用于抗疟疾伯氨喹紫外-可见光及肉眼检测的优化格里斯反应

摘要

本方案描述了一种用于在合成尿液和人血清中检测抗疟药物伯氨喹（PMQ）的新型比色法。

摘要

伯氨喹（Primaquine，PMQ）是一种重要的抗疟药物，已被世界卫生组织（WHO）推荐用于治疗由疟原虫引起的危及生命的感染 P. vivax 和 卵形然而，PMQ 具有导致不良反应的副作用 可导致葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症患者发生急性溶血。因此，亟需开发简单且可靠的伯氨喹（PMQ）检测方法，以实现剂量监测。2019年初，我们报道了一种基于紫外-可见光谱（UV-Vis）和肉眼观察的PMQ比色定量方法。该检测基于PMQ与苯胺类化合物之间的类似格里斯（Griess）反应，生成有色偶氮产物。该方法在合成尿液中直接检测PMQ的检出限可达纳摩尔（nanomolar）级。此外，该方法在临床相关浓度范围内对人血清样本中的PMQ定量已显示出巨大潜力。在本实验方案中，我们将详细描述有色偶氮产物的合成与表征、试剂制备以及PMQ测定的具体操作步骤。

引言

PMQ 是最重要的抗疟药物之一，它 不仅可作为组织裂殖体杀灭剂以防止复发，还可作为配子体杀灭剂以阻断疾病传播^1,2,3,4血管内溶血是伯氨喹（PMQ）令人担忧的副作用之一，在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏的个体中尤为严重。已知G6PD遗传性缺陷在全球范围内分布，在疟疾流行地区的基因频率为3%–30%。PMQ所致溶血的严重程度取决于G6PD缺乏的程度，以及PMQ的剂量和暴露持续时间。^5,6为降低风险，世界卫生组织（WHO）推荐使用单次低剂量（0.25 mg 碱基/kg）的哌喹（PMQ）治疗疟疾。然而，该方案仍面临患者药物敏感性差异的挑战。^5,7剂量监测对于评估PMQ给药后的药代动力学至关重要，有助于在保证疗效的同时通过剂量调整将毒性降至最低。

高效液相色谱法（HPLC）是目前用于PMQ临床检测最广泛使用的技术。Endoh等人报道了一种采用C-18聚合物凝胶柱并配备紫外检测器的....

方案

1. 有色偶氮化合物的合成

1. 在25 mL圆底烧瓶中，将苯胺（0.1 mmol）和伯氨喹二磷酸盐（45.5 mg，0.1 mmol）溶于10 mL H₃PO₄ 溶液（5% v/v）。将圆底烧瓶置于冰浴中，向溶液中加入适当大小的搅拌子，然后将圆底烧瓶放在搅拌器上。
   注意： 用于偶氮化合物的合成 3g (图2)，使用0.2 mmol的磷酸伯氨喹。
2. 将 NaNO 溶解₂ （6.9 mg，0.1 mmol）溶于1 mL冷却的水中，然后逐滴加入反应混合物中。撤去冰浴，继续在室温下搅拌反应混合物。
3. 使用硅胶薄层色谱板（TLC）监测反应进程。以二氯甲烷（DCM）/甲醇（MeOH）混合溶剂（体积比 = 5:1）作为TLC展开剂。偶氮产物在TLC板上呈现有色斑点，肉眼易于分辨。当TLC板上PMQ斑点消失时，停止反应。
4. 调节反应混合物的 pH 值 >在冰浴中用 2 M NaOH 调节至 pH 10。使用 50 mL 分液漏斗，每次用 20 mL 乙酸乙酯萃取混合物，共萃取 3 次，合并有机相，并在减压条件下用旋转蒸发仪浓缩。
   注意： 在提取前，将反应溶液的pH值调节至10以上，以保持伯胺处于非离子化形式，从而促....

结果

为优化反应条件（图2），我们通过Griess反应将多种苯胺类化合物与PMQ进行偶联。成功获得了一系列具有不同颜色的偶氮产物。研究发现，带有给电子取代基的苯胺可在紫外-可见吸收光谱中引起红移。通过时间依赖密度泛函理论（TD-DFT）进行了理论计算。如图2A所示，计算结果与光学测量数据吻合良好，平均误差为3.1%。由于4-甲氧基苯胺在反应速率、产物溶解性和稳定性方面表现良好，因此被用于PMQ检测反应²¹。此外，4-甲氧基苯胺生成的偶氮产物呈红色，肉眼易于分辨。因此，该反应在肉眼可视化的PMQ检测方面具有应用潜力（图3）。

图4A 显示了pH对偶氮产物3d的紫外-可见吸收光谱的影响。 I₅₀₄ 当pH从1.0升高到6.0时，不发生变.......

讨论

我们描述了一种用于便捷定量PMQ的比色法。该方法可能是目前最简单且最具成本效益的方法。更重要的是，此方法无需使用任何仪器，即可通过肉眼进行PMQ测定。

用于检测PMQ的优化Griess反应可生成一种红色偶氮化合物，在504 nm处具有最大吸收峰。内源性生物分子在紫外-可见光区的吸收干扰有限，因此该方法有望直接用于生物流体中PMQ的测定。结果表明，在0–200 μM浓度范围内，尿液中PMQ检测呈现良好的线性关系（R² = 0.998）（图6A）。PMQ的检测限（LOD）为0.63 μM。该方法在人血清中PMQ的直接检测方面也展现出巨大潜力。在10–200 μM浓度范围内，血清中PMQ检测同样表现出优异的线性关系（图6B）。通过提取和浓缩等前处理步骤，可进一步提高方法的灵敏度。如图7所示，采用简单的提取流程，该方法即可实现临床相关浓度范围内血清PMQ的定量检测。根据反应机理，PMQ的主要.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4-甲氧基苯胺	Aladdin	K1709027
2,4-二甲氧基苯胺	Heowns	10154207
3,4-二甲氧基苯胺	Bidepharm	BD21914
4-甲基苯胺	Adamas-beta	P1414526
4-硝基苯胺	Macklin	C10191447
96孔平底板	Labserv	310109008
Gaussian@16 软件	Gaussian, Inc		版本：x86-64 SSE4_2-enabled/Linux
盐酸	GCRF	20180902
Marvin sketch（软件）	CHEMAXON		免费版本：15.6.29
磷酸	Macklin	C10112815
伯氨喹二磷酸盐	3A Chemicals	CEBK200054
亚硝酸钠	Alfa Aesar	5006K18R
磺胺类化合物	TCI(上海)	GCPLO-BP
Varioskan LUX 酶标仪	Thermo Fisher		配备 SkanIt 软件 4.1