方法文章

利用PRIMO微图案系统研究细胞对细胞外基质蛋白响应的光诱导蛋白质分子吸附

DOI：

10.3791/60092

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2019年10月11日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Faculty of Biology, Medicine and Health. Division of Cell Matrix, Biology and Regenerative Medicine, Wellcome Trust Centre for Cell-Matrix Research, The University of Manchester, 2School of Materials, The University of Manchester, 3Blond McIndoe Laboratories, School of Biological Sciences, Faculty of Biology, Medicine and Health, Division of Cell Matrix Biology and Regenerative Medicine, The University of Manchester, Manchester Academic Health Science Centre, 4Department of Plastic Surgery & Burns, Wythenshawe Hospital, Manchester University NHS Foundation Trust, Manchester Academic Health Science Centre, 5Department of Pathology, UMC Utrecht

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们的总体目标是理解细胞如何感知引导轴突定向生长的胞外信号。在此，我们描述了一种光诱导蛋白质吸附技术，该方法可用于生成特定的细胞外基质成分微图案，以研究调控轴突发育和路径选择的具体事件。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

细胞能够感知多种细胞外信号，包括细胞外基质的成分和几何结构，而细胞外基质是由细胞自身合成并不断重塑的。本文介绍了一种基于PRIMO系统、利用光诱导蛋白质分子吸附（LIMAP）技术进行图案化的方法，可用于制备单一种类或多种蛋白质组合的微图案化细胞外基质（ECM）基底。该方法能够以微米级分辨率打印ECM图案，并具有优异的可重复性。我们提供了一个逐步操作的实验方案，并展示了该方法如何应用于研究神经元路径导向过程。相较于现有的微打印技术，LIMAP在多组分图案化以及生成任意几何形状或梯度图案方面具有显著优势。该方案可轻松调整，用于研究几乎任何化学成分对细胞命运和细胞行为的影响。最后，我们讨论了实验中可能出现的常见问题及其避免方法。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

近年来，生物科学越来越多地利用材料科学所提供的技术进步。一个典型的例子是基底的微图形化技术，该技术可用于研究细胞增殖等细胞反应1,2，分化3,4,5,6细胞迁移7,8,9 和路径寻找10,11有多种技术可用于基底的微图形化，例如多光子激发光化学12原子力显微镜蘸笔纳米光刻13，针式和喷墨直接打印14电子束光刻15 或微流控技术16然而，生物学领域广泛使用的两种技术之一是微接触印刷17,18,19 或激光辅助图案化3 (图1激光辅助图案化技术在蛋白质和聚乙二醇（PEG）稳定性以及细胞在图案上的限定性方面，被认为比微接触印刷技术能提供更可靠的结果。20一种更为新颖的微图形化方法是利用光诱导蛋白质分子吸附技术21 (LIMAP, 图1D）使用市售系统（PRIMO， 材料表）。每种方法均有其优缺点，下文将简要描述。微接触印刷技术采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具（印模），其微结构特征由光刻母版制备而来。将印模与选定的蛋白质孵育，随后将蛋白质转移（印迹）至细胞培养基底上18 (图1A）。激光辅助图案化利用紫外光切割抗污膜22,23,24,25，暴露可随后用目标蛋白包被的区域（图1B）。虽然光刻图案化方法所达到的分辨率在微米量级25,26，这些技术大多需要使用光掩模，要么与样品直接接触，要么位于显微镜物镜的物平面内23,27,28在微接触印刷和光刻图案化中，掩模的使用可能成为限制因素；每种几何图案和尺寸都需要特定的掩模，而制备这些掩模可能成本高昂且耗时。相比之下，LIMAP 技术无需使用掩模。图1D）。使用PRIMO系统进行LIMAP在初期可能成本较高，因为它需要购置设备。然而，该系统采用开源软件来设计任意所需几何形状的图案，提供了更大的自由度，并允许开展更复杂的实验，包括使用蛋白质浓度梯度。PRIMO激光器由数字控制的微镜装置（DMD）控制和引导，可生成任意数量用户自定义几何形状的图案。LIMAP要求培养表面涂覆阻止细胞附着的分子，最常用的是聚乙二醇（PEG）。 "防污" 试剂；其可在玻璃或塑料表面形成致密的抗粘附膜29随后加入一种光引发剂，可通过光裂解机制高精度地去除PEG薄膜。30 通过DMD控制下的局部紫外光照射，去除特定区域的PEG，这些无PEG区域可吸附蛋白并涂覆于激光蚀刻的表面，从而形成微米级图案。通过调节激光功率，可从表面去除不同量的PEG，使用户能够生成蛋白浓度梯度。PEG去除与蛋白涂覆步骤可重复进行，以在同一微孔中构建包含两种或多种不同蛋白的图案。21生成的微图案为细胞提供了黏附表面，可用于研究细胞行为。在我们的研究中，利用微图案技术来研究神经细胞系（CAD（儿茶酚胺能分化）细胞）的神经突或轴突导向。31）或原代大鼠背根神经节（DRG）神经元。本文中，我们概述了一种LIMAP的逐步实验方案（图2) 使用市售的 PRIMO 系统及配套的 Leonardo 软件。我们展示了如何利用该系统生成具有特定几何形状和多种蛋白质的图案，并用于研究轴突导向。我们还讨论了可能出现的常见问题及其避免方法。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 图案模板的设计

注意：图案化的模板通过数字绘图软件生成（材料表）。不同灰度级别的绘制将决定激光强度。使用软件设计图案模板可快速生成具有任意所需几何形状和梯度的图案（图3）。

  1. 使用绘图软件数字绘制所需的图案模板。选择图像尺寸为1824像素长和1140像素宽（在本研究中对应415 µm长和260 µm宽）。将图案模板保存为8位Tiff文件。
    注意：可向商业化微图案设备的厂商索取生成模板的逐步操作方案（材料表）。

2. 等离子清洗

注意：为获得最佳结果，需在图案化前对表面进行等离子清洗，以去除所有有机物并活化表面。在本实验中，环境空气足以实现表面活化。采用等离子清洗仪（材料表），工艺压力为1000-1300 mTorr，功率为29.6 W，处理时间为1-5分钟。

  1. 使用内孔直径为 20 mm、玻璃厚度为 0.16–0.19 mm 的玻璃底培养皿。若需测试多个条件，请使用 6 孔玻璃底培养皿；否则使用单孔玻璃底培养皿（材料表）。
    注意：等离子清洗的逐步操作方案可向等离子清洗设备的商业化品牌方索取（材料表）。

3. 钝化

注意：此步骤将生成一种防污膜，可防止蛋白质吸附到玻璃表面。聚乙二醇（PEG）作为防污剂，具有高度抵抗蛋白质吸附的特性29。LIMAP 利用光引发剂通过紫外光断键反应在局部去除 PEG。目标蛋白质将吸附至这些无 PEG 的区域21，从而形成微米级图案。

  1. PLL-PEG钝化处理
    1. 在无菌条件下，将PDMS模板（见图4A,B及材料表）裁剪至合适尺寸，确保其能够贴合内层玻璃底孔，使用无菌镊子移除内层微孔中的填充物，并用镊子将模板粘附到玻璃孔底部。
    2. 确保模板紧密贴附于玻璃孔底部，防止在钝化过程中产生气泡而导致泄漏。
      注：PDMS模板也可根据已发表的方案自行制备18,32。
    3. 在磷酸盐缓冲液（PBS）中配制PLL-PEG溶液（材料表，0.1 mg/mL）。向每个微孔中加入20 µL PLL-PEG溶液，在室温下孵育1小时。
    4. 从微孔中移除15 µL PLL-PEG溶液，并用20 µL PBS（材料表）洗涤五次，每次洗涤后不得让孔干燥。
      注：每次洗涤之间应始终保留约5 µL PBS。由于微孔体积较小，极易干燥，干燥会导致微图案质量下降。
    5. 可将培养皿置于PBS（每孔3 mL）中，在4 °C保存最多3天，或直接进行下一步（步骤3.1.5）。
    6. 从单个微孔（例如左上角微孔，见图4D）中移除18 µL PBS，加入5 µL光引发剂（PLPP，材料表），其余微孔中保留20 µL PBS。含PLPP的微孔将在系统校准步骤（步骤4）中用于生成参考图案（见图4D,E）。PLPP需避光保存。
  2. 长效PEG-SVA钝化处理
    注：为构建抗粘附表面，可选用以下两种方法之一：1）聚-L-赖氨酸（PLL）连接的聚乙二醇（PLL-PEG，步骤3.1）；或2）琥珀酸酯-N-羟基琥珀酰亚胺的聚乙二醇（PEG-SVA）。选择何种钝化方式取决于储存条件（见步骤10）。使用PEG-SVA处理的培养皿需要两倍的钝化时间和光图案化时间。
    1. 按照步骤3.1.1所述方法准备模板。
    2. 向每个微孔中加入20 µL 0.01%聚-L-赖氨酸（PLL，材料表），在室温下孵育30分钟，以实现PLL预包被。
    3. 从微孔中移除15 µL PLL溶液，并用20 µL 1 M HEPES缓冲液（材料表）洗涤三次，每次洗涤后不得让孔干燥。
      注：每次洗涤之间应始终保留约5 µL HEPES或PBS。由于微孔体积较小，极易干燥，干燥会导致微图案质量下降。
    4. 配制PEG-SVA溶液。PEG-SVA溶液（50 mg/mL溶于1 M HEPES缓冲液）需每次使用前新鲜配制。每微孔准备20 µL PEG-SVA溶液。
    5. HEPES缓冲液的pH值必须在8–8.5之间。在配制PEG-SVA溶液前，使用pH试纸检测HEPES缓冲液的pH值。使用精密天平在离心管中称取PEG-SVA，加入HEPES缓冲液后涡旋30秒直至完全溶解。当溶液呈透明状态时，表明PEG-SVA已完全溶解。
      注：SVA为酯类基团，可介导PEG与先前包被的PLL结合。一旦将HEPES缓冲液加入PEG-SVA中，SVA的半衰期为15分钟，因此应立即使用。
    6. 向每个微孔中加入20 µL PEG-SVA溶液，在室温下孵育1小时。从微孔中移除15 µL PEG-SVA溶液，并用20 µL PBS（材料表）洗涤五次，每次洗涤后不得让孔干燥。
    7. 可将培养皿准备用于长期储存（最长1个月，见步骤10.2），或继续进行下一步（步骤3.2.8）。
    8. 从单个微孔（例如左上角微孔，见图4D）中移除18 µL PBS，加入5 µL PLPP（材料表），其余微孔中保留20 µL PBS。该微孔将用于生成参考图案（见图4D, E）。确保PLPP在整个微孔表面分布均匀。PLPP需避光保存。

4. 系统校准

注意：在这些步骤中，将根据特定类型的培养皿调整激光的焦点（步骤 4.1）。仅在一个微孔中生成参考图案（步骤 4.2），随后与蛋白质溶液孵育（步骤 4.3），以确保激光处于最佳聚焦状态（步骤 4.4），这是获得清晰且轮廓分明图案所必需的条件。

  1. 激光校准
    注意：在校准过程中，校准激光图像将投射到荧光标记的玻璃表面（校准孔，用荧光标记笔标记，图4C），该表面需在显微镜下处于焦点位置。
    1. 使用荧光标记笔（材料表）标记一个空的内层玻璃孔。
      注意：校准孔必须与将要生成微图案的培养皿具有相同的玻璃厚度（0.16–0.19 mm）。若使用6孔玻璃底培养皿，则可使用其中一个空孔进行校准，并应在无菌条件下用荧游戏副本标记。
    2. 打开显微镜、载物台和计算机。开启PRIMO微图案化设备，启动Micro-manager和Leonardo软件。Leonardo软件通过Micro-manager中的Plugins运行。请在材料表中核对设备和软件的品牌/目录编号。
    3. 在Leonardo的初始菜单中选择Calibrate。检查专用PRIMO滤光镜组是否位于滤光镜转轮的正确位置（光路）；在显微镜和Leonardo软件中均选择20X物镜（0.75 DIC S Plan Fluor，无相差环）。
      注意：本方案适用于Leonardo 4.4版本。其他版本可能需要调整。
    4. 将先前标记的校准孔（图4C）移至物镜上方。选择相机光路。调节物镜焦距，直至PRIMO标志和标语Take care of your cells的激光投影均清晰对焦。
    5. 保持默认相机曝光时间25 ms。调节激光强度，使PRIMO标志中的字母I呈灰色，其余字母呈白色。
    6. 记录焦平面的Z位置（物镜到样品的高度），后续称为校准Z位置。该值将作为生成参考图案后获得最佳对焦的近似值（见步骤4.2–4.4）。
  2. 参考图案
    1. 将含有光引发剂的培养皿（参考图案微孔，图4D）移至物镜上方，在Leonardo软件中选择Pattern now。
    2. 通过相机使用透射光观察微孔边缘，从右侧菜单选择ROI符号。将ROI圆的直径设为4000 µm，并使数字ROI边缘与当前微孔边缘对齐。
    3. 通过移动载物台沿微孔边缘移动，确保数字ROI与当前微孔之间准确重叠。ROI位置将与载物台移动同步。
    4. 在Leonardo软件中选择Lock，以锁定ROI在所需位置。关闭透射光。
    5. 选择PRIMO以上传所需的图案模板，该模板将以设计单元的形式投射到ROI上（见图5）。图案将以下拉列表形式出现在软件的Actions中，并显示在Actions菜单中。
      注意：图案模板需预先设计（见步骤1）并保存为8位Tiff文件，然后加载至软件中。
    6. 参考图案仅需一个小图案即可，例如3行1列（见图4E和图5B）。在Replication菜单中设置所需的列数和行数（Leonardo软件中为Lines）。点击Refresh以查看图案设计的数字预览。
    7. 在Replication菜单中设置激光剂量。在此设置下使用PLL-PEG时，最佳激光剂量为1390 mJ/mm2。
      注意：激光功率可在5–7.5 mW/mm2之间变化。本例中为7.5 mW/mm2，使用1390 mJ/mm2的激光剂量时，每个设计单元的图案化时间约为30秒。若培养皿表面使用PEG-SVA钝化，则可能需要更高的激光剂量（约为PLL-PEG的两倍）。此参数需预先测试。
    8. 导航至微孔的边缘区域（例如顶部），远离微孔中心的主要图案生成区域（见图4E），然后选择Lock。等待图案显示完成。
    9. 将焦距调整至校准Z位置（见步骤4.1.6）。
      注意：若在光图案化轮次之间有其他用户使用同一显微镜，建议进行额外的系统校准步骤。
    10. 选择Play符号以开始图案化。确保软件中激光已开启。等待图案化过程完成。图案化持续时间将在Estimated Time面板中显示。在Leonardo软件4.4版本中，当Visualization菜单中所有Actions均变为蓝色时，表示图案化完成。
  3. 参考图案上的蛋白孵育
    1. 在无菌条件下，用20 µL PBS清洗参考图案微孔三次，以去除PLPP。
    2. 向参考图案微孔中加入20 µL荧光标记的ECM蛋白（10 µg/mL层粘连蛋白、纤连蛋白或纤维蛋白原溶于PBS中，见材料表和步骤6）。室温避光孵育10–20分钟（根据蛋白种类而定）（用铝箔包裹培养皿）。
    3. 孵育后，移除18 µL蛋白溶液，并用20 µL PBS清洗三次；未用于创建参考图案的微孔（见图4D,E）保持在20 µL PBS中。
  4. 可视化与设定最佳激光焦点
    1. 使用落射荧光显微镜、20X物镜和合适的软件（参见材料表中本研究所用软件）观察参考图案。参考图案应出现在其生成的边缘区域（例如顶部微孔区域）（见图4E）。
    2. 通过相机光路调节图案边缘的焦点。根据参考图案的最佳对焦状态记录Z位置。此调整后的Z位置将作为后续图案化的最佳激光焦点。

5. 软件设置与光刻图案化

注意：一旦完成系统的校准（步骤4），用户将上传所需的图案模板（模板配置，图5），用于光图案化，并可选择为每个微孔中的一种或多种蛋白质生成图案。微图案化过程包括光图案化和蛋白质孵育步骤（见图2）。

  1. 在无菌条件下，从所有微孔中移除 18 µL PBS，并向每个微孔中加入 5 µL PLPP。确保 PLPP 均匀覆盖整个微孔表面。
  2. 将带有参考图案微孔的培养皿（图 4D,E）置于物镜上方，在 Leonardo 软件中选择 Pattern now。
  3. 通过相机路径使用透射光观察微孔，并选择 ROI 符号。将 ROI 的直径设置为 4,000 µm，并使数字 ROI 的边缘与当前微孔的边缘重合。选择 Lock。
    注意：ROI 的形状和直径取决于所用 PDMS 印模的设计和尺寸。例如，若使用 5,000 × 5,000 µm 的方形 PDMS 印模，则应使用 5,000 × 5,000 µm 的方形 ROI。
  4. 对培养皿中的每个微孔重复重合步骤（步骤 5.3）。完成后，关闭透射光。
  5. 移动至参考图案微孔的中心区域（避开参考图案区域），选择 PRIMO 以上传所需的图案模板，该模板将以设计单元的形式投影到 ROI 上（见 图 5）。图案将出现在下拉列表中，称为 Actions，并在软件的 Actions 菜单 中显示。
    注意：图案模板需在实验前设计完成，并保存为 8 位 Tiff 文件，然后加载至软件中。
  6. 为了在整个微孔上创建图案，需要复制设计单元。一个设计单元覆盖约 0.1 mm2 的微孔面积。在 Replication 菜单中，设置所需的列数和行数（软件中称为 Lines）（见 图 5）。
  7. 为生成连续图案，需调整列与行之间的间距；在本研究中，通过在列之间使用 -20 至 -35 µm 的间距（负间距）获得连续条纹图案。这种负间距会在设计单元之间产生重叠（图 5B,C）。
  8. 在 Replication 菜单中设置激光剂量。在此条件下使用 PLL-PEG 时，最佳激光剂量为 1390 mJ/mm2。图案化持续时间将在 Estimated Time 面板中显示。
    注意：在此情况下，激光功率为 7.5 mW/mm2，每个设计单元的图案化时间约为 30 秒，剂量为 1390 mJ/mm2。例如，一个设计单元（0.1 mm2）在 4 列和 4 行中复制（约 1.6 mm2），总图案化时间约为 8 分钟。如果培养皿表面使用 PEG-SVA 进行钝化处理，则可能需要更高的激光剂量（约为 PLL-PEG 所需剂量的两倍）。
  9. 选择 Lock，并等待图案在虚拟界面中显示。
  10. 如需更新图案参数，请点击相应的 Action，然后解锁并修改参数。完成图案更新后，再次选择 Lock。
  11. 在同一微孔中进行多种蛋白质的图案化（连续多轮微图案化）需要精确对齐各图案。为实现此对齐，需同时上传所有所需图案模板（第一轮和第二轮光图案化的图案）。
  12. 设置各图案模板的复制参数和剂量参数。参数设置完成后，图案将以 Actions 形式出现在 Actions 列表中。将此模板配置作为文件保存在软件中（见 图 5D）。
  13. 在 Actions 列表中，仅选择第一轮图案化过程中需要执行的具体操作，取消选择将在第二轮图案化中执行的操作（见 图 5D）。
  14. 移动至步骤 4.2 中生成参考图案的区域（例如，参考图案微孔的顶部区域，见 图 4E）。将焦距调整至最佳 Z 位置（在步骤 4.4 中确定）。
    注意：强烈建议在所使用的显微镜上启用完美的聚焦系统（如具备该功能），以确保在整个光图案化过程中维持最佳 Z 位置。
  15. 选择 Play 符号以开始图案化。图案化持续时间将在 Estimated Time 面板中显示。在 Leonardo 软件版本 4.4 中，当 Visualization 菜单中所有 Actions 均变为蓝色时，表示图案化完成。

6. 蛋白质孵育

注意：将微孔与细胞外基质蛋白（最好带有荧光标记）共同孵育。这些蛋白仅会结合到通过第5步所述光刻图案化过程去除聚乙二醇（PEG）的区域。每个孔中含有一个带4个微孔的聚二甲基硅氧烷（PDMS）掩膜，可同时测试4种不同条件，例如在每个微孔中孵育不同的蛋白（见图4D）。

  1. 使用荧光标记的蛋白质（例如，与红色或绿色荧光染料偶联的层粘连蛋白、纤连蛋白或纤维蛋白原）以可视化微图案（参见步骤 6.7 和 9.4）。或者，可在后续阶段使用免疫荧光法对吸附的未标记蛋白质进行可视化。
    注意：细胞外基质蛋白（例如，纤连蛋白）可通过现有方案33 和市售的荧光标记试剂盒（如 Alexa 488 标记试剂盒）进行标记，或直接购买已标记的蛋白（例如，偶联的纤维蛋白原-488 或红色荧光罗丹明标记的层粘连蛋白，参见 材料表）。
  2. 在无菌条件下，配制所需浓度的细胞外基质蛋白溶液（10 µg/mL 的层粘连蛋白、纤连蛋白或纤维蛋白原溶于 PBS 中，参见 材料表 和步骤 4.3）。
    注意：荧光标记的细胞外基质蛋白对光敏感，应避光保存（用铝箔包裹培养皿），并始终置于冰上。
  3. 在无菌条件下，用 20 µL PBS 将微孔清洗三次，以去除 PLPP。
  4. 从所有微孔中移除 18 µL PBS，并向每个微孔中加入 20 µL 细胞外基质蛋白溶液。在室温下避光孵育 20–30 分钟。
    注意：最佳包被孵育时间可能因蛋白质种类和浓度不同而有所变化。
  5. 孵育结束后，从微孔中移除 15 µL 细胞外基质蛋白溶液，并用 20 µL PBS 将微孔清洗三次。
    注意：每次清洗之间应始终保留约 5 µL PBS。
  6. 若仅使用一种蛋白进行图案化（单轮微图案化），则继续进行培养皿储存（步骤 10）或细胞接种（步骤 11，参见 图 2）。若在同一微孔中使用不同蛋白进行第二轮微图案化，则继续进行培养皿储存（步骤 10）或封闭非特异性结合位点（步骤 7，参见 图 2）。
  7. 可选的质量控制步骤：在接种细胞前，使用落射荧光显微镜观察并成像打印的图案。选择合适的荧光通道，并相应调整曝光时间。
    注意：为在不同实验间比较图案的荧光强度，必须对同一种蛋白使用相同的曝光时间。

7. 封闭非特异性结合位点（仅适用于多重蛋白质图案）

注意：在同一微孔中进行多种蛋白质的微图案化涉及连续的图案化步骤（见图2）。需向微孔中加入封闭剂（PLL-PEG 或 BSA），以防止交叉结合，即在第二次孵育的蛋白质（步骤9）与第一次孵育的蛋白质（步骤6）结合时发生的情况，从而避免图案内出现蛋白质混合。

  1. 在无菌条件下，向每个微孔中加入 20 µL PLL-PEG（0.1 mg/mL 溶于 PBS）或 BSA（1% BSA 溶于 PBS），作为阻断步骤以防止交叉结合。
    注意：阻断效率可能因所用蛋白质的性质及其相互亲和力而异。建议预先测试 PLL-PEG 和 BSA 作为阻断剂的效果（图 10D-I）。
  2. 将阻断剂在室温下孵育 1 小时，并避光保护。移除 15 µL 阻断剂，然后用 20 µL PBS 将所有微孔洗涤三次。每次洗涤之间始终保留约 5 µL PBS。
  3. 从所有微孔中移除 18 µL PBS，并向每个微孔中加入 5 µL PLPP，确保 PLPP 均匀覆盖整个微孔表面。

8. 第二次光刻图案化（仅适用于多种蛋白质图案）

注意：在完成第一轮光刻图案化和蛋白质孵育后，将生成一个微图案。在第二轮光刻图案化过程中，将在同一微孔中生成第二种蛋白质的图案（见图2C和图5D）。在软件中选择正确的图案模板（操作），这些模板将在本轮中进行图案化（见图5D）。

  1. 导航至第一个微孔（图4D）。确保数字ROI与微孔之间具有适当的重叠。
  2. 加载先前保存的模板配置（步骤5.12），并选择在第二轮光图案化过程中要进行图案化的操作（取消选择第一轮的操作，参见图5D）。
  3. 点击播放符号以开始图案化。确保软件中激光已开启。

9. 第二轮蛋白质孵育（仅适用于多重蛋白质模式）

注意：在本实验步骤中，荧光标记的蛋白质将在第二轮光刻图案化处理后孵育于培养皿上。

  1. 在无菌条件下，用 20 µL PBS 洗涤微孔三次，以去除 PLPP。吸除 18 µL PBS，并向每个微孔中加入 20 µL ECM 蛋白溶液。室温孵育 20–30 分钟，并避光。
    注意：最佳包被孵育时间可能因蛋白的类型和浓度不同而有所差异。
  2. 孵育结束后，吸除 15 µL ECM 蛋白溶液，并用 20 µL PBS 将微孔洗涤三次。每次洗涤之间应始终保留约 5 µL PBS。
  3. 可选择继续进行培养皿储存（步骤 10）或进行细胞接种（步骤 11，参见 图 2）。
  4. 可选的质量控制步骤：使用落射荧光显微镜，在接种细胞前观察并成像已打印的图案。选择合适的荧光通道并调整曝光时间。
    注意：若需在不同实验间比较图案的荧光强度，则必须对同一种蛋白使用相同的曝光时间。

10. 微图案的储存

注意：吸附了蛋白质的微图案可在实验方案的不同步骤中保存（见图2）。若进行多种蛋白质的微图案化，可在完成第一轮微图案化后，或在连续两轮微图案化全部完成后保存微图案（见图2B）。

  1. 使用PLL-PEG钝化后，将微图案置于PBS中（每孔3 mL），于4 °C保存，最长可保存3天。
  2. 若培养皿使用PEG-SVA进行钝化，则微图案可保存长达1个月。为此，需用双蒸去离子水充分冲洗微图案，并用无菌的氩气或氮气气枪吹干，也可使用普通空气。干燥后，微图案可在4 °C下保存长达1个月（PRIMO系统支持团队，个人交流）。

11. 细胞铺板

注意：在接下来的步骤中，细胞将被接种到已制备好的微图案化培养皿上。在这些研究中，使用了一种神经元细胞系（CAD 细胞）31。然而，本方案可根据需要调整用于研究其他感兴趣的细胞类型（根据需要调整细胞接种方案）。

  1. 使用分化培养基（DMEM，添加1%谷氨酰胺，不含血清，并含1%青霉素-链霉素，参见材料表）对CAD细胞进行48小时分化。
  2. 将含细胞的1 mL培养基接种至内层玻璃小室中，覆盖所有微孔，并将培养皿置于37 °C、5% CO2的培养箱中。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

按照上述方案可获得包被有目标细胞外基质蛋白的微图案化表面。我们利用这些图案来追踪神经元的路径导向。

生成的图案应精确反映模板。如图6所示，一个代表单一设计单元（图5B）的数字图案模板（图6A）成功制备出宽度范围为20至2 µm的明确定义的微图案，并用标记的纤维蛋白原（Fibrinogen）进行涂层（图6B）。使用ImageJ软件，沿条带在垂直方向（图6C）和水平方向（图6E）测量荧光强度，同时在每条条带上方15 µm处的相应背景区域进行背景测量。随后将各条带宽度的背景测量值从图案测量值中扣除。

该系统的一个局限性是，在打印特征尺寸≥20 µm时可观察到边缘效应（图6B，顶部条带），即图案边缘的信号强度高于中心区域（图6D，荧光强度分布曲线的第一个峰）。在我们的实验中，分辨率极限约为2 µm；在此宽度下，纤维蛋白原荧光强度相较于较宽条带显著降低（约降低50%）（图6F,G）。使用PRIMO系统并按照本文所述方案进行图案化可获得可重复的图案，其中2 µm宽度条带在四个独立重复设计单元中测得的平均荧光强度标准差最大（图6G）。图案化条带内部的变异也较低，变异系数介于3%至10%之间，其中20 µm和2 µm条带的内部变异最大。这可能分别归因于边缘效应和系统的分辨率极限。需要注意的是，在这些测量中，我们仅测量了条带中心区域的强度，以避免因成像所用物镜导致的照明不均（渐晕效应，图6E）。

某些实验可能涉及需要确定蛋白浓度的问题，这可以通过两种方式实现：1）改变蛋白浓度（图7A,B）。与不同浓度的层粘连蛋白孵育后，荧光强度表现出显著差异，并随蛋白浓度升高而增强（图7B）。2）可调节用于切割抗粘附薄膜（PEG）的激光剂量。较高的激光剂量会更彻底地去除防污涂层，从而为目标蛋白产生更多的结合位点（图7C,D），导致荧光强度显著不同，并随激光剂量增加而增强（图7D）。

通过调整激光剂量，可在同一图案内形成蛋白质浓度梯度。如图8A所示，使用不同灰度级别设计了一个梯度模板，从黑色（无激光功率）到白色（最大激光功率）。

激光强度与模板的灰度级别成正比（在8位图像中范围为0至255），从而产生紫外光照梯度。沿梯度条带的荧光强度分布测量结果在图案模板中呈线性关系（图8B），在生成的梯度图案中同样呈线性（图8C,D）。该线性关系在同一模板及梯度图案中的所有梯度条带之间具有可重复性（图8B,D）。此类梯度的生成非常有用，有助于模拟体内环境，其中细胞通常会对生物活性蛋白的浓度梯度产生响应34,35,36,37。

细胞能够感知不断变化的细胞外环境，但目前可用于研究细胞在遭遇此类变化时行为的检测方法仍有限。LIMAP 可用于在同一微孔中对多种蛋白质进行微米级图案化。如图9所示，使用纤连蛋白（水平方向）和层粘连蛋白（垂直方向）生成了交叉图案。在使用多种蛋白质创建图案时，至关重要的是在第一种和第二种蛋白质孵育之间加入封闭步骤，以防止蛋白质之间的交叉结合（见步骤7）。封闭效率可能因用于包被的蛋白质的生物化学特性而异，我们建议测试多种封闭缓冲液，包括 PLL-PEG（0.1 mg/mL）和 BSA（1%）。为评估这种交叉结合效应，我们使用 ImageJ 进行了荧光强度测量（图9），结果表明，使用 PLL-PEG 缓冲液（0.1 mg/mL）可显著降低纤连游戏副本和层粘连蛋白交叉图案中的交叉结合现象（图9D,H）。

生成的交叉图案用于CAD细胞（图10A,B）或大鼠背根神经节（DRG）神经元（图10C）的细胞实验。这些细胞的神经突（CAD）和轴突（DRG）沿不同的线条生长。CAD细胞被用作神经元模型，因为其整合素表达谱与原代神经元相似，并且在培养48小时后仍表现出富含肌动蛋白的生长锥（图10B），因此适用于轴突导向研究。

为了研究所制备的微图案对原代神经元可能产生的细胞毒性作用，按照先前发表的方案38分离并培养背根神经节（DRG）神经元于微图案上。结果表明，原代神经元能够耐受微图案环境（图10C）。目前我们正在研究多种细胞外基质（ECM）蛋白如何影响轴突（神经突）的路径选择。在CAD细胞中获得的初步概念验证结果，将进一步在DRG神经元中进行深入研究。为验证所制备微图案的质量，建议通过荧光显微镜对图案成像，以确保在进行细胞接种前图案边缘清晰明确。在成像过程中，需确保显微镜与相机之间的光学调节，避免周边暗化效应（晕影），以免影响后续的数据分析与解释。此外，应使用与拍摄图案图像相同的曝光时间获取一幅无图案区域的图像，并将该图像从图案图像中扣除。

总之，为了获得高质量的微图案，建议在使用多种蛋白质时评估蛋白质浓度（图7A,B）、激光剂量（图7C,D）、蛋白质背景水平（图6E,F,H）以及有效的封闭步骤（图9）。最终，LIMAP 生成的微图案质量对于从细胞实验中获得可靠且可重复的数据至关重要。

微图案化技术示意图；包括微接触印刷、激光辅助图案化、光图案化和LIMAP方法。
图1：微图案化技术示意图：微接触印刷与激光辅助图案化。（A）微接触印刷利用具有特定微结构的光刻模板制备PDMS印章，该印章与目标蛋白孵育后，将蛋白转移（即“盖印”）至玻璃表面，从而形成蛋白微图案。（B）激光辅助图案化技术包括光图案化和直接激光图案化。（C）大多数光图案化方法采用紫外光源及具有特定几何形状的光掩膜（掩膜可与基底表面接触，或位于物镜焦平面内），在特定位置切割PEG防污表面，形成预定图案；随后通过蛋白孵育步骤，使蛋白仅吸附于激光切割区域。（D）LIMAP是一种无需与基底接触的光图案化技术（即无掩膜、非接触式方法）。LIMAP利用光引发剂，在低剂量激光照射下激活，使暴露于光下的PEG区域发生断裂，从而产生可供后续蛋白吸附的结合位点。（E）直接激光图案化采用高能光束直接刻蚀PEG薄膜，使被刻蚀区域允许蛋白结合。请点击此处查看该图的放大版本。

显示单轮与多轮蛋白微图案化的示意图。从校准到细胞接种的流程。
图2：微图案化实验流程各步骤的示意图概览。（A）单蛋白微图案化仅需进行一轮微图案化操作（光图案化和蛋白孵育），可在8小时以内完成。（B）多蛋白微图案化需要连续进行两轮微图案化操作，根据所准备的微图案数量，可在1至2天内完成；在一天内完成B版本的实验流程也是可行的。连续箭头表示实验步骤的直接流程，不连续箭头表示两个步骤之间存在显著的时间间隔（参见步骤6.6和9.3）。（C）经过一轮微图案化（红色条带）或连续两轮微图案化（红色和绿色条带）后所获得的典型图案示意图。请点击此处查看该图的放大版本。

显示纤维蛋白原蛋白图案化形成字母 AKCM 的显微图像，比例尺为 50 μm，标注区域。
图 3：利用 LIMAP 实现图案模板生成具有高度灵活性。（A,B）使用 ImageJ 设计的图案模板示例（A 为十字弓形，B 为字母）。白色绘制的形状以最大激光功率投射，黑色绘制的形状则不投射。（C,D）通过 LIMAP 技术，将模板与 10 µg/mL 纤维蛋白原（绿色）孵育后获得的微图案。（C）十字弓形图案宽度和高度均为 50 µm，水平间距为 75 µm，垂直间距为 50 µm。（D）字母图案宽度为 80 µm，高度为 85 µm。C 和 D 中的比例尺代表 50 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

多孔板中的细胞培养，示意图与结果；生物学检测分析装置。
图4：LIMAP方案所需的关键材料。（A）本方案中使用的模板为直径20 mm、厚度250 µm的薄圆形PDMS片，内含4个微孔（每个直径4 mm）。微孔中使用的体积范围为5至20 µL，显著减少了每次实验所需的试剂和蛋白用量。（B）6孔玻璃底培养皿，其中每个孔均已放置模板。微孔中加入20 µL PBS以使其可见。（C）校准用培养皿，其内部玻璃孔已用绿色荧光笔标记，用于校准激光焦点。（D）B中6孔玻璃底培养皿左上孔的示意图（以红色虚线圈出）。内部玻璃底孔以白色表示，模板以灰色表示。模板包含4个微孔（编号1-4），用于测试4种不同的实验条件（例如不同的蛋白浓度、图案几何形状、蛋白组合等）。星号表示含有参考图案的微孔。（E）微孔的示意图，其中在上部已生成参考图案（实心箭头所示）。该参考图案用于获得最佳激光聚焦条件以进行图案化（见步骤4）。空心箭头指示微孔的中央区域，在系统校准后将用于后续的图案化操作。请点击此处查看该图的放大版本。

显示复制过程、线间距和顺序图案化操作的微图案示意图。
图 5：微图案化的软件设置。（A）使用 ImageJ 设计并保存为 8 位 Tiff 文件的平行条纹图案模板。（B-D）数字 ROI（感兴趣区域）的示意图，将与当前微孔重叠，用于生成微图案。（B）在 Leonardo 软件中选择要使用的图案模板（长度 1824 像素 = 415 µm，宽度 1140 像素 = 260 µm），并作为设计单元（黑色虚线矩形中的红色条纹）投射到 ROI 上，覆盖微孔区域约 0.1 mm2。在 复制 菜单中（模板配置），将设计单元复制为 4 列 4 行，在微孔内形成图案。注意列之间的间距。（C）为形成连续条纹图案，需调整列之间的间距。在此例中，为实现设计单元间的重叠，需在复制菜单中将列间距设置为 负间距，即 -20 µm。（D）为在同一微孔内图案化多种蛋白质，需精确对齐各图案。在软件设置步骤（步骤 5）中，同时上传所有所需图案模板。在 操作 列表中，仅选择每轮图案化过程中要执行的特定操作，其余操作应取消选择（步骤 5.12、5.13 和 8.2）。请点击此处查看该图的放大版本。

使用纤维蛋白原进行微图案分析；示意图显示线轮廓、强度和变异图。
图 6：使用 LIMAP 分析图案变异性。 （A）使用 ImageJ 设计的图案模板，用于微图案化四条宽度不同（从上到下分别为 20、10、5、2 µm）的条带。（B）与 10 µg/mL 荧光标记的纤维蛋白原（绿色）孵育后获得的微图案。（C）沿穿过微图案条带的垂直线进行的强度测量。（D）由 (C) 中测量得到的垂直荧光强度轮廓。注意，在较宽条带（20 µm）中，由于蛋白在条带边缘积聚，导致垂直轮廓出现变化，形成两个明显的荧光强度峰（边缘效应）。该效应仅在条带宽度 ≥20 µm 时出现。（E）沿所示水平线（荧光信号与背景）进行的强度测量。（F）由 (E) 中测量得到的水平荧光强度轮廓。（G）显示每种条带宽度的平均强度的图，数据来自四个独立重复的设计单元（图案间变异）。注意在 2 µm 条带宽度上的蛋白吸附显著减少。（H）图案化条带内部的变异（变异系数）在所有条带宽度下均较低，范围为 3% 至 10%。G 和 H 中的数据以均值 ± 标准差表示。G 和 H 中的统计分析采用单因素方差分析（Kruskal-Wallis）非参数检验结合多重比较。** 显著性水平的 P 值 <0.001。 请点击此处查看该图的放大版本。

蛋白质和激光剂量效应；层粘连蛋白、纤连蛋白条带；荧光强度图表，实验。
图7：激光功率和蛋白质浓度变化对蛋白质吸附效率的影响。 （A）PLL-PEG 表面使用恒定的激光剂量（1390 mJ/mm2）进行激光切割，并与指定浓度的荧光标记层粘连蛋白（品红色）孵育。（B）对（A）中层粘连蛋白条带的荧光强度进行定量分析。（C）施加不同指定的激光剂量，随后与相同浓度（10 µg/mL）的荧光标记纤连蛋白（绿色）孵育。（D）对（C）中纤连蛋白条带的荧光强度进行定量分析，结果显示较高的激光剂量与更高的蛋白质吸附水平相关。所有测量值均已扣除背景信号。柱状图底部标明样本数量；数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。统计分析采用双尾非参数 Mann-Whitney 检验。**** 显著性对应的 P 值为 <0.0001。 请点击此处查看该图的放大版本。

纤连蛋白的梯度图案；示意图、图表；荧光显微镜；强度分布分析。
图8：微图案内蛋白质浓度梯度的生成。（A）灰度下的梯度图案模板。（B）从（A）测得的荧光强度分布。（C）使用LIMAP技术，将（A）中的图案模板与10 µg/mL荧光标记的纤连蛋白（绿色）孵育后获得的图案。（D）n = 3条条带及其背景的荧光强度分布，以均值±标准误表示，显示蛋白质梯度的荧光强度呈线性增加。请点击此处查看该图的放大版本。

使用 BSA、PLL-PEG 阻断进行蛋白质图案化；荧光成像、强度图分析。
图 9：依次图案化多种蛋白质时的交叉结合效应。 （A–C，E–G）由荧光标记的纤连蛋白（青色，水平方向）和荧光标记的层粘连蛋白（洋红色，垂直方向）形成的 10 µm 宽条纹交叉图案。（A–C）使用 BSA 阻断缓冲液处理的样品。（E–G）使用 PLL-PEG 阻断非特异性结合位点的样品（步骤 7）。（A，E）合并的荧光通道图像，同时显示纤连蛋白和层粘连蛋白。（B，F）仅显示纤连蛋白的图像。（C，G）仅显示层粘连蛋白的图像。在 C 中，注意水平方向的纤连蛋白阳性条纹上也存在层粘连蛋白信号，这是由于 BSA 对未占据结合位点的阻断效果不佳所致。在 G 中，注意使用 PLL-PEG 阻断可有效防止层粘连蛋白结合到纤连蛋白条纹区域。（D，H）分别从 A 和 E 中所示位置（黄色对角线）测得的荧光强度分布图。请点击此处查看该图的放大版本。

带有层粘连蛋白、纤连蛋白、微管蛋白标签的 CAD 细胞和 DRG 神经元示意图；显微镜设置。
图 10：用于研究神经突/轴突导向的交叉图案。（A-C）由荧光标记的纤连蛋白（青色，水平方向）和荧光标记的层粘连蛋白（品红色，垂直方向）构成的 10 µm 宽条纹交叉图案。（A,B）神经突沿微图案生长的 CAD 细胞的荧光图像。为可视化神经突，细胞在 4% 多聚甲醛中固定 48 小时，并用微管蛋白抗体染色（A）或同时用微管蛋白和肌动蛋白染色（B）。（C）轴突沿微图案生长的大鼠背根神经节（DRG）神经元。为可视化轴突，DRG 神经元培养 72 小时后，用 4% 多聚甲醛固定并进行微管蛋白染色。请点击此处查看该图的放大版本。

纤维蛋白原荧光；显微镜图像中干燥的微孔，不连续、弥散的条带。
图11：使用LIMAP生成微图案时常见的阴性结果示例。（A-C）在不同条件下获得的10 µg/mL荧光标记纤维蛋白原（绿色）的次优条带图案。（A）在图案生成过程中微孔干燥。注意背景中存在高水平的荧光信号（箭头）以及PBS晶体（星号）。（B）软件设置过程中条带之间的拼接未正确调整，导致条带不连续，在设计单元之间出现间隙（箭头）（参见步骤3.4.7）。（C）激光聚焦不佳，导致条带弥散（箭头），不能反映图案模板的实际条带宽度，从上到下应分别为20、10、5、2 µm，如（B）所示。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

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LIMAP（PRIMO）微图案化技术的优势及其与微接触印刷的比较
尽管微接触印刷可能是生物领域中最常用的微图案化技术39，但越来越多的研究人员正在采用LIMAP技术40,41,42,43,44。本文介绍了一种使用PRIMO（一种 commercially available 的LIMAP系统）的实验方案。以下简要讨论微接触印刷与LIMAP光图案化技术的潜在优势与局限性。

微接触印刷需要使用光刻模板，该模板通过在玻璃或硅晶片上旋涂光刻胶（通常为SU-8）并用激光蚀刻出所需的微结构而制成。这些模板用作制造PDMS印章的模版45。将选择的蛋白质与印章孵育，使蛋白质吸附于其表面，然后将印章转移（压印）到细胞培养皿上。蛋白质在PDMS印章上的吸附过程依赖于蛋白质浓度、缓冲液和孵育时间。为了获得最佳结果，这些参数需在实验前进行优化测试46。

如果保存得当，母版可用于大量实验，持续数月甚至数年。然而，该技术的一个限制因素是，每次需要进行修改时都必须重新设计新的光刻母版。实验设计的变更可能导致新母版的制备耗时较长（长达数周），从而延误实验进程。相比之下，LIMAP光图案化技术无需物理母版，而是使用软件生成的图案模板，能够灵活地根据变化的研究需求调整微图案的几何形状。LIMAP还可用于在同一微图案内生成蛋白质浓度梯度（图8），而使用微接触印刷技术则难以以可重复的方式实现这一目标47。

此外，本研究中采用LIMAP技术实现的微图案分辨率为2 µm（图6B）。

接近该分辨率时，图案内部及图案之间的变异性增加。生成宽度在10 µm左右或更大的图案具有高度可重复性（图6G,H）。相反，使用微接触印刷技术难以稳定获得低于10 µm的分辨率，在转印微小特征时常常出现伪影（数据未显示）。

我们已证明，LIMAP 可用于在同一微孔内对多种蛋白质进行微米级图案化（图9），从而为实验引入更高层次的复杂性。尽管微接触印刷技术也可实现该目的，但以高精度对齐不同蛋白质在技术上具有较大挑战性。虽然使用 LIMAP 对多种蛋白质进行图案化看似直接简便，但需要指出的是，通过连续包被步骤可能导致蛋白质之间的交叉结合，尽管使用封闭试剂可降低该现象，却无法完全消除（图9）。

关于两种技术的成本，此处所述的LIMAP技术需要购买微图案化设备（PRIMO），该设备可安装在不同的荧光显微镜上，并需配备电动载物台。尽管初期投资成本较高，但长期来看，LIMAP仅需购买耗材（模板、PEG和PLPP），无需其他额外支出。或者，实验人员也可根据已发表的方案在实验室自行制备PDMS模板18,32。微接触印刷技术的最大成本可能来自新母版的制作，若实验需要设计新的图案，相关费用可能显著增加。

LIMAP 的一个缺点是该技术通量相对较低。与 LIMAP 所需的逐次激光微加工相比，微接触印刷可通过一次同步压印快速高效地生成大量微图案。例如，使用 PDMS 印章进行微接触印刷可在约 2 小时内制备 6 个带有微图案的玻璃盖玻片（不包括印章制备时间）；而使用 LIMAP 对类似面积（6 孔板）进行图案化则需要约 4 小时（不包括表面钝化步骤，参见步骤 5.12 中描述的图案模板配置，并见图 5B）。

LIMAP 技术的另一个限速因素是大面积图案化所需的长时间照射（使用 7.5 mW/mm2 激光时，每个设计单元需 30 秒）。在此类情况下，微接触印刷可能是更优选的方案。一种新近可用的光引发剂（PLPP 凝胶，材料表）应能显著缩短图案化所需时间，仅需几分钟即可在大面积（最大达 8 mm2）上生成数百个微图案。

在为细胞培养进行表面微图案化时，另一个需要考虑的重要因素是不同实验重复之间微图案的可重复性，并与微接触印刷技术所获得的变异性进行比较。例如，图7B,D 中所示的图表代表了三次独立实验重复的典型数据，结果非常相似（数据未显示）。根据我们的经验及以往发表的研究，使用微接触印刷技术很难达到此种水平的可重复性48,49,50,51,52。

与其他需要专门化学方法来设计光敏材料或使用通常生物相容性较差的光敏剂的光图案化技术相比3，LIMAP 中的光敏组分（PLPP）具有良好的生物相容性，并且细胞耐受性优异21；在我们的实验中，包括 CAD 细胞、背根神经节神经元（图 10）、成纤维细胞、上皮细胞以及黑色素瘤细胞在内的多种细胞均未表现出任何细胞毒性（数据未显示）。与其它光图案化技术相比，使用 PRIMO 进行 LIMAP 的另一优势在于无需使用光掩膜。与微接触印刷类似，每种期望的图案都需要重新设计和制备新的光掩膜。

上述提到的微接触印刷技术的所有局限性均指该技术的手动操作方式。然而，通过使用具有印模负载和压力控制功能的自动化设备，可以提高微接触印刷的通量和可重复性53。

使用 PRIMO 进行 LIMAP 实验的关键步骤及问题解决
在本实验方案中常见的问题之一是微图案内出现较高水平的背景荧光。这通常是由于微孔体积较小，容易发生干燥所致。当出现这种情况时，PBS 晶体常会出现在细胞外基质（ECM）图案周围（图 11A）。

蛋白质孵育后洗涤步骤不足或效率低下，也可能导致背景荧光水平过高。尤其在使用浓度为 10 µg/mL（图 11B）或更高的蛋白质时，这一现象更为明显。通过增加 PBS 洗涤步骤，可减少背景中的过量蛋白质。

每次实验中均需测量并表征蛋白质背景信号，通过计算背景荧光强度（图6E），并从微图案信号强度中扣除该值（图6F-H 和 图7B,D）。过高的蛋白质背景可能影响CAD细胞的贴附与出芽，从而干扰实验结果的解读。

当用户经验有限时，在设计单元之间出现间隙是一个常见问题（图11B），这是由于图案之间重叠不足所致。在 Leonardo 软件中可调节两个参数来克服此问题：1）根据图案设计，可能需要设置列之间的负间距（步骤 5.7，参见 图5B,C）；或者，2）使用 Expert 菜单中的梯度选项来拼接各列。可通过使用紫外光固化胶（材料表）进行快速测试，以确定最佳的间距参数。测试时，在载玻片上滴加少量该胶，然后覆盖盖玻片形成薄膜。使用低激光剂量（30 mJ/mm2）按照目标图案模板对嵌入的紫外光固化胶进行光刻图案化。经紫外光照射的胶体区域将发生固化，在明场显微镜下可见。通过观察测试结果，评估所获得的图案内间距效果。在我们的神经元实验中，条带之间的间隙可能对细胞行为产生不利影响，导致生长动态发生变化（如生长速度减慢或路径被放弃）。

在 Leonardo 软件的最新更新版本中（截至发表时为 Leonardo 4.11），可上传先前设计的更大图案模板，其覆盖微孔表面的面积远大于当前每个设计单元的 0.1 mm2（使用 20 倍物镜时最大可达 8 mm2），从而无需再拼接多个较小的设计单元。在图案生成过程中，若未进行激光聚焦调整，可能导致边缘模糊不清（图 11C）。因此，在进行图案化之前，校准激光并执行参考图案步骤（见步骤 4）至关重要。条纹边界不清晰会导致条纹宽度出现变异，使轴突生长动态与条纹宽度之间的相关性难以分析。此外，轴突也倾向于偏离边缘扩散的条纹。当打印宽度为 10–20 µm 或更宽的条纹时，边缘不均一性同样可能出现，导致图案边缘区域的蛋白含量高于中央区域（图 6B,D）。这种边缘效应源于光图案化过程中光引发剂扩散不均。光裂解反应依赖于氧气，而氧气在边缘区域扩散更为显著。在光图案化过程中，可通过移液器在微孔内混合光引发剂以均一化其分布，从而减轻该边缘效应。此外，一种新上市的商用光引发剂（PLPP 凝胶）也可有效降低边缘效应（PRIMO 系统支持团队，个人交流）。

多种蛋白质的微打印可能导致交叉结合（图9A-D）。通过提高阻断效率，可在两种不同蛋白质孵育步骤之间占据非特异性结合位点，从而最大限度地减少交叉结合。蛋白质的交叉结合可能影响实验结果的可重复性，并可能导致对数据的误读，因为难以确定每种蛋白质对轴突生长动态及其他细胞行为的各自贡献。

结论
我们希望本实验方案中提供的使用LIMAP的方法能够借助PRIMO系统促进蛋白微图案的制备。尽管本方案主要关注如何在二维玻璃表面可靠地生成微图案，但已有研究显示，LIMAP也可用于软质基底的微图案化54，以及用于三维培养的微结构表面42。这些微图案可作为一种多功能工具，用于研究细胞对其微环境变化的响应。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作由英国生物技术和生物科学研究理事会（BBSRC）、工程和物理科学研究理事会（EPSRC）、医学研究理事会（MRC）以及惠康信托基金（Wellcome Trust）资助。C.B. 实验室隶属于曼彻斯特大学惠康信托细胞-基质研究中心，该中心由惠康信托基金的核心资金支持（资助编号 088785/Z/09/Z）。作者感谢生物技术和生物科学研究理事会（BBSRC）向 C.M.、K.J.（项目编号 BB/M020630/1）和 P.A.（项目编号 BB/P000681/1）提供的经费支持，以及工程和物理科学研究理事会（EPSRC）和医学研究理事会（MRC）再生医学博士培训中心向 A.K.（项目编号 EP/L014904/1）提供的资助。作者感谢 Alvéole 公司的沟通协助及其售后支持团队。作者感谢曼彻斯特大学生物成像设施中心的 Peter March 和 Roger Meadows 在显微成像方面提供的帮助。本研究所使用的生物成像设施中心的显微镜由 BBSRC、惠康信托基金以及曼彻斯特大学战略基金的资助购得。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Alexa 488 蛋白标记试剂盒InvitrogenA10235工作浓度：N.A.
Alexa 647 蛋白标记试剂盒InvitrogenA20173工作浓度：N.A.
CAD 细胞ECACC8100805工作浓度：N.A.
偶联的纤维蛋白原-488Molecular ProbesF13191工作浓度：10 μg/ml
DMEM 培养基Gibco11320033工作浓度：N.A.
落射荧光显微镜**NikonEclipse Ti 倒置显微镜工作浓度：N.A.
纤连蛋白SigmaF4759工作浓度：10 μg/ml
（使用 Alexa 488 蛋白标记试剂盒标记后，见上文）
（用 PBS 稀释）
Fiji-Image Jwww.imagej.nih.gov版本 2.0.0-rc-54/1.51f工作浓度：N.A.
荧光高亮笔StabiloStabilo Boss Original工作浓度：N.A.
HEPESGibco15630080工作浓度：1M
Inkscape 软件Inkscape查看最新更新工作浓度：N.A.
层粘连蛋白-红色荧光罗丹明Cytoskeleton, Inc.LMN01工作浓度：10 μg/ml
（用 PBS 稀释）
Leonardo 软件Alvéole版本 4.11工作浓度：N.A.
L-谷氨酰胺SigmaG7513工作浓度：1%
Micro-manager 软件Open imaging查看最新更新工作浓度：N.A.
电动 x/y 载物台PRIOR ScientificProscan II工作浓度：N.A.
NIS Elements 软件NikonNIS Elements AR 4.60.00 64 位（含 Nikon 任务）工作浓度：N.A.
PBS（不含 Ca2+, Mg2+）SigmaD8537工作浓度：1X
PDMS 模板Alvéole访问 www.alveolelab.com工作浓度：N.A.
PEG-SVALaysan bio, Inc.MPEG-SVA-5000-1g工作浓度：50 mg/ml
鬼笔环肽 405Abcamab176752工作浓度：1:1000
光引发剂（PLPP）AlvéoleClassic PLPP工作浓度：14.5 mg/ml
光引发剂（PLPP 凝胶）AlvéolePLPP gel工作浓度：4.76% 乙醇稀释液
等离子清洗仪Harrick PlasmaPDC-32G (115V) | PDC-32G-2 (230V)工作浓度：N.A.
PLL-PEGSuSoS（亦由 Alvéole 分销）www.alveolelab.com工作浓度：0.1 mg/ml（用 PBS 稀释）
聚-L-赖氨酸SigmaP4707工作浓度：0.01%
Primo 设备Alvéolewww.alveolelab.com工作浓度：N.A.
青霉素-链霉素（Pen/Strep）Thermo Fisher15140122工作浓度：1%
微管蛋白抗 α 抗体AbcamDM1A工作浓度：1:1000
CAD 细胞
微管蛋白抗 β3 抗体SigmaT8660工作浓度：1:500
DRG 神经元
紫外胶Norland ProductsNOA81工作浓度：N.A.
1 孔玻璃底培养皿CellvisD35-20-1.5-N工作浓度：N.A.
6 孔玻璃底培养皿CellvisP06-20-1.5-N工作浓度：N.A.
20x 物镜**Nikon无相差环（查阅最新目录）工作浓度：N.A.
**落射荧光显微镜：图像采集和图案生成在 Eclipse Ti 倒置显微镜（Nikon）上完成，该显微镜耦合 PRIMO 微图案化设备（Alvéole），使用 20x 物镜（0.75 S Plan Fluor（无相差环，Nikon））。使用 Nikon 专用的 GFP、mCherry 和 Cy5 滤光片组，荧光光源为 LED（Lumencor），尽管也可使用其他荧光光源和滤光片组。显微镜配备自动 x/y 载物台（PRIOR Scientific），用于多视野图案打印，并配有 Nikon Perfect Focus 以防止焦漂。图像由 Retiga R6（Q-Imaging）相机采集。

参考文献

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