
O2 控制器与低氧舱BiospherixProOx 110用于慢性低氧处理
PowerLab 数据采集系统ADInstrumentsPowerLab 16/30用于数据记录
剪刀Fine Science Tools, Inc.14084-08用于手术
小型动物呼吸机Harvard ApparatusMini-Vent 845用于手术
体视显微镜OlympusSZ61用于手术
手术胶带3M用于手术
Terg-a-zyme 酶清洗剂Sigma-AldrichZ273287-1EA用于导管清洗

参考文献

  1. Humbert, M., et al. Advances in therapeutic interventions for patients with pulmonary arterial hypertension. Circulation. 130 (24), 2189-2208 (2014).
  2. Chatterjee, K. The Swan-Ganz catheters: past, present, and future: a viewpoint. Circulation. 119 (1), 147-152 (2009).
  3. Adamson, P. B., et al. CHAMPION trial rationale and design: the long-term safety and clinical efficacy of a wireless pulmonary artery pressure monitoring system. Journal of Cardiac Failure. 17 (1), 3-10 (2011).
  4. Abraham, W. T., et al. Wireless pulmonary artery haemodynamic monitoring in chronic heart failure: a randomised controlled trial. The Lancet. 377 (9766), 658-666 (2011).
  5. Adamson, P. B., et al. Wireless pulmonary artery pressure monitoring guides management to reduce decompensation in heart failure with preserved ejection fraction. Circulation: Heart Failure. 7 (6), 935-944 (2014).
  6. Shatat, M. A., et al. Endothelial Kruppel-like Factor 4 modulates pulmonary arterial hypertension. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (3), 647-653 (2014).
  7. SPR-1000 Mouse Pressure Catheter. , Available from: https://millar.com/products/research/pressure/single-pressure-no-lumen/spr-1000 (2019).
  8. Tabima, D. M., Hacker, T. A., Chesler, N. C. Measuring right ventricular function in the normal and hypertensive mouse hearts using admittance-derived pressure-volume loops. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 299 (6), 2069-2075 (2010).
  9. Skuli, N., et al. Endothelial deletion of hypoxia-inducible factor-2alpha (HIF-2alpha) alters vascular function and tumor angiogenesis. Blood. 114 (2), 469-477 (2009).
  10. Harvard Inspira Advanced Safety Ventilator User's Manual. , Available from: http://www.harvardapparatus.com/media/harvard/pdf/Inspira_557058_9.pdf. (2019).
  11. LabChart. , Available from: https://www.adinstruments.com/products/labchart?creative=290739105773_keyword=labchart_matchtype=e_network=g_device=_gclid=CjwKCAjwxrzoBRBBEiwAbtX1n42I2S06KmccVncUHkmExU8KKOXXREyzx8bvTrxYMSze-ooE0atcbRoCliwQAvD_BwE (2019).
  12. Marius, M. H., et al. Definitions and diagnosis of pulmonary hypertension. Journal of the American College of Cardiology. 62 (25), 42-50 (2013).
  13. Ciuclan, L., et al. A novel murine model of severe pulmonary arterial hypertension. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 184 (10), 1171-1182 (2011).
  14. Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. Journal of Applied Physiology. 87 (6), 2362-2365 (1999).
  15. Chen, W. C., et al. Right ventricular systolic pressure measurements in combination with harvest of lung and immune tissue samples in mice. Journal of Visualized Experiments. (71), 50023(2013).
  16. Ma, Z., Mao, L., Rajagopal, S. Hemodynamic characterization of rodent models of pulmonary arterial hypertension. Journal of Visualized Experiments. (110), 53335(2016).
  17. Chen, M. Berberine attenuates hypoxia-induced pulmonary arterial hypertension via bone morphogenetic protein and transforming growth factor-β signaling. Journal of Cellular Physiology. , (2019).
  18. Bueno-Beti, C., Hadri, L., Hajjar, R. J., Sassi, Y. The Sugen 5416/Hypoxia mouse model of pulmonary arterial hypertension. Experimental Models of Cardiovascular Diseases. Methods in Molecular Biology. vol 1816. Ishikawa, K. , Humana Press. New York, NY. (2018).

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