提出一种通过手术切除所有眶部泪腺在兔体内诱导慢性干眼病的新型方法。该方法不同于以往报道的方法，可产生稳定且可重复的水样缺乏型干眼模型，非常适合用于研究泪液生理学与病理生理学以及眼表治疗药物。
本文内容
摘要
摘要
干眼症（DED）是一种具有多种病因和可变症状的复杂疾病，其关键的病理生理步骤是眼表炎症。尽管对DED的认识已取得进展，但重要的知识空白仍然存在。部分由于缺乏信息丰富的动物模型，相关研究进展受到限制。作者近期报道了一种通过向所有眶内泪腺（LG）组织注射植物血凝素刀豆蛋白A来诱导DED的方法。在此，我们报道一种基于手术切除全部眶内LG（泪腺切除术）组织的新型水样缺乏型DED模型。这两种方法均使用兔子，因为其眼表的大小和结构与人类眼睛相似。在切除瞬膜一周后，在麻醉条件下手术切除眶内上泪腺，随后切除睑部上泪腺，最后切除下泪腺。泪腺切除术诱导出严重的DED，表现为泪膜破裂时间试验和Schirmer泪液试验显著降低，泪液渗透压显著升高，以及玫瑰红染色增强。由泪腺切除术诱导的DED持续至少八周。实验过程中未出现并发症，动物对手术耐受良好。对于具备足够手术经验并熟悉相关兔解剖结构的研究者而言，该技术相对容易掌握。由于该模型重现了人类水样缺乏型DED的特征，因此适用于眼表稳态、DED及相关候选治疗药物的研究。
引言
泪液对于保护眼表以及维持角膜的光学特性至关重要。泪液由三层组成：内层的黏蛋白层、中间的水性成分以及外层的脂质层1。黏蛋白层主要由结膜中的杯状细胞产生，水性成分主要来源于泪腺（LGs），而脂质层则主要由睑板腺分泌1,2。眶部泪腺是泪液中水性成分以及多种保护眼表免受细菌侵袭的蛋白质的主要来源3。当水性泪液的分泌量降低至临界水平以下时，会导致眼球上皮表面缺乏水性成分以及多种关键的泪液成分，如生长因子、溶菌酶和乳铁蛋白，从而引发眼表疾病。在泪腺泪液分泌减少的情况下，结膜和角膜组织会发生适应性改变，以应对环境的变化。
了解来自眶部泪腺的泪液成分及其在缺失时眼表的代偿机制，有助于我们深入认识眼表前段的生理与病理生理过程，更广泛地说，也有助于理解整个眼球的健康与疾病状态。针对这些问题的实验研究需要一个具有信息量的动物模型。因此，多个研究团队尝试建立去除眶部泪腺的动物模型，以促进评估泪液在眼表健康中的作用。小鼠的此类模型最近已有报道4。然而，与啮齿类动物模型相比，兔具有诸多显著优势，包括泪腺在解剖和组织学结构上与人类更为相似，而更重要的是，其角膜和结膜组织的大小及表面积与人类相应组织更为接近3。
通过手术切除兔的泪腺（LG）组织来建立水液缺乏型干眼病（DED）并非新方法。已有大量文献报道了切除泪腺组织的实验，其成功率不一，表现为Schirmer泪液试验测得的泪液分泌量变化程度不同5,6,7,8。充分了解兔的相关解剖结构并明确解剖学术语，对于成功重复该方法非常有帮助。下文将对此进行系统概述。
泪腺的解剖结构
兔子有两对眶部泪腺：较大的下泪腺（ILG）和较小的上泪腺（SLG；图1）。ILG沿眶缘的下方和后方延伸。除大小存在个体差异外，ILG的前部具有相对均一的结节状外观，在眼球下方的皮肤表面可见为一突起（图2）。由于其相对于腺体其他部分具有特征性的形态，因此被称为ILG的"头部"。头部的一部分绕行并附着于颧骨的外表面，这一结构在超声生物显微镜检查中可作为有用的解剖标志，用于引导对ILG的注射。ILG头部的其余部分则位于眼眶内更偏内侧的位置9。
由于ILG残余部分具有细长的特征性外观，该节段被称为"尾部"。尾部沿眶下缘走行，从ILG头部延伸至眶缘，并在下部和后部眶缘处以变异的解剖形态终止（图3A）。尾部的大部分行程位于颧骨深面（内侧），被一束筋膜与眶内容物分隔，直至到达眶后缘，随后再次延伸至颧骨的外表面。ILG的血液供应来自颈动脉的分支。
SLG具有两个类似于人类的组成部分。其中一个为睑部上泪腺（PSLG），位于睑板上方后部眼睑的内侧。该部分呈结节状，具有多个点状开口，可排出水样泪液，当使用2%荧光素染色后，这些开口更易于观察（图3B）。
第二种是眶上泪腺（OSLG），位于眼眶上部内侧位置（图3C）。由于其靠近颅骨中线，因此无法通过颞部或眶下等外部手术入路成功识别。在新鲜尸检样本或手术病例中，当对眼球施加轻柔的内侧压力时，该腺体可通过颅骨背侧表面的后切迹脱出。这种腺体组织的脱出可通过超声生物显微镜进行记录。
PSLG 和 OSLG 是相邻的结构。OSLG 是一种管泡状结构，其导管结构汇合成主排泄管。该导管经眶上嵴下方走行，穿过上睑组织，最终终止于 PSLG。沿排泄管分布的腺体组织与 Davis 最初的描述一致，已被确认10（图 3D）。
关于术语的说明
优秀的全面解剖学描述也使用不同的术语。Davis 经典的眼眶解剖学仅定义了上、下泪腺10。然而，他对上泪腺的描述明确地详述了此处更具体定义为眶上泪腺（PSLG）和眶侧泪腺（OSLG）的部分，而他对下泪腺的描述则对应于此处定义为下泪腺（ILG）的头部和尾部。一部较新且更为详尽的解剖学图谱11将这些组织定义为颧腺和副泪腺。本文使用“"泪腺"”一词来涵盖上述的 PSLG 和 OSLG。该术语更适用于在不引起过度混淆的情况下重现本方法。
方案
所有脊椎动物实验均按照并遵守所有相关的监管和机构指南进行。所有研究均经纽约州立大学石溪分校机构审查委员会批准，并遵循视力与眼科研究协会（ARVO）关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明进行。
1. 动物与饲养
- 使用体重为 2−3 kg 的新西兰白兔（NZW）。
- 将兔子单独饲养于严格控制的环境中：温度（65 ± 5 °F）、湿度（45 ± 5%）和光照（12 小时开/关循环）。
注意：由于群养兔子之间常表现出攻击性行为，应将动物单独关养在笼中，以防止意外的眼部损伤。 - 为兔子提供自由取用的标准兔粮和饮水。
- 不提供其他任何饮食补充物，以避免意外的维生素 A 补充，从而影响干眼症（dry eye）的实验结果。
- 在记录干眼症（DED）参数前，至少进行两周的适应性饲养。
2. 瞬膜的切除
注意：为简便起见，下文仅描述右眼的操作技术。左眼操作应以完全相同的方式进行。
- 在适应期（通常为第一周）期间，双侧切除瞬膜。
- 将兔子放入大小合适的固定袋中。
- 使用1 cc注射器和26 G针头，在肩部区域皮下注射乙酰丙嗪（1 mg/kg）以镇静兔子。轻度镇静的终点表现为动物头部保持放松位置，无正常的扫视运动，且耳朵不再完全直立。
- 使用微量移液器，向眼内滴加25 µL不含防腐剂的利多卡因（1%）。将金属眼睑拉钩插入眼睑之间。
- 用0.3齿镊子（或同等工具）夹住瞬膜顶端，并将其拉至角膜表面。使用26 G针头，将含1:100,000肾上腺素的1%利多卡因注射至瞬膜的结膜下间隙。注射约0.3 mL，使瞬膜表面形成中等大小的水疱。注射量超过1 mL仍在兔子的安全剂量范围内（2−4 mg/kg）。
- 移除金属眼睑拉钩。等待约5分钟，使利多卡因和肾上腺素发挥作用。在此期间，对对侧眼执行相同操作。
- 重新插入金属眼睑拉钩。用0.3齿镊子夹住并拉伸瞬膜覆盖于角膜表面，使用肌腱切断剪或等效器械在瞬膜基底部将其剪除。
注意：通常出血较少，但应备好高温电池烧灼装置，必要时用于控制出血。若发生少量出血，也可直接压迫瞬膜切断处的基底部以止血。 - 移除金属眼睑拉钩。在角膜表面涂抹局部抗生素软膏（新霉素、多粘菌素、杆菌肽和氢化可的松）。
- 根据实验方案要求，对对侧眼执行相同的操作。
- 将动物放回单独的笼子中，至少恢复一周，或直至结膜表面在临床上完全愈合后，方可进行任何进一步的检测或干预。
注意：临床完全愈合的指征为结膜表面无任何肿胀、充血或分泌物。动物应能正常睁眼，无保护性上睑下垂现象。
3. 干眼参数的测量与泪液样本的采集
- 根据实验方案的需要，测量以下干眼症（DED）参数：泪液渗透压、泪膜破裂时间、Schirmer泪液试验和玫瑰红染色。操作步骤参照先前描述12，由至少两名研究人员组成的团队进行。
注意：至少两名研究人员组成的团队可在相近的时钟时间高效地测量较大数量的动物（6只或以上），从而避免可能的昼夜节律变化对结果造成影响。
4. 手术准备与麻醉
- 将动物置于固定袋中，皮下注射上述剂量的乙酰丙嗪（1 mg/kg）进行轻度镇静。
- 去除面部和颅骨背侧的所有毛发，以显露手术解剖标志。
- 使用剪刀修剪毛发，残留毛发长度约1 mm（图4A，左图）。
- 按照制造商说明，使用温和的脱毛膏彻底清除残留毛发（图4A，右图）。
- 使用手术记号笔标记手术切口位置。
- 通过向眼球施加内侧压力，使眼睑后切迹处皮肤因眶上泪腺（OSLG）脱出而出现轻微隆起，从而确定后切迹上方的切口位置。
- 使用手术记号笔在颅骨背侧皮肤上，沿此位置前后方向画一条长2 cm的直线标记。
- 计划切除眶下泪腺（ILG）时，在眼睛周围标记一条长而弯曲的线（距离下睑和颞侧睑缘约1 cm），从后方（颞侧）眼眶延伸至前方（内侧）内眦。标记线应沿后眼眶延伸至内眦水平或略高于该位置（图4B）。在某些解剖过程中，切除OSLG和ILG的切口将相互连接。
注意：若进行双侧手术，此时应同时标记双侧眼眶。
- 使用剪刀在每侧大腿外侧表面修剪一块宽2至3 cm的毛发区域，以便放置单极电凝板。
- 涂抹超声耦合凝胶，以确保单极电凝板与皮肤之间有良好的电接触。
- 在耳缘静脉之一插入25 G静脉（IV）导管，必要时用于给药或输液。
- 通过静脉通路给予皮下赛拉嗪（1 mg/kg）和静脉氯胺酮（15 mg/kg），作为麻醉诱导（通过静脉通路给药）。
注意：若兔在术前已使用乙酰丙嗪镇静，且镇静程度足以维持步骤2.3中所述终点，则可改用异氟烷面罩麻醉作为替代方案。 - 放置喉罩气道，并使用弹性带或绳子固定，以确保并维持气道通畅。
- 将喉罩连接至麻醉机，氧气流速设定为1 L/min。
- 初始异氟烷浓度设为5%，随后根据动物镇静水平耐受情况逐步降低。
- 在最终伤口缝合前，维持异氟烷浓度不低于2%。
注意：通过监测呼吸频率及对手术或疼痛刺激的反应性运动来评估镇静深度。若呼吸频率超过每分钟10次、兔开始咬合气道维持装置，或出现对疼痛刺激的任何反应性运动，应加深麻醉。
- 使用多参数监护仪或其他适当设备监测脉搏血氧饱和度、二氧化碳波形图、血压、直肠体温和心率。
- 在手术过程中持续监测生命体征，并每10至15分钟记录一次。
- 将兔置于手术室（OR）台面上的加热垫上，以防止低体温。将手术台调整为约30°的反向特伦德伦堡位，以减少术中出血。
- 使用无菌水将聚维酮碘溶液稀释至半浓度，对手术区域进行消毒，并铺巾以维持无菌术野。
5. 完整的手术泪腺切除术
注意：本文所述的完整手术性泪腺切除术使用0.3组织镊、斜视剪、无齿组织镊和剪刀完成。根据外科医生的偏好，这些器械可替换为功能相似的同类器械。
- 首先移除 OSLG。
- 用5 cc注射器配30 G针头，将2%利多卡因（含1:100,000肾上腺素）与0.5%布比卡因按1:1比例混合的溶液浸润切口部位（手术记号笔标记线及上睑后部）图5A).
注意：注射器和针头的尺寸并非关键。 - 使用连接电外科设备的科罗拉多针，沿手术标记做皮肤切口。设置参数可根据临床反应调整，通常切割和凝固功率均设定在10至15单位之间图5B).
- 在皮肤切口两侧施加对向张力，以分离组织并暴露下方的额肌-皮下肌纤维。
- 对眼球施加内侧压力，以帮助观察位于额皱肌纤维内侧或深部的球后泪腺（OSLG），其表现为隆起的组织。如有必要，可将这些肌纤维移向一侧，以暴露其下方的切迹。
- 使用齿状镊（0.3）和囊膜切开剪，轻柔牵拉并剪开覆盖在 OSLG 上的纤维囊。OSLG 通常呈淡黄褐色图5C).
- 使用有齿或无齿镊子夹住 OSLG 腺体组织，轻轻将其从上方切迹处拉出 "手把手" 技术。使用囊膜切开剪剪断小的纤维束，使腺体从眼眶内的位置松解出来（图5D).
注意：当切除OSLG腺体组织时，其将开始聚集成一个大的管状结构（主排泄管）。 - 当尽可能完整地切除腺体后，使用电凝钩进行充分电灼，产生组织炭化，尽可能深地在切迹内截断腺体。此炭化区域将在后续切除对侧甲状旁腺时作为确认的解剖标志。
- 用5 cc注射器配30 G针头，将2%利多卡因（含1:100,000肾上腺素）与0.5%布比卡因按1:1比例混合的溶液浸润切口部位（手术记号笔标记线及上睑后部）图5A).
- 移除 PSLG。
- 使用棉签翻转上眼睑。PSLG 的球状末端通常清晰可见。
注意：在某些解剖过程中，可能观察到主排泄管呈淡色线状结构，宽约1至2 mm。 - 用齿状镊（0.3）夹住睑板腺囊肿，将其从眼睑表面牵开，同时使用囊切开剪在其基底部周围剪切，使其与下方的睑板分离图6A).
- 使用单极电凝控制中度出血。
- 对分离的组织施加持续牵引力，以维持解剖层面。这将有助于一并切除舌下腺的主要排泄管。图6B).
注意：解剖过程中通常会推进至眶上缘，在此处可观察到因切除位置更靠上且偏内侧的OSLG而留下的电灼痕迹。
- 使用棉签翻转上眼睑。PSLG 的球状末端通常清晰可见。
- 切除 ILG。
- 至少等待5分钟，以确保局部麻醉药起效。
- 使用科罗拉多显微解剖针切开皮肤、下眼睑降肌、颧肌的颧唇部分以及眼轮匝肌，并按照5.1节中OSLG的方法进行分离。
- 使用单极电凝保持止血。
- 当切口沿皮肤标记逐渐深入时，注意观察颧骨或咬肌浅层表面筋膜层的光泽。此时应保持在筋膜层面，并使用科罗拉多针头向上分离至眶缘进行切割图7A).
注意：为了便于识别下斜肌（ILG），最好在下斜肌头部进行解剖操作，该部位通常位于眼球前缘下方。 - 在识别并切开围绕 ILG 的囊膜后，辨认出 ILG 的浅褐色组织。仅可见 ILG 头部的前部（图7B）。然而，头部可沿内侧追踪，当其经过颧弓下方时，移行为尾部（图7C).
- 使用肌腱剪沿下眶缘剪开眶隔，暴露ILG尾部更靠后的位置。一旦确定组织平面，沿整个切口线向后延伸解剖图7D).
注意：ILG 的导管穿过下方的纤维结缔组织，进入眼睑颞侧的下结膜腔。在后缘处，ILG 的尾部可呈现不同的解剖形态。有时其末端位于后（外侧）眦下方，而在其他解剖标本中，它可更向上延伸，绕行于颞侧眼眶周围。 - 务必格外小心，避免意外损伤颈动脉分支为ILG提供的血液供应。在解剖的这一阶段可观察到该血供结构。图7E).
- 在尾部终止于后（外侧）眶下缘的情况下，可能需要切开额耳肌的颞部以暴露位于颧骨沿线的ILG尾部。
- 在完整分离并暴露整个ILG后，将其移除。由于其体积较大，通常建议使用剪刀将腺体切成两半，分别移除头部和尾部。
- 移除ILG头部时需格外谨慎，因其紧邻眼眶内一个大型静脉窦。尽管在手术切除过程中尚未发生过该结构出血的情况，但仍应备足止血器械以降低此风险。
- 在完全切除所有腺体组织后，使用多个间断的5-0聚对苯二甲酸乙二醇酯缝线关闭深层结缔组织平面。用连续的6-0聚乳酸-羟基乙酸共聚物910缝线缝合浅层肌肉和皮肤。图7F使用0.3组织镊和持针器。
6. 术后护理
- 揭开动物身上的覆盖物，并用无菌水清洁手术部位。
- 在切口处涂抹局部眼用抗生素和类固醇软膏（新霉素、多粘菌素、杆菌肽和氢化可的松）。每日两次，持续2天。
- 使用26 G针头，在肩胛骨上方皮下注射20 mL生理盐水。
- 使用1 cc注射器和30 G针头，皮下注射布托啡诺0.01 mg/kg或酮洛芬3 mg/kg以控制疼痛。
注意：动物通常在1−2天内恢复正常的饮食和活动。术后应至少每周评估兔子是否有感染的临床体征，如切口部位出现进行性肿胀、疼痛、红斑、发热或脓性分泌物。还必须观察动物是否开始抓挠切口部位或缝合线。在进行泪腺切除术前修剪所有爪子可能有助于防止抓挠。若发现动物抓挠切口线，可使用标准保护性颈圈以防止自伤。 - 逆转麻醉状态。
- 当动物对刺激产生反应并开始出现自主咀嚼动作时，但在气道维持装置可能被损坏之前，移除气道维持装置。
- 监测动物约1−2小时，或直至其完全从麻醉中恢复，表现为在笼内可自主活动。
- 评估动物的疼痛情况，并给予适当处理。
- 手术后应让动物至少恢复1周，方可进行任何干眼症（DED）的临床测量。
结果
此处描述的完整泪腺切除术在8只动物上实施。该手术需要中等程度的外科操作技能。双侧手术的平均手术时间约为2.2小时（不包括瞬膜的切除，瞬膜切除为单独步骤，需另行操作）。 <10分钟。手术过程中无死亡或术中并发症发生，除少量电凝止血外，未有任何兔子需要其他止血措施。
我们的手术方法成功地在所有眼球中诱导出干眼症。这一点通过一系列干眼症的临床和实验室标志物得到了证实（表1）。在为期8周的观察期间，平均TBUT被抑制至术前水平的75%以上（p < 所有时间点的P值均为0.0001）。类似地，Schirmer泪液分泌试验结果下降约50%，并在为期8周的观察期间持续维持在该水平；随访期间未见恢复趋势。术后泪液渗透压升高约10%，符合干眼病（DED）表现，并在术后至少8周内持续维持。角膜玫瑰红染色亦加重，在8周随访期间未见恢复迹象。图8所有接受完全泪腺切除术的眼均显示杯状细胞数量显著减少，以及符合干眼症特征的上皮改变（结膜印迹细胞学检查）。
图1：兔泪腺解剖结构（右眼）。 眶部上泪腺（OSLG）由较大的眶部和较小的睑部组成。较大的下泪腺（ILG）分为前部/头部和后部/尾部。坐标轴显示了文中所有方位描述所使用的术语。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：ILG头部的位置。去除毛发后右侧面部的侧面观。 眼眶前下方皮肤轮廓的隆起（由粗箭头指示）表明ILG头部的位置，该结构位于此处颧骨的外表面。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：眼眶泪腺。（A）右侧下泪腺（ILG）经伊文思蓝染料染色后显示，ILG尾部（红色箭头）紧邻颧骨内侧（黑色箭头），位于眼球下方，位置接近。（B）来自睑部上泪腺（PSLG）的泪液分泌。局部应用2%荧光素后拍摄的时间推移照片。由PSLG分泌的水样液体稀释了初始呈深蓝色或黑色的荧光素染料，使其变为亮黄绿色（类似于Seidel试验结果）。（C）兔颅骨中眼眶上泪腺（OSLG）的位置，位于颅骨中线附近（虚线）的后切迹内（箭头）。伊文思蓝染料被注入OSLG和睑部上泪腺。（D）经苏木精和伊红染料染色的组织病理学横切面，显示右上眼睑后部（颞侧）穿过OSLG主排泄管的组织切片，主排泄管周围可见少量腺体组织（箭头）。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：手术部位准备。（A）左上图：使用剪刀去除长毛。随后用温和的脱毛膏彻底清除残留的细毛。右上图：完全脱毛后的最终外观，便于进行手术标记以及对下泪腺（ILG）实施高质量超声检查。（B）显示右侧眼周区域的适当手术标记；在此示例中，为切除上泪腺（OSLG）和下泪腺（ILG）所设计的切口已连接，形成一条较长的曲线形切口。后方切迹的位置由曲线形切口标记处的一个短横线表示（箭头）。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：OSLG 的移除。 （A）使用 2% 利多卡因（含 1:100,000 肾上腺素）与 0.5% 布比卡因按 50:50 比例混合的麻醉剂，注射至眼睑上方及切口线周围，以浸润手术区域，减少操作过程中的不适感。（B）使用科罗拉多显微解剖针沿预先标记的手术切口线切开皮肤及浅层肌肉组织。对伤口施加轻柔牵引，有助于建立解剖平面。沿切口线等距位置使用科罗拉多针产生微小点状烧灼（箭头），以便在伤口闭合时实现组织的最佳对位。（C）在后部切迹上方的组织被游离后，OSLG 得以暴露（箭头）。腺体包膜已被切开。通过向眼球施加内侧压力，可使 OSLG 突出，便于其移除。（D）使用镊子夹住 OSLG，并通过后部切迹将其从眼眶深部位置轻柔取出。请点击此处查看该图的放大版本。
图6：切除睑部上泪腺（PSLG）及排泄管。（A）翻转上眼睑后，用镊子夹住PSLG的膨大部分，并用剪刀将其从睑板上分离。用镊子对PSLG施加牵引力，对于维持正确的手术层面至关重要。（B）使用锐性分离技术，并持续牵引腺体和导管组织，将PSLG及主泪管向上朝向眶缘方向分离。分离应继续进行至先前切除眶部上泪腺（OSLG）的位置。请点击此处查看该图的放大版本。
图7：ILG的切除过程。（A）切开皮肤及浅层肌肉，直至暴露覆盖在颧骨或咬肌浅层的筋膜平面。ILG的头部通常表现为位于前缘下方的一个小隆起，清晰可见。（B）用剪刀切开ILG的纤维囊，暴露腺体。一旦切开囊膜，即可轻松摘除腺体的深层部分。（C）位于颧骨表面的ILG头部最外侧部分已被暴露，并向前翻起，显示出其下方的颧骨。（D）沿眶下缘切开眶隔，暴露ILG的尾部。（E）颈外动脉的一个分支供应ILG的尾部（箭头所示）。（F）完全切除泪腺后，皮肤切口缝合完毕的外观。请点击此处查看该图的放大版本。
图8：角膜表面的玫瑰红染色。 外部照片显示明显的染色，尤其以鼻侧象限最为显著。所有接受完全泪腺切除术的眼均出现类似改变，术后1周即可观察到，并持续至少6周。值得注意的是，环形闪光灯产生的光反射因眼表干燥而出现扭曲，表明干眼可对视力产生不利影响。请点击此处查看该图的放大版本。
| 泪腺切除术 | ||
| 均值 ± 标准误；n = 16 只眼 | ||
| 基线 | 第2周 | |
| 泪膜破裂时间，s | 60.0 ± 0.0 | 4.5 ± 1.2 |
| p < 0.0001 | ||
| 泪液渗透压，mOsm | 291.2 ± 3.7 | 315.3 ± 5.5 |
| p = 0.001 | ||
| Schirmer 泪液试验，mm | 18.3 ± 1.3 | 10.5 ± 1.6 |
| p = 0.0006 | ||
| 玫瑰红染色，改良NEI评分 | 0.0 ± 0.0 | 4.28 ± 0.6 |
| p < 0.0001 | ||
| 操作的 与基线： 泪腺切除术： TBUT，p < 0.0001；泪液渗透压，p < 0.001；Schirmer 泪液试验，p < 0.0006）；以及玫瑰红。 | ||
表1：术后第2周的干眼参数。
讨论
根据对泪膜稳定性的影响，干眼症（DED）可分为两大类：水样缺乏型（泪膜水样成分生成减少，约占DED的20%）和蒸发过强型（泪膜蒸发增加，约占DED的50%）。约30%的DED患者表现出两种类型的特征（混合型DED）。炎症是DED的核心发病机制，其多种病因最终均汇聚于此13,14。本方法建立的是水样缺乏型DED模型。
如前所述，重现本方法的重要第一步是充分理解兔眼眶泪腺（LGs）解剖结构的细微之处，并避免因多样且有时相互矛盾的解剖学术语而产生混淆。Popesko 等人编写的解剖学图谱11极为详尽。对于不熟悉兔解剖结构的研究者而言，通过解剖尸检标本可轻松熟悉这些结构，有助于在活体标本中进行手术切除。
有关动物饲养和适应的注意事项已在我们的配套出版物中给出12。同一篇文章还提供了适用于两种方法中干眼病（DED）参数检测的有益建议。
与先前的方法12相比，该方法需要更高的外科手术技巧，因为切除泪腺（LGs）所需的技术范围更广且更具侵入性。此类切除术中最大的风险是损伤靠近泪腺的主要血管（如颈动脉分支）导致的大出血。通过充分显露手术视野中每个泪腺及其边界，可避免这一风险。最后，过度切除瞬膜可能导致哈氏腺脱出，从而干扰泪膜的评估。
在切除PSLG时，应注意尽量减少对结膜的损伤，这是我们方法的一个新特点，有助于提高实验的可重复性并增强干眼病（DED）的严重程度。只要对组织施加适当的牵引力，就很容易建立分离平面并将其延伸至眶上缘。在切除OSLG时，能够看到电凝标记令人放心，这些标记可确认腺体主要排泄管已被完全切除。
完整切除ILG也存在一定的挑战。应首先分离腺体头部，因为这是最易于观察的部分。整个腺体头部可较容易地与周围组织分离；然而，操作时需格外小心，以避免损伤位于ILG头部内侧的大静脉窦。随后可沿ILG尾部向后追踪，其走行经过颧骨下方。尾部的大部分区域较易分离，但最尾端部分可能更具挑战性，因其解剖结构存在变异，且邻近颈动脉的一个中等大小分支。通过细致的解剖，应能清晰显露ILG的所有边缘，从而实现完整切除。当腺体尾部终止于外眦下方时，研究者应做好将解剖层次向更上方延伸的准备，这一点在先前关于泪腺解剖结构的讨论中已有说明。值得注意的是，作者在通过沿颞部及眼球下方的弧形切口解剖ILG时，从未成功辨认出任何OSLG部分。尽管从技术上讲可能存在这种可能性，但该手术入路导致严重出血的风险过高。通过后切迹入路处理OSLG则安全得多。
ILG 的排泄管在穿过下方筋膜平面进入下结膜穹隆时可见。有时在此处也可观察到呈腺体样外观的小叶状组织，可小心予以切除。
按照本文所述顺序进行舌下腺切除非常有帮助。如果先切除内侧舌下腺（ILG），则外侧舌下腺（OSLG）的分离在技术上会困难得多。主要原因是，在切除内侧舌下腺后，外侧舌下腺难以突出显露，因而不易辨认。
本模型的一个显著优势在于其具有"模块化"的特点。换句话说，通过摘除泪腺所诱导的干眼症（DED）程度可根据实验需求进行校准。例如，完全切除所有泪腺（LGs）将导致最严重的干眼症，仅切除浅层泪腺（SLG）则引起最轻度的干眼症，而仅切除眶内泪腺（ILG）则产生中等严重程度的疾病。
我们的方法能够重现泪液分泌减少这一独特的病理生理过程，与已有报道的方法相比具有额外优势。简而言之，目前尚无其他手术模型能够完全消除所有眶部泪腺（LGs）的泪液分泌5,6,7,15,16；包括泪腺的副交感神经去神经支配17以及药理学抑制泪液分泌18,19，而后两种方法均存在显著的脱靶效应，构成重要混杂因素。最后，该模型最大限度地减少了主要由研究者操作带来的偏倚，即泪腺切除不完全的问题，因为该手术技术可实现泪腺的完全可视化；此外，除电灼外无需其他止血措施，也有助于手术操作。
研究者应当认识到，完全切除所有眶部泪腺（LGs）并不会导致泪液完全消失，例如，不应期望泪液分泌试验（Schirmer's tear test）的数值接近零。这是因为泪液始终存在其他来源，例如Wolfring和Krause的副泪腺以及结膜血管的血浆渗漏20,21,22。从实验角度来看，这应被视为该方法的一个积极方面，因为它能够维持眼表的完整性；若发生完全性干眼症，则会彻底破坏角膜，从而使模型失去研究价值。此外，目前该模型为研究此类代偿机制以及这些较小腔室间的液体转运提供了极佳的机会。
总之，本文介绍了一种新型且用途广泛的诱导水液缺乏型干眼病（DED）的方法，该方法适用于泪液生理学、DED发病机制以及针对此适应症正在研发的治疗药物的研究。
披露
作者声明不存在利益冲突，但BR除外，其在Medicon Pharmaceuticals, Inc.和Apis Therapeutics, LLC持有股权；以及LH，作为Medicon Pharmaceuticals, Inc.的员工，在Apis Therapeutics, LLC持有股权。
致谢
我们感谢纽约州塞托凯特石溪大学医学院提供的目标研究机会资助以及Medicon Pharmaceuticals, Inc.提供的研究资助。感谢Michele McTernan在编辑方面提供的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙酰丙嗪，Aceproinj | Henry Schein 动物健康公司，俄亥俄州都柏林 | NDC11695-0079-8 | 0.1 ml/kg 皮下注射用于兔镇静 |
| 麻醉蒸发器 | VetEquip，普莱森顿，加利福尼亚州 | 货号 # 911103 | 方案 4.8 |
| 动物固定袋 | Henry Schein 动物健康公司，俄亥俄州都柏林 | Jorvet J0170 | 使用合适尺寸的袋子。 |
| 布比卡因，0.5% | Hospira 公司，伊利诺伊州莱克福里斯特市 | NDC：0409-1162-02 | 用2%利多卡因与1:100,000肾上腺素按50:50比例混合，用于切口部位浸润麻醉，方案5.1 |
| 布托啡诺 | Henry Schein 动物健康公司，俄亥俄州都柏林 | 0.01 mg/kg，用于术后护理，6.1.4 | |
| 电凝装置，高温，电池供电 | Medline Industries Inc，美国伊利诺伊州北区 | REF ESCT001 | 备用以应对出血情况，方案 2.7 |
| Wahl Mini Arco 修剪器 | Henry Schein 动物健康公司，俄亥俄州都柏林 | 编号 022573 | 用于毛发去除的无线剪刀，方案 4.2 |
| 科罗拉多针 | 美国密歇根州卡拉马祖市，史赛克颅颌面公司 | N103A | 与电外科设备配合使用以进行切口操作，方案 5.1 &和 5.3 |
| 单极电外科发生器与电灼板 | Valleylab，博尔德，科罗拉多州 | Force FXc | 与电外科设备配合使用以进行切口操作，方案 5.1 &和 5.3 |
| 荧光素，Ak-Fluor 10% | AKRON，伊利诺伊州，湖林 | NDC17478-253 | 用 PBS 稀释至 0.2% 以测量泪膜破裂时间（TBUT），干眼参数测量，方案 3.1 |
| 弯头敷料镊 | 博士伦（Storz），新泽西州布里奇沃特 | Storz E1406 | 精细锯齿状敷料镊 |
| 镊子，0.3 | 博士伦（Storz），新泽西州布里奇沃特 | ET6319 | 为去除瞬膜，请参见方案 2.5 |
| 镊子，Bishop Harmon | 博士伦（Storz），新泽西州布里奇沃特 | E1500-C | 使用有齿镊进行泪腺切除术，方案 5.1 &和 5.2 |
| 脱毛乳液，Nair | 广泛可用 | 软化婴儿油 | 适用于敏感肌肤的脱毛膏，方案 4.2 |
| 异氟烷 | Henry Schein 动物健康公司，俄亥俄州都柏林 | 29405 | 可能的替代镇静方案，方案 4.7 |
| IV导管，Terumo Surflo ETFE 24号规格 | 日本东京 Terumo 公司；可从 Fisher Sci.、VWR、McKesson 等供应商处获取 | SR-OX2419CA | 25号针头用于较小的兔子；方案4.6 |
| 氯胺酮 | Henry Schein 动物健康公司，俄亥俄州都柏林 | NDC 11695-0701-1；NADA 200-055 | 15 mg/kg，方案 4.7 |
| 酮洛芬 | Hospira, Inc., 湖林, IL | 3 mg/kg，用于术后护理，6.1.4 | |
| 喉罩气道 | Docsinnovent有限公司，英国伦敦 | Vgel R3 | 方案 4.8 |
| 睑板拉钩，导丝 | 博士伦（Storz），新泽西州布里奇沃特 | Barraquer SUH01 | 为去除瞬膜，请参见方案 2.4 |
| 含1:100,000肾上腺素的2%利多卡因；50:50混合液 | Hospira公司，伊利诺伊州莱克福里斯特 | NDC 0409-3182-02 | 去除瞬膜前的预处理，方案 2.4 |
| 利多卡因，无防腐剂 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | L5647 | PBS 中 1% 的麻醉剂，用于眼部给药，方案 2.4 |
| 微量移液器 | Eppendorf | 研究型 Plus 100 μL | 用于无防腐剂利多卡因眼部应用，方案 2.4 |
| 微量移液器吸头 | 全球医疗产品 | 41071052 | 向眼部应用无防腐剂利多卡因，方案 2.4 |
| 监测设备，多参数 | SurgiVet，威斯康星州沃基夏 | V9201 | 用于生命体征监测，方案 4.9 |
| 26号针头 | BD，美国新泽西州富兰克林湖 | REF 305115 | 用于利多卡因/肾上腺素注射的方案 2.3 &和 2.5 |
| 30号针头 | BD，美国新泽西州富兰克林湖 | REF 305106 | 用于切口部位的浸润；注射器和针头尺寸无严格要求，见方案5.1 |
| 渗透压提示 | TearLab 公司，加利福尼亚州圣地亚哥 | #100003 REV R | 测量干眼参数的泪液渗透压，方案 3.1 |
| 渗透压仪，TearLab | TearLab 公司，加利福尼亚州圣地亚哥 | 型号#200000W REV A | 测量泪液渗透压，干眼参数测量，方案 3.1 |
| 聚维酮碘溶液 | Medline Industries Inc，美国伊利诺伊州北区 | PVP 预处理溶液，NDC：53329-939-04，货号 MDS 093944 | 为保持无菌环境，参见步骤 4.11 |
| 新西兰白兔 | 查尔斯河实验室，马萨诸塞州沃尔瑟姆（NZW） | 2-3 kg | 实验动物 |
| 玫瑰红染色 | Amcon Laboratories Inc.，密苏里州圣路易斯市 | NDC51801-004-40 | 1% PBS溶液，用于眼表染色、干眼参数测量，方案3.1 |
| 生理盐水 | B. Braun Medical，尔湾，加利福尼亚州 | REF R5200-01 | 术后护理，方案 6.1.3 |
| Schirmer 泪液检测试纸条 | Eaglevision，Katena 产品。新泽西州丹维尔 | AX13613 | 测量泪液分泌量，干眼参数测量，方案 3.1 |
| Vannas 剪刀 | McKesson Medical-Surgical，加利福尼亚州旧金山 | Miltex 2-130 | 用于泪腺切除术的囊膜剪，方案 5.1 &和 5.2 |
| 剪刀，Westcott 肌腱剪 | McKesson Medical-Surgical，加利福尼亚州旧金山 | Miltex 18-1480 | 为去除瞬膜，请参见方案 2.7 |
| 镇静气体面罩 | DRE Veterinary，路易维尔，肯塔基州 | #1381 | 可能的替代镇静方案，方案 4.7 |
| 外科标记笔 | Medical Action Industries，阿登，北达科他州 | 参考文献 115 | 方案 4.2 |
| 缝线，5-0 Mersilene | Ethicon US, LLC | 对苯二甲酸乙二醇酯缝合线，用于深部结缔组织缝合，方案 5.3.11 | |
| 缝线，Vicryl 6-0 | Ethicon US, LLC | 用于浅层肌肉和皮肤缝合的Polyglactin 910缝线，方案5.3.11 | |
| 1 cc 注射器 | BD，美国新泽西州富兰克林湖 | ref 309659 | 用于利多卡因/肾上腺素注射的方案 2.3 &和 2.5 |
| 注射器，5 cc | BD，美国新泽西州富兰克林湖 | REF 309603 | 用于切口部位的浸润；注射器和针头尺寸无严格要求，见方案5.1 |
| 组织镊，0.8 mm Graefe | Roboz Surgical Store，美国马里兰州盖瑟斯堡 | RS-5150 | 弯头韦克钳 |
| 局部抗生素软膏（新霉素、多粘菌素、杆菌肽和氢化可的松） | 博士伦，佛罗里达州坦帕 | NDC 24208-785-55 | 在去除瞬膜（方案2.8）后使用，并用于术后护理（方案6.1.2） |
| 超声耦合剂 | Parker 实验室公司，新泽西州费尔菲尔德 | Aquasonic 100 | 为确保单极电刀板的电接触，步骤4.5 |
| 赛拉嗪 | Henry Schein 动物健康公司，俄亥俄州都柏林 | NADA：139-236 | 1 mg/kg，方案 4.7 |
参考文献
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