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方法文章

一种用于评估小鼠肝细胞核多倍性的高通量原位方法

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DOI：

10.3791/60095

⸱

2020年4月19日

 ,  ,  , 
1Centro de Investigación Príncipe Felipe (CIPF), 2Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge, 3Centro de Investigación Biomédica en Red de Diabetes y Enfermedades Metabólicas Asociadas (CIBERDEM)

本文内容

摘要

我们提出一种稳健、经济且灵活的方法，用于检测固定或冷冻保存的组织样本中肝细胞数量和细胞核倍性的变化，该方法无需流式细胞术。本方法可提供理想的全样本肝脏细胞学特征，适用于追踪肝损伤和肝脏疾病的进展过程。

摘要

肝脏受损时，肝细胞数量减少，而细胞大小、细胞核大小和倍性增加。胆管上皮细胞、肌成纤维细胞、前体细胞和炎性细胞等非实质细胞的扩增也提示存在慢性肝损伤、组织重塑及疾病进展。在本方案中，我们描述了一种简单且高通量的方法，用于计算与肝损伤、慢性疾病及癌症相关的肝脏细胞组成变化。我们展示了如何利用二维（2D）组织切片中提取的信息，对样本中肝细胞核的倍性进行定量和校准，并使用户能够在原位定位肝脏中特定倍性的细胞亚群。本方法仅需固定或冷冻的肝组织材料、基本的免疫细胞化学试剂以及任何标准的高内涵成像平台。该方法可作为传统流式细胞术的有力替代方案，后者需要破坏新鲜采集的组织，导致空间信息丢失，并可能引入解离偏差。

引言

哺乳动物肝脏中的肝细胞可通过胞质分裂受阻产生双核细胞，并通过DNA内复制产生含有高达16N DNA含量的多倍体细胞核。总体细胞和细胞核的倍性在出生后发育、衰老以及应对多种细胞应激过程中逐渐增加1。多倍体化过程具有动态性和可逆性2，但其确切的生物学功能尚不明确3。倍性升高与增殖能力下降4、遗传多样性增加2、对慢性损伤的适应5以及癌症防护6相关。肝细胞倍性的改变可由昼夜节律紊乱7和断奶8引起。尤为显著的是，肝脏的倍性谱在损伤和疾病状态下会发生改变9，有力的证据表明，特定的倍性变化（例如≥8N细胞核增加或2N肝细胞减少）可作为追踪非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）进展3,10或不同病毒感染影响的有用标志11。

总体而言，肝损伤与再生通常伴随着肝细胞体积和核面积的增大12，以及肝细胞总数的减少，尤其是具有2N DNA含量的肝细胞10,11。肝脏实质损伤还常伴随非实质细胞（NPCs）的扩增，包括间质肌成纤维细胞、炎症细胞和双潜能肝前体细胞。因此，能够定量分析实质细胞数量和细胞核倍性，同时兼顾非实质细胞变化的高通量方法，在研究和临床中具有重要潜力，可用于追踪肝脏在损伤和疾病过程中的反应。近期对肝细胞癌人源样本中倍性谱系的原位分析也有力地表明，肿瘤内细胞核倍性显著升高，且在分化程度较低、TP53缺失的更具侵袭性的肿瘤亚型中尤为明显13。因此，核倍性定量评估方法的进展有望在未来肝癌的预后分型中发挥重要作用。

本方案描述了一种用于小鼠肝组织切片比较分析的灵活高通量方法，可对肝细胞数量、非实质细胞（NPC）反应进行详细的细胞计量分析，并提供一种内部校准的方法用于估算细胞核倍性（图1）。在对细胞核大小和核形态进行表征之前，通过肝细胞核因子4α（HNF4α）免疫标记将肝细胞与非实质细胞（NPC）区分开来。"最小DNA含量"通过整合Hoechst 33342平均荧光强度（作为DNA密度的替代指标）与插值计算的三维（3D）细胞核体积，对所有圆形核掩膜进行估算。随后利用非实质细胞（NPC）对肝细胞的最小DNA含量进行校准，从而生成细胞核倍性分布图谱。

图像采集、核分割和图像分析通过高内涵成像技术完成，可对包含数万个细胞的二维（2D）肝组织切片的大面积区域进行筛查。提供一个自行编写的程序，用于对高内涵图像分析数据进行自动化后期处理，以生成涵盖所有圆形肝细胞核的全样本倍性图谱。该分析采用可免费下载的软件，基于立体学图像分析（SIA）计算细胞核倍性。10,11,14,15SIA 方法此前已通过流式细胞术验证，是一种准确但较为费力的肝脏肝细胞核多倍体评估方法14，假设细胞核形态为圆形，且核大小与DNA含量之间存在单调关系。在本方案中，这两个核参数通过核形态测量和Hoechst 33342染色标记进行测定。通过计算 "最小DNA含量" 对每个细胞核掩膜进行校准，以确定肝细胞核的倍性，使用已知为2−4N的NPCs DNA含量，因此可作为有用的内参对照。

与传统的流式细胞术方法16相比，本文所述方法能够在原位评估肝细胞核的倍性，且无需获取新鲜组织或使用可能产生结果偏差且难以标准化的组织解离方法。与所有基于图像分析（SIA）的方法一样，由于较大细胞核在非赤道面切片时被截断，二维取样会导致核倍性亚群>2N 的比例被低估。该组织范围内的倍性分析结果还提供了所有圆形肝细胞核掩膜的最小DNA含量，但无法直接区分单核肝细胞与具有两个独立（"不接触"）且倍性相同的双核细胞。然而，本实验方案的简便性为其进一步改进提供了较大空间，例如引入核间距或细胞周长分析等额外参数，从而有助于识别双核细胞，实现对细胞倍性的更精确评估。

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方案

所有动物实验此前均已获得 CIPF 伦理委员会的批准。小鼠饲养于费利佩王子研究中心（西班牙瓦伦西亚）的无病原体设施中，该中心注册为实验动物繁育、使用和供应单位（注册号：ES 46 250 0001 002），并遵守现行的欧洲和西班牙动物福利法规（RD 53/2013）。

1. 组织采集与样品制备

注意：本方案描述了在无需预先固定或冷冻保存的情况下冻存组织的方法。对于已固定或已冷冻保存的样品，请直接进入第2节并省略步骤3.1。所有分析均使用12至16周龄的成年雌性C57BL/6小鼠进行。

  1. 通过腹腔注射芬太尼/戊巴比妥钠后行颈椎脱位处死动物。将小鼠仰卧放置，用镊子夹住皮肤，使用手术剪从下腹部基部至胸骨基部做垂直切口，打开腹腔并暴露肝脏。
  2. 使用精细镊子小心移除胆囊，分离肝脏，并将选定的肝叶在盛有磷酸盐缓冲液（PBS）的10 cm培养皿中冲洗。
    注意：建议对每只动物比较相同的肝叶，本实验中使用的是中叶。
  3. 在室温（RT）下，将适量的组织冷冻包埋剂（OCT）加入已标记的冷冻模具中。避免产生OCT气泡。若出现气泡，可用针头或移液器吸头将其推至模具边缘。
  4. 将肝叶放入装有OCT的冷冻模具中，并立即置于干冰上以确保快速冷冻。冷冻模具储存于-80 °C，直至进行冷冻切片。

2. 冷冻切片

  1. 将冷冻模具置于干冰上运输，以避免组织降解。在冷冻切片前，将模具置于设定为 -20 °C 的冷冻切片机内平衡 20 分钟。
  2. 通过向塑料冷冻模具底部施加压力来推出样品。在室温下将液态 OCT 包埋剂滴加至预热的样品盘上，将其置于冷冻切片机中，并贴附一块 OCT 包埋的肝组织样品。轻轻按压，等待 3 分钟，使 OCT 完全冻结，确保样品牢固粘附于样品盘上。
    注意：应尽可能避免用手直接接触样品，以防组织降解。
  3. 将样品固定在冷冻切片机的持样臂上，并调整其方向，使样品边缘与切片刀平行。开始切削直至暴露组织。
  4. 以 6 µm 厚度对样品进行切片。将标记好的聚酰胺涂层载玻片覆盖在切片上约 5 秒，使切片粘附于载玻片。将载玻片置于室温下 3−5 分钟后，为获得最佳结果，应立即进入第 3 节操作。
    注意：对于多个新鲜冷冻样品的处理，已证实可将载玻片暂时存放在干冰上的玻片盒中，待所有样品处理完毕后再统一进行后续操作。若采用此方法，需在进入第 3 节前让所有载玻片恢复至室温。也可使用福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样品，但该方法会增加背景自发荧光。若使用 FFPE 样品，应以 4 µm 厚度切片，并通过在 40 °C 水浴中将切片转移至经聚酰胺处理的载玻片上进行贴片。将载玻片在 60 °C 下加热 1 小时，随后在 Coplin 染色缸中依次于室温下进行洗涤（每次 5 分钟）：二甲苯（2 次）、100% 乙醇（2 次）、96% 乙醇（2 次）、70% 乙醇（1 次）和 dH2O（1 次），以完成脱蜡。为暴露抗原，将载玻片置于柠檬酸缓冲液中 90 °C 处理 20 分钟，随后在室温下用 PBS 平衡。然后进入步骤 3.2。

3. 荧光免疫标记

  1. 在通风橱中，向组织切片加入1 mL含4%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液，室温固定10分钟。将玻片转移至盛有PBS的考普林瓶中，轻轻振荡洗涤3分钟（重复3次）。
    注意：从此时起直至免疫染色过程结束，应避免样本干燥。
  2. 用疏水笔干燥并圈出每个组织切片周围的区域。使用含0.5%非离子型表面活性剂（如Triton X-100）的PBS溶液，室温透化处理15分钟。随后在盛有PBS的考普林瓶中轻轻振荡洗涤3分钟（重复2次）。
  3. 使用过滤后的封闭液（含1%牛血清白蛋白（BSA）、5%马血清和0.2%非离子型表面活性剂的PBS溶液）在室温下封闭至少1小时。
  4. 在避光湿盒中，加入用封闭缓冲液稀释的一抗HNF4α抗体，4 °C孵育过夜（抗体种类及具体稀释比例见材料表）。
  5. 将玻片放入盛有PBS的考普林瓶中，轻轻振荡洗涤3分钟（重复4次）。
  6. 在避光湿盒中，加入用含0.2%非离子型表面活性剂的过滤PBS溶液稀释的Alexa-488标记的二抗和Hoechst染料（含1% BSA），室温孵育2小时（抗体种类及具体稀释比例见材料表）。
  7. 将玻片放入盛有PBS的考普林瓶中，轻轻振荡洗涤3分钟（重复4次）。再用ddH2O轻轻振荡洗涤3分钟（重复2次）。
  8. 在盖玻片（24 × 60 mm）上滴加两滴荧光封片剂，将玻片覆于其上，轻压以排除气泡。如需长期保存，用透明指甲油封固盖玻片边缘，并于4 °C避光保存。
  9. 继续实验前，使用常规荧光显微镜检查玻片，确保固定和免疫标记效果良好。
    注意：预期结果参见图2A,B。

4. 荧光图像采集

注意：此步骤需要支持自动荧光图像采集的高内涵成像平台（材料表）。

  1. 启动成像系统并打开一个新的采集程序。
  2. 选择10倍物镜，记录视野面积（本例中为0.6 mm2）。
  3. 设置参数以使用适当的激发和发射滤光片采集荧光图像（如步骤3.6所述）。对于Hoechst和Alexa-488，分别选择“DAPI”和“GFP”通道，激发波长为390/18 nm和438/24 nm，发射波长为432.5/48 nm和475/24 nm。
  4. 对样本进行调焦，并确保信号强度未达到饱和。确保所有图像以相同的曝光时间进行采集，或使用能够根据曝光时间校正荧光强度的系统。
  5. 扫描样本并采集足够的图像，以完全覆盖组织切片区域（约20−50个视野，具体数量取决于样本大小）。
  6. 检查图像数据库，手动剔除：(i) 焦距不佳的视野，(ii) 位于每个组织切片边缘的视野（以避免对细胞密度计算产生偏差），以及(iii) 包含折叠或物理损伤区域的视野（如存在此类情况）。

5. 自动化荧光图像分析

注意：此步骤需要具备适当图像分析软件（材料表），该软件需能够：（1）在405 nm波长下自动识别图像中Hoechst标记的细胞核（细胞核分割）；（2）评估Hoechst细胞核荧光平均强度及形态学参数；（3）进行阈值分析，以确定488 nm波长下细胞核荧光（HNF4α）的阳性/阴性状态。操作者需具备一定的基础培训或专业知识，能够在软件中目视评估并调整分割和阈值参数，以确保细胞核及HNF4α阳性/阴性状态得到最优的界定（图2）。

  1. 在图像分析软件中，打开包含来自步骤 4.5 的 Hoechst（405 nm）和 HNF4α（488 nm）图像的采集文件，并创建一个新的分析方案。
  2. 定义用于核分割（Hoechst，405 nm）和肝细胞/非实质细胞阈值分析（HNF4α，488 nm）的波长。
  3. 调整软件的核分割参数（如“最小核面积”和核检测“灵敏度”），以确保细胞核被最优地分离。
    注意：应优先优化肝细胞的分割效果，而非非实质细胞。肝细胞核通常呈圆形（四分位大小范围：40−64 µm2）。非实质细胞核（如窦状内皮细胞核）则呈扁平/椭圆形或不规则形状，通常比肝细胞核更小且排列更紧密（四分位大小范围：30−43 µm2）。对于小鼠肝脏，建议使用最小核面积 ≥23 µm2 和检测“灵敏度”65%（参见 图 2C,D 以了解预期结果）。灵敏度决定了基于像素簇强度将其识别为独立细胞核的方式，用户应在进行自动图像分析前，针对每组样本通过实验确定合适的灵敏度值。
  4. 调整 488 nm 波长下的阈值强度，以确保肝细胞（HNF4α+）与非实质细胞（HNF4α-）的最优区分。
    注意：参见 图 2C,D 以了解预期结果。阈值强度为相对值，取决于染色效率和采集设置（如激光强度），因此应由用户进行标准化。可使用已知 HNF4α- 的细胞（如内皮细胞和门脉周围非实质细胞）作为内部阴性对照，双核肝细胞核作为染色阳性的参考标准。在将分析参数应用于整个数据集之前，应先使用少量图像测试分析参数，以确保良好的核分割和强度阈值分离效果。
  5. 选择以下核参数进行量化：（1）基于 Hoechst 染色的核面积（µm2）；（2）核内平均 Hoechst 强度（RU）；（3）核伸长因子（核短轴与长轴的平均比值，中心对称[非伸长]物体的值为 1）；（4）Nuc 1/(形态因子)，即通过周长²/(4π × 面积) 计算的平均核“圆度”指数，数值范围为 1 至无穷大，其中 1 表示完美圆形；（5）HNF4α 状态（阳性-1 或阴性-0）；（6）基于“重心”（cg）的核 x/y 坐标，该方法可从灰度图像中以亚像素精度定位物体中心。
  6. 对所有样本数据集运行分析，并将步骤 5.5 中的数值数据导出至电子表格软件。

6. 数据分析

注意：数据分析步骤可以使用任何标准的电子表格软件进行。

  1. 计算肝细胞和非肝细胞数量。
    1. 通过将视野数量乘以单个视野的面积（步骤4.2），计算每个样本所分析肝组织切片的总面积。
      静态平衡；公式：分析的总面积（A）=视野数量×单个视野面积。
    2. 使用为每张肝组织切片生成的电子表格文件，通过仅选择HNF4α+细胞核来筛选数据。计算所分析的HNF4α+细胞核总数，并将其除以所分析的总面积，以获得每个样本的平均肝细胞密度（图2F).
      图示平均肝细胞密度计算公式，显示HNF4α阳性细胞核在面积A范围内的计算方法。
    3. 对非实质细胞，通过筛选 HNF4α- 细胞的电子表格执行相同的计算（图2E).
  2. 计算肝细胞核大小分布。
    1. 使用电子表格软件筛选数据，仅选择 HNF4α+ 细胞核。
    2. 将核面积的数值绘制成直方图（图2G）。将组距设为 5 µm2.
      注意：频率值可按面积进行校正（nuclei/mm2按照步骤 6.1.1 进行
  3. 进行肝细胞核多倍体分析。
    注意：步骤 5.6 中的电子表格数据用于生成每个样本的细胞核倍性图谱。该过程已实现自动化，可使用一款定制软件完成，该软件可免费下载，并附有支持信息和示例数据集，获取地址为 https://github.com/lukeynoon （参见 补充文件）。为希望调整该方法的用户提供了源代码。以下概述了算法的描述以及安装和使用说明。该程序利用电子表格数据，自动将肝细胞核分为两组：（1）具有“简单”圆形细胞核的细胞，以及（2）代表双核细胞的“复杂”非圆形细胞核 >2c 倍性。接下来针对所有“简单”细胞核计算其最小核DNA含量（由核面积和DNA密度决定的函数）。随后的步骤则自动利用 HNF4α- 细胞核作为已知的2−4N内部对照，校准 HNF4α+ 肝细胞核的倍性。
    1. 下载并安装软件。
      1. 从以下地址下载打包的应用程序： https://github.com/lukeynoon
      2. 启动 MATLAB。导航到功能区的 APP 选项卡，点击 安装应用程序 并打开下载的应用程序，名为“Ploidy_Application.mlappinstall 将出现一条消息，以确认安装成功。
        注意：该应用程序现已可使用，并将保留在工具栏的“APP”选项卡中。
    2. 格式化输入数据。
      注意：在进行自动化的细胞核倍性分析之前，所有包含高内涵成像数据的电子表格文件（步骤 5.6）应按照以下说明进行存储和格式化。
      1. 在步骤 5.6 导出的每个数据文件（.XLS 97-2004 工作簿）中，均需包含一个名为“细胞测量值”的工作表，其中以列的形式包含进行倍性分析所需的所有数据图3A）。确保电子表格的布局（包括列标题名称）与原始格式保持不变 图3A，因为分析方法通过搜索这些名称来找到正确的列数据（参见演示数据集） 补充文件 （供参考）。例如，如果高内涵图像分析软件未生成“Light flux”列（图3A)，在相同位置即 K 列手动插入“光通量”列，并用零填充。
      2. 对于每个实验条件（例如“Injured-d14”），需提供一个对照数据集，用于计算2−4N核倍性校准的内部对照（步骤6.3.4.3）。此处选择未处理的成年同窝肝脏样本（“Control-d0”）； 图3B−D).
      3. 对于每个条件的生物学重复，将每个电子表格存储在单独的文件夹中（如 图3B）。根据文件夹内包含的文件名，将文件夹前缀依次命名为“Sample1、Sample2、Sample3… SampleN”。因此，每个数据集文件夹（例如“Control-d0”）应包含一系列子文件夹（“Sample1”、“Sample2”等），每个子文件夹中包含一个与之同名的电子表格文件。
    3. 运行应用程序。
      1. 在 MATLAB 中，通过点击功能区“我的应用程序”选项卡内的图标来启动“Ploidy_Application”图3C）。Ploidy_Application 的图形用户界面（GUI）将出现（图3C).
      2. 点击 控制数据的路径 按钮以导航至对照数据重复样本所在的文件夹（例如，“Control-d0”）。该数据路径将显示在界面中（例如， /Users/Desktop/Control-d0).
      3. 接下来，在“文件夹前缀”中输入输出文件的名称（例如，“Sample”）。
        注意：该前缀可更改为任意文本，只要文件夹和文件名保持递增命名即可。
      4. 点击 通往其他数据的路径 按钮并导航至包含比较数据重复样本的文件夹（例如，“Injured-d14”）。该数据路径将显示在界面中（例如， /用户/桌面/损伤-14天).
      5. 点击 跑！分析完成后，状态栏将显示“分析完成！”。
        注意：该应用程序将针对每个样本报告“简单”细胞核在绝对计数以及占总数百分比方面的分层情况，分为 ≤2n、2n−4n、4n−8n 和 8n+图3D）。这些文件将自动保存在每个样本文件夹中，文件名为：Count_2n.txt", "Count_2n_to_4n.txt, Count_4n_to_8n.txt, Count_8n_and_higher.txt, “Percentage_2n.txt”, “Percentage_2nto4n.txt”, “Percentage_4nto8n.txt”, “Percentage_8n_and_higher.txt”该Ploidy_Application将自动保存每个样本的列表，其中包含所有“简单”肝细胞和非肝细胞细胞核的单个倍性估计值 Ploidy_All_Hepatocytes.txt 和 非肝细胞倍性.txt。对于对照数据集，该方法还会将用于倍性分层的最小DNA含量阈值（见步骤6.3.4.3.7）保存在一个名为 归一化阈值对照最后，该程序将为对照组和选定的比较组数据生成一个名为“Summary”的文件夹。此文件夹包含两个子文件夹：“Ploidy”和“Stratification”，其中分别包含所提供所有样本的平均值图3D).
    4. 方法学描述。
      注意：以下部分详细描述了核倍性分析软件所采用的方法学。如果用户选择不使用该应用程序，可使用电子表格软件遵循这些步骤手动计算核倍性谱型。
      1. 根据核形态计量学将细胞核分为“简单”或“复杂”。
        1. 为所有细胞核计算“圆形度指数”，定义为细胞核“伸长因子”除以“Nuc 1/(形状因子)”，其中数值为1.0时表示完美的圆形。
          注意：“核伸长率”和“核1/（形状因子）”是衡量细胞核“圆形度”的两个独立指标，分别评估互补且无重叠的形态计量标准。前者测量物体的长轴和短轴，后者则比较物体周长与其面积之间的关系。为了加强本方案中所用核圆形度的定义，已将这两个测量值合并为一个单一的“圆形度指数”。此前采用所述方法估算核倍性时，仅使用了核伸长率这一参数。17尽管采用该方法获得了可接受的结果，但作者观察到，使用复合的“圆形度指数”可提高对单核和双核肝细胞中人工选定细胞核的区分能力（数据未显示）。
        2. 将圆形度指数 ≤ 0.8 的细胞核归类为“复杂”，其余 > 0.8 作为“简单”
      2. 估算所有“简单”细胞核的“最小”DNA含量（m）。
        1. 使用公式计算核半径（r）：
          核半径公式：$ r = \sqrt{\frac{\text{核面积}}{\pi}} $，方程。
        2. 使用球体体积公式计算细胞核体积（v）：
          核体积公式；V=(4/3)πr³；数学公式；核物理研究示意图
        3. 使用以下公式计算最小DNA含量（m）的相对值：
          最小DNA含量（m）公式；平均Hoechst荧光强度，方程；分子分析
      3. 使用NPC（HNF4α-）细胞核作为内部2−4N对照来校准数据集。
        注意：NPC 的 DNA 含量根据细胞周期状态而定，为 2−4N。因此，NPC“最小”DNA 含量（NPCm）随着损伤而增加（图4A）。通过设定NPC的上限值，可将校准误差降至最低m 代表4c阈值（图4B).
        1. 在电子表格中，仅选择“m”值位于众数1个标准差（SD）范围内的NPC细胞核（此步骤可滤除可能由分割误差引起的噪声）。
        2. 在此筛选范围内，检查细胞核区域及其对应的平均 Hoechst 荧光强度（图4C).
        3. 在该过滤范围内，根据最大细胞核Hoechst荧光强度估算最小的细胞核面积（即在过滤数据集中曲线方向发生改变的点，如红色圆圈所示） 图 4C）。该值代表一个高于2N−4N过渡态（t）的状态，在此状态下，4c细胞核的取样多于2c细胞核，导致Hoechst平均荧光强度达到峰值。
          注意：该值由软件自动确定；但电子表格用户可手动选择此点作为过渡尺寸。
        4. 计算此过渡尺寸所代表的最小DNA含量（tm) 按照步骤 6.3.4.2 进行
        5. 估算NPC的4N肩部m 数据集，将 t 的值加上 1 个标准差m. 得到的数值（图4B) 描述了用于核倍性分层的NPC最小DNA含量的上限（S4c).
        6. 对所有“对照”样本重复步骤 6.3.4.3.1−6.3.4.3.5。
          注意：例如，在 图3未受伤的对照肝脏（“Control-d0”）用作对照条件。
        7. 计算平均4c分层阈值（S4c）用于“对照”样本，并利用此值外推2c（S2c）和 8c（S8c) 最小DNA含量（m）的边界。分层阈值由软件自动生成并存储（步骤6.3.3.3）。
          注意：根据研究设计的不同，平均分层阈值可针对每种条件或特定条件（例如，健康对照肝脏）进行计算。然而，核倍性分析软件要求将一组2个文件中的其中一个指定为“对照”，以便计算相对倍性值。
        8. 使用S计算所有细胞核的倍性值2c 步骤 6.3.4.3.7 中生成的值，依据如下：
          用于计算最小DNA含量的倍性方程、数学公式、教学图示
        9. 将“简单”肝细胞（HNF4α+）细胞核按2c/4c/8c进行分层>根据以下标准将8c支架分为：“2c” HNF4α+ = p ≤ 2；“4c” HNF4α+ = 2 < p ≤ 4；“8c” HNF4α+ = 4 < p ≤ 8>8c“HNF4α+ = 8” < p.
        10. 为了重建倍性亚群的空间分布模式，需根据每个样本电子表格中对应的采集区域将核数据分开。然后利用相关的核x/y坐标（来自步骤5.5）在二维空间中绘制倍性亚群图5C).

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结果

本方法已用于通过给予小鼠含0.1% 3,5-二乙氧羰基-1,4-二氢巴比妥（DDC）的肝毒性饮食0−21天，来评估胆汁淤积性损伤对成年小鼠肝脏的影响17。长期DDC喂养可导致肝细胞损伤、倍性增加以及非实质细胞（NPCs）的门脉周围扩张。使用者应注意，核倍性可能存在小鼠品系和年龄依赖性的差异，所有分析均使用12−16周龄的成年雌性C57BL/6小鼠进行。

在完成HNF4α免疫标记（方案第3节）后，必须使用常规荧光显微镜检查所有切片，以确保固定和染色质量良好（图2A）。若Hoechst出现弥散或模糊现象，可能提示固定不充分或固定前样本已发生降解（图2B），此时应返回方案第2节，并缩短切片与固定之间的时间（步骤3.1）。在此阶...

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讨论

本文描述了一种高通量、高内涵的方法，用于分析小鼠肝脏组织重塑并评估肝细胞核的倍性。一旦熟悉实验流程，操作者可在3至5天内处理、成像并分析多个样本，生成大量可验证的数据集，从而提供肝脏健康状况的详细特征。由于样本制备方法简便，且分析的细胞数量和组织面积较大（平均每样本约14 mm2），结果具有高度稳健性和可重复性。图像采集与分析的自动化也消除了这些关键步骤中的人为误差和潜在偏倚。本方法的一项重要创新是利用非实质细胞（NPCs）作为内部倍性校准标准，从而能够在同一样本内及不同样本间相对评估肝细胞核的DNA含量。因此，加入HNF4α标记步骤是本方案相较于此前发表的二维方法3,12,22所具备的独特技术优势。相比之下，与三维重建工作流程18相比，本方法在技术上更为简便，劳动强度更低，且可能更具灵活性。

与流式细胞术这一精确方法相比，从二...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由西班牙MINECO政府资助项目BFU2014-58686-P（LAN）和SAF-2017-84708-R（DJB）支持。LAN获得了西班牙国家MINECO拉蒙-卡哈尔研究员项目RYC-2012-11700和瓦伦西亚自治区Plan GenT奖（Comunitat Valenciana, CDEI-05/20-C）的支持，FMN获得了瓦伦西亚自治区ValI+D研究生奖学金ACIF/2016/020的支持。RP谨此感谢Ewa K. Paluch教授提供的经费支持。我们感谢Alicia Martínez-Romero博士（CIPF细胞分析服务中心）在IN Cell Analyzer平台使用方面提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3,5-二乙氧羰基-1,4-二氢吡啶饮食（DDC）TestDiet1810704在LabDiet小鼠饲料5015基础上添加0.1% DDC的改良饲料
Alexa Fluor 488 标记的驴抗山羊IgG（H+L）InvitrogenA11055稀释比例1:500
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA7906
Leica CM1850 UV 冷冻切片机Leica biosystemsCM1850 UV组织切片
荧光封片介质DakoS3023
GraphPad PrismGraphPad SoftwarePrism 8用于数据绘图的统计分析软件
Hoechst 33342Sigma-AldrichB2261终浓度5 µg/mL
IN Cell Analyzer 1000GE Healthcare Bio-Sciences Corp高内涵细胞成像与分析系统
MATLABMathWorksR2019a用于核倍性自动分析的数据分析软件
显微镜盖玻片VWR International630-2864尺寸为24 × 60 mm
Microsoft Office ExcelMicrosoft电子表格软件
OCT包埋剂（Tissue Tek）Pascual y Furió4583
多聚甲醛Panreac AppliChem141451.121
免疫染色笔Sigma-AldrichZ377821-1EA笔尖宽度5 mm
多聚赖氨酸载玻片（Polysine显微镜载片）VWR International631-0107
兔多克隆抗HNF4α抗体Thermo Fisher ScientificPA5-79380稀释比例1:250（替代抗体）
兔多克隆抗HNF4α抗体Santa Cruz Biotechnologysc-6556稀释比例1:200（本研究中使用的抗体）
Tween 20Sigma-AldrichP5927

参考文献

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