免疫组织化学检测法用于检测福尔马林固定组织中的丽沙病毒抗原

摘要

本文介绍一种用于检测狂犬病病毒抗原的免疫组织化学检测方案，可作为福尔马林固定组织的替代诊断方法。

摘要

狂犬病的主要诊断方法之一是在感染组织样本中检测病毒核糖核蛋白（RNP）复合物（抗原）。尽管直接荧光抗体（DFA）试验或直接快速免疫组织化学试验（DRIT）最常用于抗原检测，但这两种方法均需在载玻片上制备新鲜和/或冷冻组织的涂片，然后使用抗体进行抗原检测。如果样本经福尔马林采集并固定，则上述两种方法均不适用于抗原检测；然而，可通过常规免疫组织化学（IHC）方法，在将组织包埋于石蜡块并切片后进行检测。在此IHC方法中，组织切片使用抗狂犬病抗体染色，经脱蜡处理后，通过部分蛋白酶消化或其他方法进行抗原修复，再与一抗和二抗孵育。抗原通过辣根过氧化物酶/氨基乙基咔唑显色，并用苏木精复染，以便在光学显微镜下观察。除特异性抗原检测外，福尔马林固定还具有其他优势，如可评估组织病理学变化、便于标本在常温条件下的储存与运输、能够检测回顾性病例，以及通过灭活病原体提高生物安全性。

引言

狂犬病是由属于丽沙病毒属（lyssavirus）的负链RNA病毒引起的一种急性进行性脑炎¹。该属的代表种——狂犬病病毒（RABV）感染所致的人类死亡病例中，近99%由犬类传播²。对疑似动物进行狂犬病诊断主要依赖于在脑组织中检测病毒抗原（主要是病毒编码的核蛋白，即N蛋白）与基因组RNA形成的复合物（核糖核蛋白复合物，RNP）³。直接荧光抗体（DFA）试验检测抗原被视为狂犬病诊断的金标准⁴。该方法使用新鲜或新鲜冷冻的脑组织样本，在载玻片上制备涂片触印，经丙酮固定后，使用商品化的荧光素异硫氰酸盐（FITC）标记的单克隆或多克隆抗体（mAbs/pAbs）进行染色，并通过荧光显微镜观察结果⁵。DFA试验在新鲜脑组织中检测狂犬病抗原具有快速、敏感和特异的优点。最近研究表明，一种改良的免疫组织化学技术——直接快速免疫组织化学试验（DRIT），其敏感性与DFA相当，但具备可使用光学显微镜观察的优势⁶。尽管DRIT的检测原理与免疫组织化学（IHC）相似，但其初始步骤采用新鲜或冷冻组织制备样本触印涂片，随后以福尔马林固定。

免疫组织化学（IHC）是一种广泛应用的技术，用于通过特异性抗体检测福尔马林固定、石蜡包埋组织中的组织学变化和蛋白质表达。IHC 已成为检测组织切片中狂犬病病毒抗原的一种成熟替代方法⁷。该技术尤其被用于回顾性病例的诊断，以评估神经系统疾病病例中狂犬病的负担情况⁸。福尔马林固定并石蜡包埋的组织在室温下保存多年后仍可保留可用于检测的蛋白质⁹。福尔马林处理会通过交联作用及改变氨基酸侧链来修饰蛋白质，可能导致抗原表位不再与抗体发生反应¹⁰。尽管用于检测狂犬病抗原的 IHC 方法可使用单克隆抗体（mAbs）或多克隆抗体（pAbs），但后者具有优势，因其可识别多个表位，并能检测不同类型的丽沙病毒¹¹。

免疫组织化学（IHC）的标准步骤包括组织的福尔马林固定、石蜡包埋、切片、脱蜡与水化、抗原修复、与一抗和二抗的反应性结合，以及使用显色底物进行显色。本文详细描述了用于狂犬病诊断的实验方案。在狂犬病抗原检测中，采用美国佐治亚州亚特兰大疾病控制与预防中心（CDC）制备的经狂犬病毒（RABV）免疫的小鼠血清（多克隆抗体，pAbs），并联合使用生物素标记的抗小鼠二抗。通过添加链霉亲和素-辣根过氧化物酶（HRP）复合物来检测生物素标记的抗体，随后以氨基乙基咔唑底物进行显色反应。

方案

尽管IHC实验步骤是在福尔马林固定的组织上进行的（可灭活可能存在的狂犬病病毒），但仍应严格遵守适当的生物安全规程。所有生物安全操作均在《微生物和生物医学实验室生物安全》（BMBL）第5版中有详细说明（https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm），包括穿戴适当的个人防护装备（PPE）以及疫苗接种要求¹²。此外，还应遵循危险化学品（如福尔马林、AEC和二甲苯）的正确 containment 和操作规范（例如使用通风橱）。

1. 组织的福尔马林固定

1. 将死后检查采集的 3-5 mm 脑组织¹³放入 10% 磷酸盐缓冲甲醛溶液中（组织与甲醛体积比为 1:20 至 1:50），固定 24-72 小时。
   注意：甲醛为有毒固定剂。
2. 记录组织的大致重量（尺寸）、组织类型（脑区）以及甲醛体积。实验室记录并保存固定时间信息至关重要。
3. 若需在甲醛固定后、处理前进行较长时间的组织保存，应将组织置于 70% 乙醇中。

2. 组织处理

1. 标本固定后，解剖组织以包含重要的脑区，例如脑干的横切面、小脑（3个叶）或海马体（双侧海马），每块组织切取厚度为3至5 mm，并放入组织处理盒中。
2. 将组织处理盒中的样本进行石蜡浸蜡处理，包埋于石蜡块中，并在切片机上切片（厚度为3至6 µm）。

3. 材料准备 / 染色皿

1. 按照图1所示设置染色皿¹⁴（材料表），每个皿中加入250 mL溶液。
2. 3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）底物储备液的配制
   1. 使用玻璃移液管将一片20 mg的3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）溶解于5 mL N,N-二甲基甲酰胺中。
      注意：AEC为致癌物。
3. 用于抗原修复的蛋白酶（例如Pronase）储备液的配制
   1. 将7 mg蛋白酶溶解于200 mL PBS中。
4. 洗涤缓冲液PBS-T的配制
   1. 将10 mL Tween 80加入990 mL PBS中，充分混匀，形成均一溶液。

4. 脱蜡和组织复水

1. 使用切片机制作5 µm厚的石蜡切片，将切片漂浮于38 ˚C的水浴中，然后转移至载玻片上。使用耐试剂的笔或标记笔标记载玻片。
2. 将载玻片置于托盘中，在55–60 ˚C的烘箱中加热1小时以融化石蜡。温度不得超过60 ˚C，以免破坏病毒抗原。
3. 从烘箱中取出载玻片，立即在三个连续的二甲苯溶液（分别置于1、2、3号容器中）中进行脱蜡，每次5分钟。
4. 通过依次浸入浓度递减的乙醇溶液至去离子水中，对载玻片上的组织切片进行水化：（4至11号容器均为浸洗）4号容器：二甲苯/100%乙醇（1:1）；5号容器：100%乙醇；6号容器：100%乙醇；7号容器：95%乙醇；8号容器：95%乙醇；9号容器：80%乙醇；10号容器：70%乙醇；11号容器：去离子水（图1．容器设置）。
   注意：二甲苯为危险化学品，操作应在通风橱中进行。

5. 蛋白酶消化抗原修复

1. 在12号皿中用蛋白酶（PBS配制，浓度为2.5 µg/mL）处理载玻片，进行蛋白酶消化抗原修复，孵育30分钟。
2. 然后在13号皿中用PBS-T漂洗10分钟。
3. 在14号皿中用3%过氧化氢处理10分钟。
4. 再次在15号皿中用PBS-T洗涤10分钟。

6. 染色步骤

1. 每次只取出一张载玻片，其余载玻片保持浸没在缓冲液中（不要取出整个载玻片架——保持载玻片湿润）。取出一张载玻片后，用纸巾轻轻吸去组织切片周围多余的缓冲液，注意不要扰动组织切片。将载玻片置于湿度孵育盒中（可在实验台面上放置湿润的纸巾制成）¹⁴，于室温下用正常山羊血清（封闭液）孵育15分钟。
2. 加入预先确定最佳稀释比例的一抗抗狂犬病病毒抗体（小鼠抗狂犬病血清，1:250稀释，未发表数据）（阳性对照）以及阴性对照抗体，于室温下孵育60分钟（操作方式同上一步6.1），期间不进行洗涤。
3. 60分钟后，用PBS-T洗涤10分钟（第16号染色缸）。
4. 在湿度孵育盒中，加入生物素标记的二抗（种属特异性），于室温孵育15分钟（操作方式同步骤6.1）。
5. 用PBS-T洗涤10分钟（第16号染色缸）。
6. 在湿度孵育盒中，加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶复合物（Streptavidin-HRP），于室温孵育15分钟（操作方式同步骤6.1）。
7. 用PBS-T洗涤10分钟（第16号染色缸）。
8. 在湿度孵育盒中，加入过氧化物酶底物氨基乙基咔唑（AEC），于室温孵育10分钟。AEC工作液需在使用前新鲜配制：将1 mL AEC储备液加入14 mL 0.1 M醋酸盐缓冲液（pH 5.2）中，再加入0.15 mL 3% H₂O₂。使用前用0.45 µm滤膜过滤。
   注意：AEC工作液仅在2–3小时内稳定。AEC储备液可长期存放于冰箱中。
9. 用去离子水洗涤10分钟（第17号染色缸）。
10. 用去离子水按1:2比例稀释的Gill苏木精染液复染2分钟（第18号染色缸）。
11. 用去离子水浸洗方式去除多余的苏木精染液（第19和20号染色缸）。
12. 在Scott自来水（蓝化液）中漂洗30秒（第21号染色缸）。
13. 用去离子水洗涤10分钟（第22号染色缸）。
14. 逐张取出载玻片，用水溶性封片剂封片。
15. 在光学显微镜下观察载玻片。

结果

图2展示了在不同脑组织中检测的阳性与阴性对照样本的代表性免疫组化（IHC）染色结果。图2A,D,G 显示200倍放大下的阳性样本，而 图2B,E,H 分别对应400倍放大。 图2A-C 对应脑干；图2D-F 对应小脑及浦肯野细胞；图2G-I 对应海马体。图2C,F,I 为阴性对照样本。品红色染色显示了在蓝色背景（苏木精复染）下使用AEC底物产生的显色反应，该反...

讨论

由于狂犬病在出现症状后的死亡率极高，对疑似感染狂犬病病毒（RABV）的动物进行及时诊断，对于实施恰当的暴露后预防治疗极为关键。狂犬病的诊断主要依赖于使用新鲜或冷冻组织的直接荧光抗体检测（DFA）、直接快速免疫组化检测（DRIT）以及基于PCR的技术。对于福尔马林固定的组织样本，免疫组织化学（IHC）检测提供了一种灵敏且特异检测RABV抗原的替代方法。尽管福尔马林固定的组织因侧链交联等修饰作用使蛋白质得以稳定，但在进行抗原检测前仍需对样本进行预处理。在本方案中，通过蛋白酶（如蛋白酶K）的部分蛋白水解消化来恢复表位，从而促进一抗与核蛋白复合物（RNP复合物）的结合。在DFA和DRIT检测中主要依赖针对核蛋白（N蛋白）反应的单克隆抗体（mAbs），而在IHC检测中则更倾向于使用可识别N蛋白上多个表位的多克隆抗体（pAbs）。此外，与单克隆抗体相比，多克隆抗体对不同RABV变异株以及非狂犬病丽沙病毒的反应性可能更广。

IHC检测的主要局限之一在于其操作流程包含多个连续步骤，完成整个过程大约需要6小时。如果组织需要经福尔马林固定并包埋于石蜡块中，则在染色前还需额外花费1至2天时间。另一个局限...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3% 过氧化氢	Pharamacy 品牌		市售 3% H2O2
3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）	Millipore Sigma	A6926
乙酸缓冲液 pH 5.2	Poly Scientific R&D Corp.	s140
磷酸盐缓冲福尔马林 10%	赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）	SF100-4	认证级
盖玻片 Corning	赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）	12-553-471	24 × 50 mm
190 证明乙醇	Pharmco-AAPER	111000190
200 证明乙醇	Pharmco-AAPER	111000200
Gill 苏木精染液配方 #2	赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）	CS401-1D
HistoMark 生物素-链霉亲和素过氧化物酶试剂盒	seracare	71-00-18	小鼠一抗
ImmunoHistoMount	Millipore Sigma	i1161	封片介质
N,N-二甲基甲酰胺 GR	赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）	D119
磷酸盐缓冲液	HyClone	RR14440.01	01M，pH 7.2（pH 7.2–7.6）
Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 物镜	多个供应商
Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 物镜	多个供应商
蛋白酶 K（Pronase）	Millipore Sigma	53702	蛋白酶，Streptomyces griseus
Scott 自来水模拟液	Poly Scientific R&D Corp.	s1887
Tissue-Tek 载玻片染色套装	赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）	50-294-72
TWEEN-80	Millipore Sigma	P1754
二甲苯	赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）	X3S-4	组织学级
蔡司 Axioplan 2 成像显微镜	多个供应商