免疫细胞衍生细胞外囊泡的表征及研究功能对细胞环境的影响

Summary

本报告强调了从微胶质或血液巨噬细胞分离细胞外囊泡（EV）的时间顺序要求。微胶质衍生的EV被评价为神经外生长的调节器，而血液巨噬细胞衍生的EV在体外检测中控制C6胶质瘤细胞入侵时被研究。目标是更好地了解这些EV功能作为免疫中介器在特定微环境中。

Abstract

中枢神经系统（CNS）的神经炎状态在生理和病理状况中起着关键作用。微胶质，大脑中的常驻免疫细胞，有时渗入骨髓衍生的巨噬细胞（BMDM），调节其微环境在中枢神经系统的炎症特征。现在人们承认，免疫细胞的细胞外囊泡（EV）种群充当免疫中介。因此，它们的收集和隔离对于识别其内容，但也评估其对受体细胞的生物影响也很重要。本数据强调了从微胶质细胞或血液巨噬细胞（包括超中心化和大小排除色谱（SEC）步骤中分离EV的时间顺序要求。非靶向蛋白组分析允许将蛋白质特征验证为EV标记，并特征为生物活性EV含量。微胶质衍生的EV也功能地用于神经元的主要培养，以评估它们作为中微子生长中免疫中介的重要性。结果表明，微胶质衍生的EV有助于促进体外微子的生长。同时，血液巨噬细胞衍生的EV在C6胶质瘤细胞的球体培养物中作为免疫中介器，结果表明这些EV在体外控制胶质瘤细胞入侵。本报告强调了评估EV介导免疫细胞功能的可能性，但也了解这种通信的分子基础。这种破译可以促进使用天然囊泡和/或体外制备治疗性囊泡，以模仿中枢神经系统病理学微环境中的免疫特性。

Introduction

许多神经病理学与神经炎症状态有关，这是一种日益被考虑的复杂机制，但由于免疫过程多种多样，并且依赖于细胞环境，因此仍难以理解。事实上，中枢神经系统疾病没有系统地涉及相同的激活信号和免疫细胞群，因此亲炎反应很难作为病理的原因或后果来评价。大脑常驻巨噬细胞称为"微胶质"，似乎在神经和免疫系统^{之间的接口1。}微胶质有一个骨髓起源，从原始造物病期间的蛋黄囊派生，以殖民大脑，而外周巨噬细胞从胎儿肝脏在决定性的造物形成过程中，成为外周巨噬细胞^2。微胶质细胞与神经元和神经元衍生的胶质细胞（如星形细胞和寡^核糖3）通信。最近的几项研究表明，微胶质在中枢神经系统发育和成人组织平衡过程中，以及与神经退行性疾病^44、55相关的炎症状态中，都涉及神经元可塑性。否则，血脑屏障的完整性可能会在其他中枢神经系统疾病中受损。免疫反应，特别是在胶质细胞瘤多肠癌中，不仅由微胶质细胞支持，因为血脑屏障通过血管生成过程和淋巴血管^{的存在6，77}重组。因此，在整个肿瘤依赖性血管生成机制⁸中，脑肿瘤中出现了一个大的骨髓衍生巨噬细胞（BMDM）。癌细胞对渗透的BM....

Protocol

1. 微胶质/巨噬细胞的主要文化

1. 微胶质的主要文化
   1. 培养商业大鼠原生微胶质（2 x 10⁶细胞）（见材料表）在Dulbecco的改良鹰介质（DMEM）中补充10%无异体血清、100 U/mL青霉素、100微克/mL链球菌素和9.0克/L葡萄糖，37°C和5%CO2 。₂
   2. 收集48小时培养后的条件介质，然后进行 EV 隔离。
2. 巨噬细胞的主要培养
   1. 培养商业大鼠原发性巨噬细胞（1 x 10⁶细胞），在制造商提供的介质中（参见材料表），温度为37°C，CO2为5%，具有无外体血清。₂
   2. 收集24小时培养后的条件介质，然后进行与 EV 隔离。

2. 隔离电动汽车

1. EV 与空调介质的预隔离
   1. 将条件培养介质从微胶质或巨噬细胞培养（步骤 1.1.2 或 1.2.2）转移到圆锥形管中。
   2. 在室温 （RT） 下，在 1，200 x g下离心 10 分钟，以颗粒细胞。
   ....

Results

将生物效应归因于细胞外囊泡 （EV） 的主要挑战之一是能够将 EV 与整个培养介质隔离开来。在本报告中，我们提出了一种使用超中心（UC）和大小排除色谱（SEC）的方法，该方法与蛋白质特征的大规模分析相结合，以验证EV标记物并识别生物活性化合物。巨噬细胞或微胶质衍生的EV分别在24小时或48小时培养后与条件介质分离（图1）。

图 1:细胞外囊泡 （EV） 收集和隔离策略。通过连续的离心步骤，从微胶质或巨噬细胞调节介质中分离凋亡体体和细胞碎片。从上清器中，EV 被超中心（UC）隔离。含有EV的UC颗粒被加载到柱上，并通过大小排除色谱（SEC）在20个不同的洗脱分数中分离出来。如进一步步骤（电子显微镜、纳米粒子跟踪分析和蛋白镜分析）中所揭示的，SEC分数被汇集并组.......

Discussion

中枢神经系统（CNS）是一个复杂的组织，细胞到细胞的通信调节平衡所需的正常神经元功能^30。EV现已被广泛研究，并被描述为细胞到细胞通信的重要分子货物^31。他们特别向受体细胞提供一种调子鸡尾酒，从而影响其在健康和病理条件下的功能^32。最近的研究表明，EV在中枢神经系统^{24、33、3433,34}中起着至关重要的作用，尤其是那些来自大脑免疫细胞^{24的35、36。36}亲炎免疫反应和抗炎免疫反应之间的平衡至关重要，允许在突触发育和整个生命神经元活动期间保持大脑完整性。本研究讨论了两种截然不同的免疫反应情况:微胶质和神经元之间的关系（i）和（ii）渗透巨噬细胞和胶质瘤细胞之间的关系。首先，微胶质是脑组织中的.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12% Mini-PROTEAN TGX 预制蛋白凝胶	Bio-rad	4561045EDU
乙腈	Fisher Chemicals	A955-1
Amicon 50 kDa 离心过滤器	Merck	UFC505024
碳酸氢铵	Sigma-Aldrich	9830
HSP90 α/β 抗体 （RRID： AB_675659）	Santa-cruz	sc-13119
B27 Plus 添加剂	Gibco	A3582801
BenchMixer V2 涡旋混合器	Benchmark Scientific	BV1003
Bio-Rad 蛋白质检测染料试剂浓缩液 （Bradford）	Bio-Rad	5000006
C18	ZipTips Merck Millipore	ZTC18S096
C6大鼠胶质瘤细胞	ATCC	ATCC CCL-107
规范管	Sarstedt	62.554.002
离心	Eppendorf	5804000010
CO2 培养箱	ThermoFisher
共聚焦显微镜 LSM880	卡尔蔡司	LSM880
盖板玻璃	Marienfeld	111580
培养皿 （60 mm）	Sarstedt	82.1473
二硫苏糖醇	Sigma-Aldrich	43819
DMEM	Gibco	41966029
EASY-nLC 1000 液相色谱仪	ThermoFisher
电子显微镜 JEM-2100	JEOL&	nbsp;
乙二醇-双（2-氨基乙醚）-N，N，N′，N′-四乙酸	Sigma-Aldrich	03777-10G
乙二胺四乙酸	Sigma-Aldrich	ED-100G
Exo-FBS	Ozyme	EXO-FBS-50A-1	外泌体耗尽的 FBS
ExoCarta 数据库（Evs 的前 100 种蛋白质）			http://www.exocarta.org/
胎牛血清	Gibco	16140071
胎马血清	Biowest	S0960-500
Filtropur S 0.2	Sarstedt	83.1826.001
费雪品牌 带探头的 Q500 超声仪	Fisherbrand	12893543
FlexAnalysis	布鲁克
荧光封片剂	Agilent	S3023
甲酸	Sigma-Aldrich	695076
Formvar 碳涂层铜网格	Agar Scientific Ltd	AGS162-3
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8769
戊二醛	Sigma-Aldrich	340855
Hoechst 33342	Euromedex	17535-AAT
异型乙酰胺	Sigma-Aldrich	I1149
InstantBlue 考马斯蛋白质染色剂	Expedeon	ISB1L
倒置光学显微镜 CKX53	奥林巴斯
L-谷氨酰胺	Gibco	25030-024
LabTek II 8 孔	Nunc	154534
Laemmli 2x	Bio-Rad	1610737
层粘连蛋白	Corning	354232
MaxQuant 软件（蛋白质鉴定软件）			https://maxquant.net/maxquant/
MBT 波兰斯特	尔 Brucker	8268711
MEM 10x	Gibco	21090-022
甲基纤维素	Sigma-Aldrich	M6385-100G
MiliQ 水	Merck Millipore
牛奶	Regilait	REGILAIT300
Mini PROTEAN 垂直电泳槽	Bio-Rad	1658000FC
MonoP FPLC 色谱柱	GE Healthcare		不再提供
Nanosight NS300	马尔文帕纳科	NS300
NanoSight NTA 软件 v3.2	马尔文帕纳科
NanoSight 注射泵	Malvern Panalytical
Neurobasal	Gibco	21103-049
硝酸纤维素膜	GE Healthcare	10600007
Nonidet P-40	Fluka	56741
Nunc 多培养皿 24 孔	ThermoFisher	82.1473
多聚甲醛	电镜科学	15713
PC-12 细胞系	ATCC ATCC	CRL-1721
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122
肽校准混合物	LaserBio Labs	C101
过氧化物酶 Affini纯山羊抗小鼠 IgG （H+L）	Jackson ImmunoResearch	115-035-003
Perseus 软件（鉴定蛋白质的处理）			https://maxquant.net/perseus/
鬼笔环肽-四甲基罗丹明偶联物	Santa-cruz	sc-362065
苯基甲磺酰氟	Sigma-Aldrich	78830
磷酸盐缓冲盐水	Invitrogen	14190094	不含钙、不含镁
pluriStrainer M/ 60 µm	pluriSelect	43-50060
聚-D-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P6407
聚碳酸酯离心管	Beckman Coulter	355651
蛋白酶抑制剂	Sigma-Aldrich	S8830-20TAB
PureCol	Cell Systems	5005
Q-Exactive 质谱仪	ThermoFisher
rapifleX 质谱仪	Brucker
大鼠皮质神经元	细胞应用	R882N-20	细胞来源：来源于第 18 天的大脑皮层 胚胎 Sprague Dawley 大鼠大脑
大鼠巨噬细胞 &小胶质细胞培养培养基	应用	R620K-100	细胞来源：正常健康的大鼠骨髓
大鼠原代巨噬细胞	细胞应用	R8818-10a
大鼠原代小胶质细胞	Lonza	RG535
琼脂糖凝胶 CL-2B	GE Healthcare	17014001
测序级改良胰蛋白酶	Promega	V5111
滑	轨除尘器	100204
氯化钠	Scharlau	SO0227
十二烷基硫酸钠	Sigma-Aldrich	L3771
氟化钠	Sigma-Aldrich	S7920-100G
氢氧化钠	Scharlab	SO0420005P
焦磷酸钠	Sigma-Aldrich	S6422-100G
SpeedVac 真空浓缩仪	ThermoFisher
String 软件（功能性蛋白质结合网络）			https://string-db.org/
SuperSignal West Dura 长效底物	ThermoFisher	34075
注射器 1.0 mL	Terumo	8SS01H1
Trans-Blot SD 半干式转印槽	Bio-Rad	1703940
三氟乙酸	Sigma-Aldrich	T6508
特里斯	·因特希姆	UP031657
Tris-甘氨酸	Euromedex	EU0550
吐温20	Sigma-Aldrich	P2287
超速离心机	Beckman Coulter	A95765
超速离心机转子 70.1 Ti	Beckman Coulter	342184
乙酸铀酰	琼脂科学有限公司	AGR1260A
Whatman 滤纸	Sigma-Aldrich	WHA10347510
&α;-氰基-4-羟基肉桂酸	Sigma-Aldrich	C2020-25G