本报告重点阐述了从小胶质细胞或血液单核细胞中分离细胞外囊泡（EV）的时间顺序要求。在体外实验中，评估了小胶质细胞来源的EV对神经突起生长的调控作用，同时研究了血液单核细胞来源的EV对C6胶质瘤细胞侵袭的调控功能。研究目标是更深入地理解这些EV作为免疫介质在特定微环境中的生物学功能。
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本文内容
摘要
摘要
中枢神经系统（CNS）的神经炎症状态在生理和病理条件下均发挥关键作用。小胶质细胞作为脑内的常驻免疫细胞，有时还包括浸润的骨髓来源巨噬细胞（BMDMs），可调控其在中枢神经系统中微环境的炎症特征。目前公认，免疫细胞释放的细胞外囊泡（EV）群体可作为免疫介质发挥作用。因此，分离和纯化这些囊泡不仅有助于鉴定其内容物，还可评估其对受体细胞的生物学效应。本文数据强调了从小胶质细胞或血液巨噬细胞中分离EV所需的时间流程，包括超速离心和尺寸排阻色谱（SEC）步骤。非靶向蛋白质组学分析可用于验证EV标志物的蛋白特征，并表征具有生物活性的EV内容物。此外，小胶质细胞来源的EV在原代神经元培养中被功能性地用于评估其作为免疫介质在神经突起生长中的重要性。结果显示，小胶质细胞来源的EV可在体外促进神经突起的生长。同时，血液巨噬细胞来源的EV在C6胶质瘤细胞球状体培养中被用作免疫介质，结果表明这些EV可在体外调控胶质瘤细胞的侵袭行为。本研究强调了评估EV介导的免疫细胞功能的可能性，同时有助于理解此类细胞间通讯的分子基础。这一解析过程有望推动天然囊泡的应用，或促进体外制备治疗性囊泡，以模拟中枢神经系统疾病微环境中的免疫特性。
引言
许多神经病理学疾病与神经炎症状态相关，这是一种复杂的机制，尽管日益受到关注，但由于免疫过程具有多样性且依赖于细胞环境，目前仍知之甚少。事实上，中枢神经系统（CNS）疾病并不总是涉及相同的激活信号和免疫细胞群体，因此难以评估促炎或抗炎反应是病理的起因还是结果。被称为“小胶质细胞”的脑内常驻巨噬细胞似乎处于神经系统与免疫系统之间的交界面1。小胶质细胞起源于髓系，在原始造血过程中由卵黄囊产生并定植于大脑；而外周巨噬细胞则在定型造血期间由胎肝发育而来，最终成为外周巨噬细胞2。小胶质细胞可与神经元以及神经元来源的胶质细胞（如星形胶质细胞和少突胶质细胞）进行通讯3。近年来多项研究表明，小胶质细胞不仅参与中枢神经系统发育过程中的神经可塑性及成年组织稳态维持，也参与与神经退行性疾病相关的炎症状态4,5。此外，在其他中枢神经系统疾病中，血脑屏障的完整性可能受到破坏。特别是在多形性胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme）等癌症中，免疫反应不仅仅由小胶质细胞介导，因为血脑屏障通过血管生成过程以及淋巴管的存在而发生重构6,7。因此，大量骨髓来源的巨噬细胞（BM....
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方案
1. 小胶质细胞/巨噬细胞的原代培养
- 小胶质细胞的原代培养
- 将商品化的大鼠原代小胶质细胞（2 × 106 个细胞）（参见材料表）在添加了10%无外泌体血清、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素和9.0 g/L葡萄糖的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，于37 °C、5% CO2条件下进行培养。
- 培养48小时后收集条件培养基，并进行细胞外囊泡（EVs）的分离。
- 巨噬细胞的原代培养
- 将商品化的大鼠原代巨噬细胞（1 × 106 个细胞）在供应商提供的培养基中（参见材料表），添加无外泌体血清，于37 °C、5% CO2条件下培养。
- 培养24小时后收集条件培养基，并进行细胞外囊泡（EVs）的分离。
2. 外泌体的分离
- 从条件培养基中预先分离细胞外囊泡（EVs）
- 将小胶质细胞或巨噬细胞培养物的条件培养基（步骤 1.1.2 或 1.2.2）转移至锥形管中。
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结果
将生物效应归因于细胞外囊泡（EVs）的主要挑战之一，是能够从完整的培养基中分离出EVs。本报告中，我们介绍了一种结合超速离心（UC）和尺寸排阻色谱（SEC）的方法，并将其与大规模蛋白质特征分析相结合，以验证EV标志物并鉴定生物活性化合物。巨噬细胞或小胶质细胞来源的EVs分别从培养24小时或48小时后的条件培养基中分离获得（图1）。
图 1：细胞外囊泡（EV）的收集与分离策略。 通过连续离心步骤，将凋亡小体和细胞碎片从小胶质细胞或巨噬细胞条件培养基中分离。从上清液中通过超速离心（UC）分离EV。将含有EV的UC沉淀加载到.......
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讨论
中枢神经系统（CNS）是一种复杂的组织，其细胞间的通讯调控着维持稳态所必需的正常神经元功能30。目前，细胞外囊泡（EVs）被广泛研究，并被认为是介导细胞间通讯的重要分子载体31。EVs 可特异性地将多种介质递送至受体细胞，从而在生理和病理条件下影响其功能32。近期研究表明，EVs 在中枢神经系统中发挥关键作用24,33,34，尤其是来源于脑内免疫细胞的 EVs35,36。促炎与抗炎免疫反应之间的平衡至关重要，它有助于在突触发育及终生神经元活动中维持脑组织的完整性。本研究探讨了两种不同的免疫反应情境：（i）小胶质细胞与神经元之间的关系，以及（ii）浸润性巨噬细胞与胶质瘤细胞之间的关系。首先，小胶质.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究工作由教育部资助̀法国国家教育和高等教育与研究部́感谢里尔大学、里尔科研与高等教育中心以及法国国家健康与医学研究院（INSERM）的支持。我们衷心感谢BICeL- Campus Scientific City技术平台提供仪器使用机会和技术指导。我们衷心感谢Jean-Pascal Gimeno、Soulaimane Aboulouard和Isabelle Fournier在质谱分析方面的协助。我们衷心感谢Tanina Arab、Christelle van Camp、Francoise le Marrec-Croq、Jacopo Vizioli和Pierre-Eric Sautière在科学与技术开发方面所做出的重要贡献。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 12% Mini-PROTEAN TGX 预制蛋白凝胶 | 伯乐（Bio-rad） | 4561045EDU | |
| 乙腈 | Fisher Chemicals | A955-1 | |
| Amicon 50 kDa 离心滤膜 | 默克 | UFC505024 | |
| 碳酸氢铵 | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| HSP90 α/β 抗体（RRID: AB_675659） | Santa-cruz | sc-13119 | |
| B27 Plus 添加剂 | Gibco | A3582801 | |
| BenchMixer V2 旋涡混合器 | Benchmark Scientific | BV1003 | |
| Bio-Rad 蛋白检测试剂浓缩液（Bradford） | 伯乐（Bio-Rad） | 5000006 | |
| C18 ZipTips | 默克密理博 | ZTC18S096 | |
| C6 大鼠胶质瘤细胞 | ATCC | ATCC CCL-107 | |
| 标准管 | Sarstedt | 62.554.002 | |
| 离心 | Eppendorf | 5804000010 | |
| CO2 培养箱 | 赛默飞世尔科技 | ||
| 共聚焦显微镜 LSM880 | 卡尔·蔡司 | LSM880 | |
| 盖玻片 | Marienfeld | 111580 | |
| 培养皿（60 mm） | Sarstedt | 82.1473 | |
| 二硫苏糖醇 | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| EASY-nLC 1000 液相色谱仪 | ThermoFisher | ||
| 电子显微镜 JEM-2100 | JEOL | ||
| 乙二醇双(2-氨基乙基醚)-N,N,N′，N′四乙酸 | Sigma-Aldrich | 03777-10G | |
| 乙二胺四乙酸 | Sigma-Aldrich | ED-100G | |
| Exo-FBS | Ozyme | EXO-FBS-50A-1 | 无外泌体胎牛血清 |
| ExoCarta数据库（Evs的前100种蛋白质） | http://www.exocarta.org/ | ||
| 胎牛血清 | Gibco | 16140071 | |
| 胎马血清 | Biowest | S0960-500 | |
| Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Fisherbrand Q500 超声波破碎仪（探头式） | Fisherbrand | 12893543 | |
| FlexAnalysis | 布鲁克尔 | ||
| 荧光封片剂 | 安捷伦 | S3023 | |
| 甲酸 | Sigma-Aldrich | 695076 | |
| Formvar-碳支持膜铜网 | Agar scientific有限公司 | AGS162-3 | |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| 戊二醛 | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| Hoechst 33342 | Euromedex | 17535-AAT | |
| 碘乙酰胺 | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| InstantBlue 考马斯亮蓝蛋白质染色液 | Expedeon | ISB1L | |
| 倒置光学显微镜 CKX53 | Olympus | ||
| L-谷氨酰胺 | Gibco | 25030-024 | |
| LabTek II 8 孔板 | Nunc | 154534 | |
| Laemmli 2x | 伯乐（Bio-Rad） | 1610737 | |
| 层粘连蛋白 | 康宁 | 354232 | |
| MaxQuant 软件（蛋白质鉴定软件） | https://maxquant.net/maxquant/ | ||
| MBT 波兰星状体 | 布鲁克尔 | 8268711 | |
| MEM 10x | Gibco | 21090-022 | |
| 甲基纤维素 | Sigma-Aldrich | M6385-100G | |
| MiliQ 水 | 默克密理博 | ||
| 牛奶 | Regilait | REGILAIT300 | |
| Mini PROTEAN 垂直电泳槽 | Bio-Rad | 1658000FC | |
| MonoP FPLC 柱 | GE Healthcare | 不再提供 | |
| Nanosight NS300 | 马尔文帕纳科 | NS300 | |
| NanoSight NTA 软件 v3.2 | 马尔文帕纳科 | ||
| NanoSight 注射泵 | 马尔文帕纳科 | ||
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| 硝酸纤维素膜 | GE Healthcare | 10600007 | |
| Nonidet P-40 | Fluka | 56741 | |
| Nunc 24孔多孔培养皿 | ThermoFisher | 82.1473 | |
| 多聚甲醛 | 电子显微镜科学 | 15713 | |
| PC-12 细胞系 | ATCC | ATCC CRL-1721 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| 肽段校准混合物 | LaserBio Labs | C101 | |
| 辣根过氧化物酶标记的AffiniPure山羊抗小鼠IgG（H+L） | 杰克逊免疫研究实验室 | 115-035-003 | |
| Perseus 软件（已鉴定蛋白质的处理） | https://maxquant.net/perseus/ | ||
| 鬼笔环肽-四甲基罗丹明偶联物 | Santa-cruz | sc-362065 | |
| 苯甲基磺酰氟 | Sigma-Aldrich | 78830 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Invitrogen | 14190094 | 无钙，无镁 |
| pluriStrainer M/60 µm | pluriSelect | 43-50060 | |
| 聚-D-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| 聚碳酸酯离心管 | 贝克曼库尔特 | 355651 | |
| 蛋白酶抑制剂 | Sigma-Aldrich | S8830-20TAB | |
| PureCol | 细胞系统 | 5005 | |
| Q-Exactive 质谱仪 | 赛默飞世尔科技 | ||
| rapifleX 质谱仪 | 布鲁克尔 | ||
| 大鼠皮层神经元 | 细胞应用 | R882N-20 | 细胞来源：源自第18天胚胎Sprague Dawley大鼠脑的大脑皮层 |
| 大鼠巨噬细胞 &和小胶质细胞培养基 | 细胞应用 | R620K-100 | 细胞来源：正常健康大鼠骨髓 |
| 大鼠原代巨噬细胞 | 细胞应用 | R8818-10a | |
| 大鼠原代小胶质细胞 | Lonza | RG535 | |
| Sepharose CL-2B | GE Healthcare | 17014001 | |
| 测序级修饰胰蛋白酶 | Promega | V5111 | |
| 载玻片 | Dustsher | 100204 | |
| 氯化钠 | Scharlau | SO0227 | |
| 十二烷基硫酸钠 | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| 氟化钠 | Sigma-Aldrich | S7920-100G | |
| 氢氧化钠 | Scharlab | SO0420005P | |
| 焦磷酸钠 | Sigma-Aldrich | S6422-100G | |
| SpeedVac 真空浓缩仪 | 赛默飞世尔科技 | ||
| STRING 软件（功能蛋白关联网络） | https://string-db.org/ | ||
| SuperSignal West Dura 延长作用时间底物 | ThermoFisher | 34075 | |
| 1.0 mL 注射器 | Terumo | 8SS01H1 | |
| Trans-Blot SD 半干式转印槽 | 伯乐（Bio-Rad） | 1703940 | |
| 三氟乙酸 | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Tris | Interchim | UP031657 | |
| Tris-甘氨酸 | Euromedex | EU0550 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| 超速离心机 | 贝克曼库尔特 | A95765 | |
| 超速离心机转子 70.1 Ti | 贝克曼库尔特 | 342184 | |
| 醋酸铀酰 | Agar Scientific Ltd | AGR1260A | |
| 沃特曼滤纸 | Sigma-Aldrich | WHA10347510 | |
| α-氰基-4-羟基肉桂酸 | Sigma-Aldrich | C2020-25G |
参考文献
- Thion, M. S., Ginhoux, F., Garel, S. Microglia and early brain development: An intimate journey. Science. 362 (6411), 185-189 (2018).
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330<....
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重印与许可
