需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

免疫细胞来源的细胞外囊泡的表征及其对细胞微环境功能影响的研究

6.5K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/60118

⸱

2020年6月2日

 ,  ,  ,  , 
1U1192-Laboratoire Protéomique, Réponse Inflammatoire et Spectrométrie de Masse (PRISM), Univ. Lille, INSERM

本文内容

摘要

本报告重点阐述了从小胶质细胞或血液单核细胞中分离细胞外囊泡（EV）的时间顺序要求。在体外实验中，评估了小胶质细胞来源的EV对神经突起生长的调控作用，同时研究了血液单核细胞来源的EV对C6胶质瘤细胞侵袭的调控功能。研究目标是更深入地理解这些EV作为免疫介质在特定微环境中的生物学功能。

摘要

中枢神经系统（CNS）的神经炎症状态在生理和病理条件下均发挥关键作用。小胶质细胞作为脑内的常驻免疫细胞，有时还包括浸润的骨髓来源巨噬细胞（BMDMs），可调控其在中枢神经系统中微环境的炎症特征。目前公认，免疫细胞释放的细胞外囊泡（EV）群体可作为免疫介质发挥作用。因此，分离和纯化这些囊泡不仅有助于鉴定其内容物，还可评估其对受体细胞的生物学效应。本文数据强调了从小胶质细胞或血液巨噬细胞中分离EV所需的时间流程，包括超速离心和尺寸排阻色谱（SEC）步骤。非靶向蛋白质组学分析可用于验证EV标志物的蛋白特征，并表征具有生物活性的EV内容物。此外，小胶质细胞来源的EV在原代神经元培养中被功能性地用于评估其作为免疫介质在神经突起生长中的重要性。结果显示，小胶质细胞来源的EV可在体外促进神经突起的生长。同时，血液巨噬细胞来源的EV在C6胶质瘤细胞球状体培养中被用作免疫介质，结果表明这些EV可在体外调控胶质瘤细胞的侵袭行为。本研究强调了评估EV介导的免疫细胞功能的可能性，同时有助于理解此类细胞间通讯的分子基础。这一解析过程有望推动天然囊泡的应用，或促进体外制备治疗性囊泡，以模拟中枢神经系统疾病微环境中的免疫特性。

引言

许多神经病理学疾病与神经炎症状态相关，这是一种复杂的机制，尽管日益受到关注，但由于免疫过程具有多样性且依赖于细胞环境，目前仍知之甚少。事实上，中枢神经系统（CNS）疾病并不总是涉及相同的激活信号和免疫细胞群体，因此难以评估促炎或抗炎反应是病理的起因还是结果。被称为“小胶质细胞”的脑内常驻巨噬细胞似乎处于神经系统与免疫系统之间的交界面1。小胶质细胞起源于髓系，在原始造血过程中由卵黄囊产生并定植于大脑；而外周巨噬细胞则在定型造血期间由胎肝发育而来，最终成为外周巨噬细胞2。小胶质细胞可与神经元以及神经元来源的胶质细胞（如星形胶质细胞和少突胶质细胞）进行通讯3。近年来多项研究表明，小胶质细胞不仅参与中枢神经系统发育过程中的神经可塑性及成年组织稳态维持，也参与与神经退行性疾病相关的炎症状态4,5。此外，在其他中枢神经系统疾病中，血脑屏障的完整性可能受到破坏。特别是在多形性胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme）等癌症中，免疫反应不仅仅由小胶质细胞介导，因为血脑屏障通过血管生成过程以及淋巴管的存在而发生重构6,7。因此，大量骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）通过肿瘤依赖性的血管生成机制浸润至脑肿瘤组织中8。肿瘤细胞显著影响浸润的BMDMs，使其获得免疫抑制特性并促进肿瘤生长9。因此，由于免疫细胞的来源和激活信号具有异质性，免疫细胞与其脑内微环境之间的相互作用仍难以理解10,11。因此，研究免疫细胞相关分子特征在生理条件下的功能具有重要意义。在此背景下，可通过细胞释放的细胞外囊泡（EVs）来研究免疫细胞与其微环境之间的细胞间通讯。

在健康状态和病理状态下，细胞外囊泡（EVs）在免疫功能调控中的作用正受到越来越多的关注12,13。其中可考虑两类主要群体：外泌体（exosomes）和微囊泡（microvesicles）。这两者在生物发生机制和尺寸范围上有所不同。外泌体是直径约为30–150 nm的囊泡，由内体系统产生，并在多泡体（MVBs）与细胞质膜融合时释放。微囊泡的直径约为100–1,000 nm，通过细胞质膜向外出芽的方式生成14。由于目前仍难以根据大小和分子特征明确区分外泌体与微囊泡，因此本报告中统一使用“EVs”这一术语。中枢神经系统（CNS）中与EVs相关的细胞间通讯是一种古老的机制，已有研究显示其在无脊椎动物（如线虫、昆虫和环节动物）中亦存在15,16。此外，研究结果表明EVs能够介导不同物种细胞之间的通讯，说明该机制类似于“钥匙-锁”系统，首先依赖于囊泡与靶细胞之间表面分子的识别，进而实现信号分子的摄取16,17。事实上，EVs含有多种分子，包括蛋白质（如酶类、信号转导分子、生物发生因子）、脂质（如神经酰胺、胆固醇）和核酸（如DNA、mRNA或miRNA），这些分子可作为受体细胞活动的直接或间接调节因子14。正因如此，已有方法学研究针对免疫细胞开展，旨在分离EVs并全面表征其蛋白质特征18,19。

早期研究证明，原代培养的大鼠小胶质细胞在Wnt3a或5-羟色胺依赖性激活后，可诱导释放外泌体20,21。在中枢神经系统（CNS）中，小胶质细胞来源的细胞外囊泡（EVs）通过调节神经元突触前末梢的突触囊泡释放，参与调控神经元兴奋性22,23。小胶质细胞来源的EVs还可在大脑广泛区域传播由细胞因子介导的炎症反应24,25。重要的是，Toll样受体家族的多种配体可能激活小胶质细胞中特定类型的EVs产生26。例如，体外研究表明，脂多糖（LPS）激活的小胶质细胞BV2细胞系可产生包含促炎性细胞因子在内的不同EV内容物27。因此，可通过分析中枢神经系统中免疫细胞亚群（包括小胶质细胞和浸润的骨髓来源巨噬细胞BMDMs）各自释放的EV群体，及其对受体细胞的影响和EV内容物的特征，来评估这些细胞亚群的功能多样性。

我们此前已描述了在分离小胶质细胞和骨髓来源巨噬细胞（BMDM）来源的细胞外囊泡（EV）后，评估其功能特性的方法16,19。在本报告中，我们拟分别评估小胶质细胞来源EV对神经突生长的影响，以及巨噬细胞来源EV对胶质瘤细胞聚集体的调控作用。本研究还拟对EV组分进行广泛的蛋白质组学分析，以验证EV分离流程，并鉴定具有生物学活性的蛋白质特征。EV的有益效应及其内容物的分子解析，可能有助于未来对EV进行改造，并将其作为脑部疾病治疗剂加以应用。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 小胶质细胞/巨噬细胞的原代培养

  1. 小胶质细胞的原代培养
    1. 将商品化的大鼠原代小胶质细胞（2 × 106 个细胞）（参见材料表）在添加了10%无外泌体血清、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素和9.0 g/L葡萄糖的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，于37 °C、5% CO2条件下进行培养。
    2. 培养48小时后收集条件培养基，并进行细胞外囊泡（EVs）的分离。
  2. 巨噬细胞的原代培养
    1. 将商品化的大鼠原代巨噬细胞（1 × 106 个细胞）在供应商提供的培养基中（参见材料表），添加无外泌体血清，于37 °C、5% CO2条件下培养。
    2. 培养24小时后收集条件培养基，并进行细胞外囊泡（EVs）的分离。

2. 外泌体的分离

  1. 从条件培养基中预先分离细胞外囊泡（EVs）
    1. 将小胶质细胞或巨噬细胞培养物的条件培养基（步骤 1.1.2 或 1.2.2）转移至锥形管中。
    2. 在室温（RT）下以 1,200 × g 离心 10 分钟，沉淀细胞。
    3. 将上清液转移至新的锥形管中，在室温下以 1,200 × g 离心 20 分钟，以去除凋亡小体。
    4. 将上清液转移至 10.4 mL 聚碳酸酯管中，并将该管放入 70.1 Ti 转子中。在 4 °C 下以 100,000 × g 超速离心 90 分钟，沉淀 EVs。
    5. 弃去上清液，将含有 EVs 的沉淀重悬于 200 µL 经 0.20 µm 滤膜过滤的磷酸盐缓冲液（PBS）中。
  2. 细胞外囊泡（EVs）的分离
    1. 自制尺寸排阻色谱柱（SEC）的制备
      1. 取一支玻璃色谱柱（长度：26 cm；直径：0.6 cm）（见材料表），清空内容物，清洗并灭菌。
      2. 在色谱柱底部放置一个 60 µm 滤膜。
      3. 用交联琼脂糖凝胶过滤基质填充色谱柱，形成直径为 0.6 cm、高度为 20 cm 的固定相。
      4. 用 50 mL 经 0.20 µm 滤膜过滤的 PBS 冲洗固定相。如需后续使用，可于 4 °C 保存。
    2. 将重悬后的 EV 沉淀加样至 SEC 柱固定相顶部。
    3. 在持续向固定相顶部添加经 0.20 µm 滤膜过滤的 PBS 以防止柱体干燥的同时，依次收集 20 个 250 µL 的组分。如有需要，将组分储存于 -20 °C。
      注意：若需储存超过一周，建议在 -80 °C 下保存，以维持 EV 的完整性用于分子分析。
  3. SEC 组分的基质辅助激光解吸电离（MALDI）质谱分析
    1. 按照第 2.2 节所述进行 EV 的分离。
    2. 用 200 µL 肽段校准混合液（见材料表）重悬 EV 沉淀。
    3. 按照第 2.2.1 至 2.2.3 节所述进行 EV 的收集。
    4. 使用真空浓缩仪将组分完全干燥。
    5. 用 10 µL 0.1% 三氟乙酸（TFA）重新溶解各组分。
    6. 取 1 µL 重悬后的组分与 1 µL α-氰基-4-羟基肉桂酸（HCCA）基质混合，点样于 MALDI 抛光钢靶板上。
    7. 使用 MALDI 质谱仪分析所有组分。
    8. 使用专用软件分析所获得的质谱图（见材料表）。

3. 细胞外囊泡（EVs）的表征

  1. 纳米颗粒跟踪分析（NTA）
    注意：     NTA 分析使用纳米颗粒追踪分析仪进行（参见 材料表）和自动注射泵。
    1. 将步骤 2.2.3 中的每个 SEC 组分用 0.20 进行稀释（稀释倍数范围为 1:50 至 1:500） µm 过滤的 PBS
    2. 涡旋溶液以消除细胞外囊泡聚集体。
    3. 将稀释后的溶液放入1 mL注射器中，并将注射器置于自动注射泵内。
    4. 调节 相机设置 增益水平（3）和相机水平（13）
    5. 点击 运行 并运行以下脚本。
      1. 将样品加载至分析室（灌注速率：1,000，持续15秒）。
      2. 降低并稳定流速以进行视频录制（灌注速率为25，持续15秒）。连续采集三段60秒的颗粒流动视频。
      3. 调整摄像头水平（13）和检测阈值（3），然后进行视频分析。点击 设置 | 确定 开始分析并点击 导出 分析完成后。
    6. 每次组分分析之间，用1 mL的0.20 µm 过滤的 PBS
  2. 电子显微镜（EM）分析
    1. 按照第2节所述分离EVs。
      注意： 无需无菌条件。
    2. 重复第3.1节以定量分析细胞外囊泡（EVs）。
      注意： 仅使用阳性组分进行电子显微镜分析。
    3. 使用50 kDa离心过滤器（参见 材料表) 以浓缩含有EV的SEC组分。
    4. 将浓缩的EVs重悬于30 µ2% 多聚甲醛（PFA）溶液
    5. 加入10 µ将样品的 L 加到覆有碳膜的铜网上。
    6. 在湿润环境中孵育20分钟。
    7. 重复步骤 3.2.5 和 3.2.6，以确保样品在载网上充分吸附。
    8. 将载网转移至含有1%戊二醛的PBS溶液中，室温下孵育5分钟。
    9. 用超纯水洗涤样品数次。
    10. 在冰上用4%醋酸铀酰和2%甲基纤维素（体积比1:9）的混合液对样品进行反差染色10分钟。用滤纸吸除多余的混合液。
    11. 干燥样品，并在200 kV下使用透射电子显微镜观察（参见 材料列表).
  3. Western印迹分析
    1. 蛋白质提取
      1. 重复步骤 3.2.1 至 3.2.3，以分离和浓缩 EVs。
      2. 混合 50 µL of RIPA缓冲液（150 mM 氯化钠 [NaCl]，50 mM Tris，5 mM 乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸 [EGTA]）′，N′四乙酸[EGTA]，2 mM 乙二胺四乙酸[EDTA]，100 mM 氟化钠[NaF]，10 mM 焦磷酸钠，1% Nonidet P-40，1 mM 苯甲基磺酰氟[PMSF]，1×蛋白酶抑制剂）与EV样本（25 µ在冰上孵育5分钟以提取蛋白质（由滤膜上浓缩的EV导致的L）。
      3. 在冰上以500 W振幅、20 kHz频率超声处理5秒，重复3次。
      4. 通过20,000 x g离心去除囊泡状碎片 g 4℃下，10分钟 °C.
      5. 收集上清液，采用Bradford蛋白测定法测定蛋白浓度。
    2. 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）与蛋白质印迹法
      1. 混合蛋白提取物（30 µg) 加入5倍体积的Laemmli上样缓冲液（v/v）。
      2. 将蛋白质混合物上样至12%聚丙烯酰胺凝胶中。
      3. 使用TGS缓冲液（25 mM Tris pH 8.5，192 mM 甘氨酸，0.1% SDS），在70 V电压下电泳15分钟，随后在120 V电压下电泳45分钟，使凝胶中的蛋白质迁移。
      4. 使用半干式转膜系统在230 V条件下将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上，持续30分钟。
      5. 室温下用封闭液（0.05% Tween 20 w/v，5% 脱脂奶粉 w/v 溶于 0.1 M PBS，pH 7.4）孵育膜 1 小时。
      6. 4℃下孵育膜过夜 °用封闭缓冲液按1:100稀释的小鼠单克隆抗人热休克蛋白90（HSP90）抗体在C中孵育。
      7. 用 PBS-Tween（PBS，0.05% Tween 20 w/v）洗涤膜 3 次，每次 15 分钟。
      8. 在室温下用封闭缓冲液按1:10,000比例稀释的辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG二抗孵育膜1小时。
        注意： 使用二抗单独进行阴性对照实验。
      9. 重复洗涤步骤（步骤 3.3.2.7）。
      10. 使用增强型化学发光（ECL）Western印迹底物试剂盒显影膜（参见 材料表).
  4. 蛋白质组学分析
    1. 蛋白质提取与凝胶内消化
      1. 重复步骤 3.2.1 至 3.2.3 以分离和浓缩 EVs。重复步骤 3.3.1 进行 EV 蛋白提取。
      2. 在12%聚丙烯酰胺凝胶的浓缩胶中进行蛋白质电泳迁移。
      3. 在室温下用考马斯亮蓝固定凝胶中的蛋白质，持续20分钟。
      4. 切除每块有色凝胶，并将其切成 1 mm 的小块3.
      5. 依次用 300 µ每种溶液各 L：超纯水 15 分钟，100% 乙腈（ACN）15 分钟，100 mM 碳酸氢铵（NH₄HCO₃）4HCO3）15 分钟，乙腈：100 mM NH₄HCO₃4HCO3 (1:1，v/v) 溶液中孵育15分钟，再用100%乙腈处理5分钟，持续搅拌。
      6. 使用真空浓缩仪将凝胶碎片完全干燥。
      7. 使用100进行蛋白质还原 µ100 mM NH₄L4HCO3 含10 mM二硫苏糖醇，56℃孵育1小时°C.
      8. 使用100进行蛋白质烷基化处理 µ100 mM NH₄⁺ 的 L4HCO3 含 50 mM 碘乙酰胺，室温避光孵育 45 分钟。
      9. 依次用 300 µ每种溶液的体积：100 mM NH₄HCO₃ 溶液4HCO3 15 分钟，乙腈：20 mM NH₄HCO₃4HCO3 (1:1，v/v) 溶液中搅拌反应15分钟，再用100%乙腈处理5分钟，持续搅拌。
      10. 使用真空浓缩仪将凝胶小块完全干燥。
      11. 使用50进行蛋白质消化 µ胰蛋白酶（12.5 L） µg/mL）于 20 mM NH4HCO3 37℃过夜 °C.
      12. 从凝胶中用50提取消化后的蛋白质 µ37℃下用100%乙腈处理30分钟 °C，然后在室温下持续搅拌15分钟。
      13. 重复以下提取步骤两次：50 µ20 mM NH₄OAc 溶液中的 5% TFA4HCO3 持续搅拌下孵育20分钟。
      14. 加入100 µ100%乙腈（ACN）中搅拌10分钟。
      15. 用真空浓缩仪将消化后的蛋白质干燥，并重悬于20 µ0.1% TFA 的 L
      16. 使用10脱盐样品 µL型移液器吸头，内含C18反相介质，用于肽段的脱盐与浓缩（参见 材料表) 并用乙腈:0.1% 甲酸（FA）（80:20, v/v）洗脱肽段。
      17. 使用真空浓缩仪将样品完全干燥，并重悬于20 µ用于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的乙腈：0.1% 甲酸溶液（2:98，v/v）
    2. LC-MS/MS 分析
      1. 将消化后的肽段上样至液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）仪器，并依据 elsewhere 详细描述的参数进行样品分析和数据处理42.
    3. 原始数据分析
      1. 使用定量蛋白质组学软件包和标准参数处理质谱数据，以鉴定蛋白质，并比较各样本中鉴定出的蛋白质。
      2. 使用标准参数，在预测蛋白质网络和生物过程的软件中导出EV阳性样本中特有且富集的蛋白质列表。
      3. 将各组分中鉴定出的蛋白质列表与 Exocarta 开放获取数据库中的前 100 种细胞外囊泡标志物进行比较（参见 材料表).

4. 外泌体功能效应检测

  1. PC-12 细胞系的神经突生长实验
    1. 在完全 DMEM 培养基（含 2 mM L-谷氨酰胺、10% 无外泌体胎马血清（FHS）、5% 无外泌体胎牛血清（FBS）、100 UI/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉素）中培养 PC12 细胞系。
      注意：整个实验过程中所用血清均为无外泌体血清。
    2. 将盖玻片（所有孔）放入 24 孔板中，用聚-D-赖氨酸（0.1 mg/mL）包被，并以每孔 260,000 个细胞接种。
    3. 在 37 °C、5% CO2 条件下培养细胞。
    4. 培养 24 小时后，更换为 DMEM 分化培养基（含 2 mM L-谷氨酰胺、0.1% FHS、100 UI/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉素），并加入 1 × 106 个小胶质细胞外泌体（来自步骤 1.1.2）。
      注意：对照组在分化培养基中不添加小胶质细胞外泌体。
    5. 接种后第 4 天，向所有孔中加入 100 µL 完全 DMEM 培养基。
    6. 接种后第 7 天，用 4% 多聚甲醛（PFA）在室温下固定细胞 20 分钟，并用 PBS 洗涤三次，每次 10 分钟。
    7. 用罗丹明标记的鬼笔环肽在 4 °C 下染色 30 分钟，并用 PBS 洗涤三次，每次 10 分钟。
    8. 用稀释的 Hoechst 33342（1:10,000）在室温下染色 30 分钟，并用 PBS 洗涤三次，每次 10 分钟。
    9. 使用荧光封片剂将盖玻片封固于载玻片上（参见 材料表）。
    10. 使用共聚焦显微镜观察载玻片，并对每张载玻片随机采集 5 张图像。
    11. 使用自动定量软件（总神经突长度）测量神经突生长，具体方法详见 elsewhere43。
  2. 大鼠原代神经元的神经突生长实验
    1. 用聚-D-赖氨酸（0.1 mg/mL）和层粘连蛋白（20 µg/mL）包被 8 孔玻璃载片。
    2. 将商品化的大鼠原代神经元接种于适当的培养基中（参见 材料表），每孔接种 50,000 个细胞，并在 37 °C、5% CO2 条件下培养 48 小时。
      注意：整个实验过程中所用血清均为无外泌体血清。
    3. 向神经元培养基中加入 1 × 106 个小胶质细胞外泌体，继续在 37 °C、5% CO2 条件下培养 48 小时。
      注意：对照组在神经元培养基中不添加小胶质细胞外泌体。
    4. 按照步骤 4.1.6 至 4.1.9 固定并染色细胞。
    5. 按照步骤 4.1.10 和 4.1.11 分析载玻片。
  3. 胶质瘤细胞侵袭实验
    1. 将 C6 大鼠胶质瘤细胞重悬于含 5% 胶原的完全 DMEM 培养基（含 10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、1× 抗生素）中，终浓度为每 20 µL 含 8,000 个细胞。
      注意：整个实验过程中所用血清均为无外泌体血清。
    2. 在 60 mm 组织培养皿底部加入 5 mL PBS。将皿盖倒置，并将 20 µL（含 8,000 个细胞）细胞悬液滴加至皿盖底部。
    3. 将皿盖倒扣于盛有 PBS 的底部培养室上，在 37 °C、5% CO2 条件下培养 72 小时，直至形成细胞球体。
    4. 将 1 × 108 个巨噬细胞外泌体（来自步骤 1.2.2）加入 2.2 mg/mL 的胶原混合液中（由 2 mL 牛 I 型胶原溶液 [3 mg/mL]、250 µL 10× 最小必需培养基（MEM）和 500 µL 0.1 M 氢氧化钠组成）。
      注意：对照组在胶原混合液中不添加巨噬细胞外泌体。
    5. 将含外泌体的胶原混合液分配至 24 孔板中，用于包埋细胞球体。
    6. 将新形成的细胞球体植入每孔中央。
    7. 在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 30 分钟，使凝胶固化。
    8. 随后，向每孔胶原基质上覆盖 400 µL 完全 DMEM 培养基。
    9. 将整个体系在 37 °C、5% CO2 条件下继续培养共 6 天。
      注意：使用倒置光学显微镜配备 4x/0.10 N.A. 物镜，通过数字摄影监测细胞从球体向外侵袭的情况。
    10. 每天采集每孔的图像。
    11. 使用软件处理图像，并如前所述详细方法42定量分析细胞球体的侵袭面积。
      注意：每天的侵袭面积和球体面积均以第 0 天测得的侵袭面积和球体面积进行归一化处理。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

将生物效应归因于细胞外囊泡（EVs）的主要挑战之一，是能够从完整的培养基中分离出EVs。本报告中，我们介绍了一种结合超速离心（UC）和尺寸排阻色谱（SEC）的方法，并将其与大规模蛋白质特征分析相结合，以验证EV标志物并鉴定生物活性化合物。巨噬细胞或小胶质细胞来源的EVs分别从培养24小时或48小时后的条件培养基中分离获得（图1）。

用于细胞外囊泡分离的尺寸排阻色谱示意图；纳米颗粒分析装置。
图 1：细胞外囊泡（EV）的收集与分离策略。 通过连续离心步骤，将凋亡小体和细胞碎片从小胶质细胞或巨噬细胞条件培养基中分离。从上清液中通过超速离心（UC）分离EV。将含有EV的UC沉淀加载到...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

中枢神经系统（CNS）是一种复杂的组织，其细胞间的通讯调控着维持稳态所必需的正常神经元功能30。目前，细胞外囊泡（EVs）被广泛研究，并被认为是介导细胞间通讯的重要分子载体31。EVs 可特异性地将多种介质递送至受体细胞，从而在生理和病理条件下影响其功能32。近期研究表明，EVs 在中枢神经系统中发挥关键作用24,33,34，尤其是来源于脑内免疫细胞的 EVs35,36。促炎与抗炎免疫反应之间的平衡至关重要，它有助于在突触发育及终生神经元活动中维持脑组织的完整性。本研究探讨了两种不同的免疫反应情境：（i）小胶质细胞与神经元之间的关系，以及（ii）浸润性巨噬细胞与胶质瘤细胞之间的关系。首先，小胶质...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究工作由教育部资助̀法国国家教育和高等教育与研究部́感谢里尔大学、里尔科研与高等教育中心以及法国国家健康与医学研究院（INSERM）的支持。我们衷心感谢BICeL- Campus Scientific City技术平台提供仪器使用机会和技术指导。我们衷心感谢Jean-Pascal Gimeno、Soulaimane Aboulouard和Isabelle Fournier在质谱分析方面的协助。我们衷心感谢Tanina Arab、Christelle van Camp、Francoise le Marrec-Croq、Jacopo Vizioli和Pierre-Eric Sautière在科学与技术开发方面所做出的重要贡献。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
12% Mini-PROTEAN TGX 预制蛋白凝胶伯乐（Bio-rad）4561045EDU 
乙腈Fisher ChemicalsA955-1 
Amicon 50 kDa 离心滤膜默克UFC505024 
碳酸氢铵Sigma-Aldrich9830 
HSP90 α/β 抗体（RRID: AB_675659）Santa-cruzsc-13119 
B27 Plus 添加剂GibcoA3582801 
BenchMixer V2 旋涡混合器Benchmark ScientificBV1003 
Bio-Rad 蛋白检测试剂浓缩液（Bradford）伯乐（Bio-Rad）5000006 
C18 ZipTips默克密理博ZTC18S096 
C6 大鼠胶质瘤细胞ATCCATCC CCL-107 
标准管Sarstedt62.554.002 
离心Eppendorf5804000010 
CO2 培养箱赛默飞世尔科技  
共聚焦显微镜 LSM880卡尔·蔡司LSM880 
盖玻片Marienfeld111580 
培养皿（60 mm）Sarstedt82.1473 
二硫苏糖醇Sigma-Aldrich43819 
DMEMGibco41966029 
EASY-nLC 1000 液相色谱仪ThermoFisher  
电子显微镜 JEM-2100JEOL  
乙二醇双(2-氨基乙基醚)-N,N,N′，N′四乙酸Sigma-Aldrich03777-10G 
乙二胺四乙酸Sigma-AldrichED-100G 
Exo-FBSOzymeEXO-FBS-50A-1无外泌体胎牛血清
ExoCarta数据库（Evs的前100种蛋白质）  http://www.exocarta.org/
胎牛血清Gibco16140071 
胎马血清BiowestS0960-500 
Filtropur S 0.2Sarstedt83.1826.001 
Fisherbrand Q500 超声波破碎仪（探头式）Fisherbrand12893543 
FlexAnalysis布鲁克尔  
荧光封片剂安捷伦S3023 
甲酸Sigma-Aldrich695076 
Formvar-碳支持膜铜网Agar scientific有限公司AGS162-3 
葡萄糖Sigma-AldrichG8769 
戊二醛Sigma-Aldrich340855 
Hoechst 33342Euromedex17535-AAT 
碘乙酰胺Sigma-AldrichI1149 
InstantBlue 考马斯亮蓝蛋白质染色液ExpedeonISB1L 
倒置光学显微镜 CKX53Olympus  
L-谷氨酰胺Gibco25030-024 
LabTek II 8 孔板 Nunc154534 
Laemmli 2x伯乐（Bio-Rad）1610737 
层粘连蛋白康宁354232 
MaxQuant 软件（蛋白质鉴定软件）  https://maxquant.net/maxquant/
MBT 波兰星状体布鲁克尔8268711 
MEM 10xGibco21090-022 
甲基纤维素Sigma-AldrichM6385-100G 
MiliQ 水默克密理博  
牛奶RegilaitREGILAIT300 
Mini PROTEAN 垂直电泳槽Bio-Rad1658000FC 
MonoP FPLC 柱GE Healthcare 不再提供
Nanosight NS300马尔文帕纳科NS300 
NanoSight NTA 软件 v3.2马尔文帕纳科  
NanoSight 注射泵马尔文帕纳科  
NeurobasalGibco21103-049 
硝酸纤维素膜GE Healthcare10600007 
Nonidet P-40Fluka56741 
Nunc 24孔多孔培养皿ThermoFisher82.1473 
多聚甲醛电子显微镜科学15713 
PC-12 细胞系ATCCATCC CRL-1721 
青霉素-链霉素Gibco15140-122 
肽段校准混合物LaserBio LabsC101 
辣根过氧化物酶标记的AffiniPure山羊抗小鼠IgG（H+L）杰克逊免疫研究实验室115-035-003 
Perseus 软件（已鉴定蛋白质的处理）  https://maxquant.net/perseus/
鬼笔环肽-四甲基罗丹明偶联物Santa-cruzsc-362065 
苯甲基磺酰氟Sigma-Aldrich78830 
磷酸盐缓冲液Invitrogen14190094无钙，无镁
pluriStrainer M/60 µmpluriSelect43-50060 
聚-D-赖氨酸Sigma-AldrichP6407 
聚碳酸酯离心管贝克曼库尔特355651 
蛋白酶抑制剂Sigma-AldrichS8830-20TAB 
PureCol细胞系统5005 
Q-Exactive 质谱仪赛默飞世尔科技  
rapifleX 质谱仪布鲁克尔  
大鼠皮层神经元细胞应用R882N-20细胞来源：源自第18天胚胎Sprague Dawley大鼠脑的大脑皮层
大鼠巨噬细胞 &和小胶质细胞培养基细胞应用R620K-100细胞来源：正常健康大鼠骨髓
大鼠原代巨噬细胞细胞应用R8818-10a 
大鼠原代小胶质细胞LonzaRG535 
Sepharose CL-2BGE Healthcare17014001 
测序级修饰胰蛋白酶PromegaV5111 
载玻片Dustsher100204 
氯化钠ScharlauSO0227 
十二烷基硫酸钠Sigma-AldrichL3771 
氟化钠Sigma-AldrichS7920-100G 
氢氧化钠ScharlabSO0420005P 
焦磷酸钠Sigma-AldrichS6422-100G 
SpeedVac 真空浓缩仪赛默飞世尔科技  
STRING 软件（功能蛋白关联网络）  https://string-db.org/
SuperSignal West Dura 延长作用时间底物ThermoFisher34075 
1.0 mL 注射器Terumo8SS01H1 
Trans-Blot SD 半干式转印槽伯乐（Bio-Rad）1703940 
三氟乙酸Sigma-AldrichT6508 
TrisInterchimUP031657 
Tris-甘氨酸EuromedexEU0550 
Tween 20Sigma-AldrichP2287 
超速离心机贝克曼库尔特A95765 
超速离心机转子 70.1 Ti贝克曼库尔特342184 
醋酸铀酰Agar Scientific LtdAGR1260A 
沃特曼滤纸Sigma-AldrichWHA10347510 
α-氰基-4-羟基肉桂酸Sigma-AldrichC2020-25G 

参考文献

  1. Thion, M. S., Ginhoux, F., Garel, S. Microglia and early brain development: An intimate journey. Science. 362 (6411), 185-189 (2018).
  2. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).
  3. Sankowski, R., Mader, S., Valdes-Ferrer, S. I. Systemic Inflammation and the Brain: Novel Roles of Genetic, Molecular, and Environmental Cues as Drivers of Neurodegeneration. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  4. Chakrabarty, S., Kabekkodu, S. P., Singh, R. P., Thangaraj, K., Singh, K. K., Satyamoorthy, K. Microglia in health and disease. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 43 (3), 25-29 (2015).
  5. Sankowski, R., Mader, S., Valdés-Ferrer, S. I. Systemic inflammation and the brain: novel roles of genetic, molecular, and environmental cues as drivers of neurodegeneration. Frontiers in cellular neuroscience. 9, 28(2015).
  6. Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
  7. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  8. Domingues, P., et al. Tumor infiltrating immune cells in gliomas and meningiomas. Brain, Behavior, and Immunity. 53, 1-15 (2016).
  9. Hambardzumyan, D., Gutmann, D. H., Kettenmann, H. The role of microglia and macrophages in glioma maintenance and progression. Nature Neuroscience. 19 (1), 20-27 (2016).
  10. Thion, M. S., et al. Microbiome Influences Prenatal and Adult Microglia in a Sex-Specific Manner. Cell. 172 (3), 500-516 (2018).
  11. Hammond, T. R., et al. Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).
  12. Rajendran, L., et al. Emerging Roles of Extracellular Vesicles in the Nervous System. The Journal of Neuroscience. 34 (46), 15482-15489 (2014).
  13. Gupta, A., Pulliam, L. Exosomes as mediators of neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 11 (1), 68(2014).
  14. van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  15. Budnik, V., Ruiz-cañada, C., Wendler, F. Extracellular vesicles round off communication in the nervous system. Nature Reviews Neurosciences. 17, 160-172 (2016).
  16. Raffo-Romero, A., et al. Medicinal Leech CNS as a Model for Exosome Studies in the Crosstalk between Microglia and Neurons. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 4124(2018).
  17. Zhou, Y., et al. Exosomes Transfer Among Different Species Cells and Mediating miRNAs Delivery. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (12), 4267-4274 (2017).
  18. Arab, T., et al. Proteomic characterisation of leech microglia extracellular vesicles (EVs): comparison between differential ultracentrifugation and OptiprepTM density gradient isolation. Journal of extracellular vesicles. 8 (1), 1603048(2019).
  19. Murgoci, A. -N., et al. Brain-Cortex Microglia-Derived Exosomes: Nanoparticles for Glioma Therapy. ChemPhysChem. 19 (10), 1205-1214 (2018).
  20. Glebov, K., et al. Serotonin stimulates secretion of exosomes from microglia cells. Glia. 63 (4), 626-634 (2015).
  21. Hooper, C., et al. Wnt3a induces exosome secretion from primary cultured rat microglia. BMC Neuroscience. 13 (1), 144(2012).
  22. Gabrielli, M., et al. Active endocannabinoids are secreted on extracellular membrane vesicles. EMBO reports. 16 (2), 213-220 (2015).
  23. Antonucci, F., et al. Microvesicles released from microglia stimulate synaptic activity via enhanced sphingolipid metabolism. The EMBO Journal. 31 (5), 1231-1240 (2012).
  24. Frühbeis, C., Fröhlich, D., Kuo, W. P., Krämer-Albers, E. -M. Extracellular vesicles as mediators of neuron-glia communication. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 182(2013).
  25. Prada, I., et al. Glia-to-neuron transfer of miRNAs via extracellular vesicles: a new mechanism underlying inflammation-induced synaptic alterations. Acta neuropathologica. 135 (4), 529-550 (2018).
  26. Takenouchi, T., et al. Extracellular ATP induces unconventional release of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from microglial cells. Immunology Letters. 167 (2), 116-124 (2015).
  27. Yang, Y., Boza-Serrano, A., Dunning, C. J. R., Clausen, B. H., Lambertsen, K. L., Deierborg, T. Inflammation leads to distinct populations of extracellular vesicles from microglia. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 168(2018).
  28. Duhamel, M., et al. Paclitaxel Treatment and Proprotein Convertase 1/3 (PC1/3) Knockdown in Macrophages is a Promising Antiglioma Strategy as Revealed by Proteomics and Cytotoxicity Studies. Molecular & Cellular Proteomics. 17 (6), 1126-1143 (2018).
  29. Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: A novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. Journal of Neuroscience Methods. 168 (1), 134-139 (2008).
  30. Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B. Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71(2016).
  31. Rashed, M. H., et al. Exosomes: From Garbage Bins to Promising Therapeutic Targets. Int. J. Mol. Sci. Int. J. Mol. Sci. 18 (18), (2017).
  32. Yuana, Y., Sturk, A., Nieuwland, R. Extracellular vesicles in physiological and pathological conditions. Blood Reviews. 27 (1), 31-39 (2013).
  33. Frohlich, D., et al. Multifaceted effects of oligodendroglial exosomes on neurons: impact on neuronal firing rate, signal transduction and gene regulation. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
  34. Krämer-Albers, E. -M., et al. Oligodendrocytes secrete exosomes containing major myelin and stress-protective proteins: Trophic support for axons. Proteomics. Clinical applications. 1 (11), 1446-1461 (2007).
  35. Verderio, C., et al. Myeloid microvesicles are a marker and therapeutic target for neuroinflammation. Annals of Neurology. 72 (4), 610-624 (2012).
  36. Prada, I., Furlan, R., Matteoli, M., Verderio, C. Classical and Unconventional Pathways of Vesicular Release in Microglia. GLIA. 61, 1003-1017 (2013).
  37. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the CNS in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  38. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. , (2017).
  39. Kennedy, B. C., et al. Tumor-Associated Macrophages in Glioma: Friend or Foe. Journal of Oncology. 2013, 1-11 (2013).
  40. Potolicchio, I., Carven, G. J., Xu, X., Stipp, C., Riese, R. J., Stern, L. J., Santambroggio, L. Proteomic Analysis of Microglia-Derived Exosomes: Metabolic Role of the Aminopeptidase CD13 in Neuropeptide Catabolism1. The Journal of Immunology. 175, 2237-2243 (2005).
  41. Turola, E., Furlan, R., Bianco, F., Matteoli, M., Verderio, C. Microglial microvesicle secretion and intercellular signaling. Frontiers in Physiology. 3, (2012).
  42. Cocucci, E., Meldolesi, J. Ectosomes and exosomes : shedding the confusion between extracellular vesicles. Trends in Cell Biology. 25 (6), 364-372 (2015).
  43. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  44. de Vrij, J., et al. Glioblastoma-derived extracellular vesicles modify the phenotype of monocytic cells. International Journal of Cancer. 137 (7), 1630-1642 (2015).
  45. van der Vos, K. E., et al. Directly visualized glioblastoma-derived extracellular vesicles transfer RNA to microglia/macrophages in the brain. Neuro-Oncology. 18 (1), 58-69 (2016).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

免疫细胞超速离心尺寸排阻色谱纳米颗粒追踪分析蛋白质印迹蛋白质组学分析神经突生长胶质瘤细胞侵袭小胶质细胞来源的细胞外囊泡
免疫细胞来源的细胞外囊泡的表征及其对细胞微环境功能影响的研究
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。