3D球形模型作为癌症相关纤维细胞分化和入侵体内研究的更多生理系统

肿瘤微环境是一个非常复杂的利基,对于肿瘤细胞^的维持和进展极为重要。它不仅由癌细胞形成,而且由基质成纤维细胞形成。肿瘤细胞被一个频闪包围,它特异性,不同于正常组织的频闪2。拉米宁-332是一种细胞外基质蛋白,在不同肿瘤的频闪中异位表达,如胰腺腺癌3。此外,ECM的生化成分及其生物物理特性,如刚度和张力,在肿瘤^体积4内发生变化。这种肿瘤频闪,或"反应频闪",是由成纤维细胞适应邻近的癌细胞和招募其他重要的玩家,为肿瘤进展发展一个有利和支持的环境造成的。基质成纤维细胞的分化导致癌症相关成纤维细胞(CAF)。这些细胞可以使用不同的标记物进行识别,如β-平滑肌活动(βSMA)5或神经/胶质抗原2(NG2)6。

最合适的体外模型,以CAFs重述肿瘤微环境(TME)是难以选择的。对于这种模型系统,必须考虑以经济高效和可重现的方式模拟TME生理参数的方法。在TME中,不同的过程,如增殖、分化、迁移和入侵不同的细胞类型发生。这些细胞过程可以单独使用不同的方法执行。然而,实验条件必须考虑细胞与肿瘤频闪ECM的相互作用,因为基底的刚度会影响CAF分化过程。R.G. Wells评论了基质刚度对细胞行为的影响,并强调在体外培养细胞中观察到的细胞骨骼组织和分化状态可能是技术事实7。不同的刺激似乎涉及CAF分化,包括机械张力5,7。为了避免这种情况,2D 软基板可能是分化研究的可能方法,因为它们避免了硬培养盘塑料的问题。可以种植成纤维细胞的软二维表面可以是胶原蛋白-I涂层聚丙烯酰胺凝胶,据此,通过聚丙烯酰胺和凝胶交联结剂的浓度来操纵凝胶刚度。富_SMA富应力纤维的附着力和形成在成纤维细胞中随着凝胶刚^度8而增强。这些结果强调了软基体支架对于更多生理体外分化模型的重要性。然而,在我们手中,这些凝胶的实验重现性和成像是具有挑战性的。为了克服这些缺点,我们改变了2D软基板系统为3D球形模型进行分化和入侵研究。该模型在临床上更相关,类似于体外有机体,在体内细胞-细胞相互作用、ECM生产和沉积以及细胞^行为9中重述。

当细胞缺乏附着基板时,形成球形。当细胞没有粘合表面时,它们聚合成或多或少的球形结构。如果球体由一种类型的细胞组成,它们称为同源体;如果由两种或两种以上的不同细胞类型组成,它们就形成杂血球体。

在球体制备的不同方法中,我们使用非粘附圆底96孔板执行协议。它在费用方面非常有效。在这里,我们生产成纤维细胞的同源体,CAF 或 CAF 缺乏集成 _3 亚单位来检查 CAF 或整数 #3 KO CAF 和胰腺管癌细胞(AsPC-I 和 PANC-I)的分化过程和杂物类,以研究入侵到周围的矩阵。

这些研究的目的是使用从人类胰腺癌活检中分离的原发性CAF。然而,获得细胞的活检很少,因此,这些研究中使用的CAF已经使用含有HTERT的扁豆病毒永生。它们被称为iCAF,它们的正常对应物,即原发性人类胰纤维细胞,被称为iNF。人类胰纤维细胞和胰腺管癌细胞AsPC-I和PANC-I已上市。

该协议用于研究拉明宁-332-一元相互作用在CAF分化过程中的影响。为了证明这种相互作用的特异性及其功能,使用了抑制剂化合物:BM2,一种单克隆抗体,它阻断了结合位点层的层素-332+3^链10,或lebein 1,一种蛇毒衍生化合物,可阻断拉米宁结合一元,[3]1,#6+1和#7+1^11,12。

对于入侵测定,细胞被转用于含有cDNA编码的慢病毒,其中mCherry(iCAFs和integrin+3 KO iCAFs)或GFP(AsPC-I和PANC-I)用于区分杂血球体中不同的细胞类型。细胞转导使其永生和/或用荧光蛋白(mCherry和GFP)表达标记,在先前^的研究13中进行了描述,应查阅,以了解更多信息。

1. 3D球体作为体外模型,用于使用细胞基质相互作用的不同TGF-#1抑制化合物进行成纤维细胞/CAF分化

1. 混合6mg/mL甲基纤维素溶液的1部分和细胞培养基培养基的3部分,MEM补充1%的热灭活胎儿牛血清(FBS)和1%青霉素/链霉素,以获得球形形成溶液。
2. 在球形形成溶液中重新悬浮新解冻的不朽正常成纤维细胞 (iNF)、不朽的 CAF (iCAF) 或 integrin #3+1 KO iCAF(通过至多 25)。如果制备一个96孔板,制备过量的球形形成溶液,10 mL,并添加75,000个细胞,请记住,每个球体由750个细胞组成,并且每个孔的100μL分布。
3. 如果研究中包括细胞因子或聚氨基抑制剂,将这些化合物添加到细胞悬浮液中,以便在形成过程中将其嵌入球体中。请注意,iNF 用 10 纳克/mL 的 TGF-α1 刺激,以触发分化。在适当情况下,将抑制剂化合物与TGF-β1一起添加,如20μg/mL BM2或10μg/mL的列贝因1。
4. 以同样的方式制备CAF同源体,但没有TGF-+1刺激,因为它们已经分化。在不添加任何化合物的情况下,制备整数#3 KO CAF同源体。
5. 通过在每口孔中添加100 μL溶液,将球形形成溶液分配到圆底96多孔板上。每次在井中分配球形溶液时,通过上下移液混合均匀,几次。
6. 将板放入细胞培养箱24小时,使每个孔中形成一个球形。
7. 约24小时后收集球体,并将其用于不同的下游目的:免疫荧光染色,实时(RT)q-PCR和流式细胞测定。要检测细胞内和细胞外抗原的表达,包括ECM蛋白在球体中的沉积,请使用免疫荧光染色。球体分裂成单细胞后,通过流式细胞测定对膜定位受体进行量化。要检测基因激活和转录变化,请使用从球体细胞中分离的 mRNA 的 RT q-PCR。

2. 球体的免疫荧光染色

1. 收集球体后约24小时到一个1.5 mL反应管每个实验条件或每个蛋白质进行分析。例如,将用TGF-β1刺激的iNF的球体放入与对照iNF不同的管中,后者未经处理。为了避免球体因剪切力太强而破裂,请切开移液器尖端的末端以放大孔。在一个反应管中至少包括5-10个球体,以便进行复制,并考虑洗涤过程中可能的损失。
2. 用台式离心机将球体离心,在1000 x g时约30-60s。通过移液小心地去除含甲基纤维素的上清液,而不会干扰颗粒球体。
3. 用 50 μL 的 1x PBS 清洗。重复离心步骤,并通过移液小心地拆下 PBS,如 2.2 中所述。
4. 根据要染色的蛋白质,在室温下用PBS中的50μL4%的甲醛固定20分钟(对于βSMA、NG2和整数+3+1),或在-20°C下用50μL甲醇固定10分钟(对于层素-332亚单位)。
5. 重复步骤 2.2-2.3 中所述的洗涤步骤。
6. 在室温下,用0.1%Triton-X在PBS中渗透细胞4分钟。
7. 重复步骤 2.2-2.3 中所述的洗涤步骤三次。
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这一实验设计的结果发表在马丁斯·卡瓦科等人13号上,建议进一步阅读从这些实验中得出的结论。

图1,免疫荧光球体的代表性图像,显示了不朽正常成纤维细胞和永垂的CAF的整数+3亚单位的免疫染色(图1A),以及免疫荧光qPCR 的定量 (图 1B) 和整数 -3 亚单位基因的转录水平 (图 1C)。该组结果表明,与正常对应物相比,iCAF 中集成 #3 处于向上调节状态。这证明,整数#3_1可被视为胰腺成纤维细胞分化的标记物。流量细胞学研究13也证明了这一点。

图 1.iN 和 iCAFs 表示的整数 =3 子单位。iCAF 对整数 #3 子单元进行调节,反映了其作为胰腺 CAF 的分化标记的潜力。(A) 与 iCAF 的同源类相比,正常胰纤维细胞 (iNFS) 同源体 (iNFS) 的免疫荧光染色显示分化细胞中 integrin _3 亚单位的信号增加。(B) 使用 ImageJ 软件,用 3D 球体的 Z 堆栈图像对球体中细胞的荧光信号进行量化。均值 = 三个独立实验的 SEM 通过 t 检验(*、p < 0.1)进行显示和比较。(C) 分析从分离球体中获得的细胞,其转录水平为一体组+3亚单位。均值 =Ct 值的 SEM 作为两个独立实验的折叠变化,通过 t 检验显示和比较。虽然没有达到显著性水平0.1,但iCAF中整数=3编码mRNA的转录水平高于iNF。请点击此处查看此图的较大版本。

表 1.异体和同源体的细胞组成。下表总结了组装异体体和同源体所需的细胞数量以及应用于球形形成溶液的相应介质。

补充图1。使用 ImageJ 对球体中感兴趣的蛋白质的免疫荧光染色进行定量的连续步骤。请点击此处下载此文件。

补充图2。使用 ImageJ 定量入侵测定中入侵癌细胞数量的顺序步骤。请点击此处下载此文件。

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