一种更接近生理条件的三维球体模型用于癌相关成纤维细胞分化与侵袭的体外研究

摘要

本实验方案的目的是建立一种三维体外模型，用于在类似肿瘤组织的环境中研究癌相关成纤维细胞（CAFs）的分化过程，该模型可应用于多种分析系统，如免疫荧光、转录分析和活细胞成像。

摘要

确定体外研究的理想模型至关重要，尤其是在研究细胞分化等生理过程时。在肿瘤间质中，宿主成纤维细胞受到癌细胞的刺激而发生分化，从而获得一种促进肿瘤微环境形成并支持肿瘤进展的表型。我们利用球状体模型建立了一种三维体外模型系统，用于分析层粘连蛋白-332及其受体整合素α3β1在此分化过程中的作用。该球状体模型不仅更准确地模拟了肿瘤微环境的条件，而且具有高度的灵活性，可适用于多种下游实验，例如对细胞内和细胞外标志物以及沉积的细胞外基质蛋白进行免疫荧光染色。此外，还可利用该模型开展转录水平的qPCR分析、流式细胞术分析以及细胞侵袭实验。本文中，我们描述了一种球状体模型的实验方案，用于评估癌相关成纤维细胞（CAFs）的整合素α3β1及其异位沉积的配体层粘连蛋白-332在分化过程及支持胰腺癌细胞侵袭中的作用。

引言

肿瘤微环境是一个非常复杂的生态位，对肿瘤细胞的维持和进展极为重要¹。它不仅由癌细胞构成，还包括间质成纤维细胞。肿瘤细胞被一种特异且不同于正常组织间质的基质所包围²。层粘连蛋白-332（Laminin-332）是一种在多种肿瘤间质中异位表达的细胞外基质蛋白，例如胰腺导管腺癌³。此外，细胞外基质（ECM）的生化组成及其生物物理特性（如刚度和张力）在肿瘤组织内部也会发生变化⁴。这种肿瘤间质，即"反应性间质"，是成纤维细胞对邻近癌细胞适应以及招募其他关键组分共同作用的结果，从而形成有利于肿瘤进展的支持性环境。间质成纤维细胞的分化可产生癌症相关成纤维细胞（CAF）。这些细胞可通过多种标志物进行鉴定，例如α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）⁵或神经/胶质抗原2（NG2）⁶。

使用癌症相关成纤维细胞（CAFs）来重建肿瘤微环境（TME）的最合适的 体外模型难以选择。在构建此类模型系统时，必须考虑以成本效益高且可重复的方式模拟TME生理参数的方法。在TME中，会发生多种不同的生物学过程，例如不同类型细胞的增殖、分化、迁移和侵袭。这些细胞过程可通过不同的方法分别进行研究。然....

方案

1. 利用不同TGF-β1抑制剂和细胞-基质相互作用化合物建立三维类球体作为成纤维细胞/癌相关成纤维细胞体外分化模型

1. 将1份6 mg/mL的甲基纤维素溶液与3份细胞培养基（MEM）混合，MEM中添加1%热灭活胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素，以制备用于球体形成的溶液。
2. 将 freshly thawed 的永生化正常成纤维细胞（iNFs）、永生化癌症相关成纤维细胞（iCAFs）或整合素 α3β1 基因敲除的 iCAF（传代不超过25代）重悬于上述球体形成溶液中。若准备一块96孔板，需配制过量的球体形成溶液（10 mL），并加入75,000个细胞，注意每个球体由750个细胞组成，每孔加入100 µL溶液。
3. 若实验中需加入细胞因子或整合素抑制剂，应将这些化合物添加至细胞悬液中，以便在球体形成过程中将其包埋入球体内。注意：iNFs需用10 ng/mL TGF-β1刺激，以诱导其分化。如适用，可将抑制剂化合物与TGF-β1一同加入，例如20 µg/mL BM2或10 µg/mL lebein 1。
4. 以相同方式制备CAF同源球体，但无需添加TGF-β1刺激，因其已处于分化状态。制备整合素 α3 基因敲除的CAF同源球体时，不添加任何化合物。
5. 将球体形成溶液以每孔100 µL的量加入圆底96孔板中。每次向孔板中分配溶液时，均需通过反复吹打充分混匀。
6. 将板置于细胞培养孵育箱中孵育24小时，使每个孔中形成一个球体。

结果

该实验设计的结果已发表于Martins Cavaco等人¹³的研究中，建议进一步阅读该文献以了解从这些实验中得出的结论。

图1为免疫荧光球体的代表性图像，显示了永生化正常成纤维细胞和永生化癌症相关成纤维细胞（CAFs）中整合素α3亚基的免疫染色结果（图1A），以及整合素α3亚基的免疫荧光定量分析（图1B）和通过qPCR检测的整合素α3亚基基因的转录水平（图1C）。该组结果表明，与正常对照相比，iCAFs中整合素α3表达上调。这证明整合素α3β1可作为胰腺成纤维细胞分化的标志物。流式细胞术研究也证实了这一结论¹³。

.......

讨论

建立一个合适的体外模型来研究癌相关成纤维细胞（CAF）的分化是一项具有挑战性的任务。在尝试了多种方法后，我们得出结论：三维球体模型是一种更为实用、生理相关且具有临床意义的模型，可用于研究胰腺癌细胞与永生化CAF之间的相互作用。该模型可防止成纤维细胞因人为应激因素（如细胞培养塑料表面的刚度）而发生自发性分化，至少在短期培养条件（长达48小时）下如此。尽管本研究中所用球体的确切刚度未进行测量，但Ito等人曾利用集成机器人技术的微流控芯片评估了人脐静脉内皮细胞与间充质干细胞异质球体的刚度²²。他们在球体组装后第1天和第3天测定了异质球体的平均刚度指数。球体尺寸有所不同，间充质干细胞（MSC）似乎增强了其聚集能力，导致球体尺寸随时间减小（从135.5 µm减小至99.8 µm）^21,22。因此，球体的刚度也从5.0 × 10^-3 增加至7.5 × 10^-3 Pa²²。然而，由CAF与AsPC.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）	SIGMA-ALDRICH	D9542-10
6F12 抗层粘连蛋白 β3 亚基 小鼠（单克隆）			自制
A3IIF5 抗体α小鼠整合素β3亚基（单克隆）			由波士顿达纳-法伯癌症研究所 M. Hemler 教授惠赠
丙酮	SIGMA-ALDRICH	32201
牛血清白蛋白第五组分 - BSA	AppliChem	A1391
Alexa Fluor 488 山羊（多克隆）抗小鼠	Invitrogen	A11029
Alexa Fluor 488 山羊（多克隆）兔	Invitrogen	A11034
抗层粘连蛋白 γ2 亚基 小鼠（单克隆）	圣克鲁斯	sc-28330
抗NG2兔多克隆抗体 Millipore, AB5320	Millipore	AB5320
抗-α-肌动蛋白-小鼠单克隆抗体-Cy3标记	SIGMA-ALDRICH	C6198
AsPC-1细胞系	ATCC		由 Jorg Haier 教授实验室惠赠
台式离心机	Fisher Scientific	50-589-620	萌发
BM2 抗层粘连蛋白 α3 亚基 小鼠（单克隆）			由法国里昂国家科学研究中心（CNRS）Patricia Rousselle 教授惠赠
氯化钙（CaCl2)	Fluka	21074
离心	赛默飞世尔科技		Multifuge 1S-R
50 mL 离心管	康宁	430290
胶原酶B	罗氏	11088831001
I型胶原蛋白，大鼠尾部	Gibco	A10483-01
共聚焦显微镜	Zeiss		LSM 700 和 800
DMEM（高糖 4.5 g/L）	Lonza	BE12-604F
Dnase I	罗氏	10104159001
流式细胞仪	BD 生物科学		FACSCaliburTM
凝胶化基质	赛默飞世尔科技	A1413202	基质胶，Geltrex
山羊IgG，同型	DAKO	X 0907
马血清	SIGMA-ALDRICH	12449-C
人原代胰腺成纤维细胞	PELOBiotech	PB-H-6201
培养箱	Heraeus	B6060
层粘连蛋白-332	基底膜蛋白	LN332
MEM	SIGMA-ALDRICH	M4655
96孔U型底微孔板	Greiner Bio-One	650101
显微镜载玻片	赛默飞世尔科技	J1800AMNZ
小鼠 IgG，同种型	SIGMA-ALDRICH	I8765
多轴旋转混合器	CAT	RM5 80V
PANC-I	ATCC		由Jorg Haier教授实验室惠赠
多聚甲醛	Riedel-de Haën	16005
青霉素/链霉素	Gibco	15140-122
QuantiTect 反转录试剂盒	Qiagen	205310
大鼠IgG，同型	Invitrogen	10700
1.5 mL 反应管	Greiner Bio-One	616201
实时荧光定量PCR仪	Qiagen		Rotor-Gene Q
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
Rotor Gene SYBR Green PCR 试剂盒	Qiagen	204074
RPMI	Lonza	BE12-702F	加入葡萄糖至 4.5 g（0.2 μm 滤器）和 1% 丙酮酸钠
TritonX-100	SIGMA-ALDRICH	X100RS
Vórtex	科学工业公司		Vortex-Genie 2
μ- 未包被的滑片血管生成	Ibidi	81501