本文介绍一种用于检测狂犬病病毒抗原的免疫组织化学检测方案，可作为福尔马林固定组织的替代诊断方法。
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本文内容
摘要
摘要
狂犬病的主要诊断方法之一是在感染组织样本中检测病毒核糖核蛋白（RNP）复合物（抗原）。尽管直接荧光抗体（DFA）试验或直接快速免疫组织化学试验（DRIT）最常用于抗原检测，但这两种方法均需在载玻片上制备新鲜和/或冷冻组织的涂片，然后使用抗体进行抗原检测。如果样本经福尔马林采集并固定，则上述两种方法均不适用于抗原检测；然而，可通过常规免疫组织化学（IHC）方法，在将组织包埋于石蜡块并切片后进行检测。在此IHC方法中，组织切片使用抗狂犬病抗体染色，经脱蜡处理后，通过部分蛋白酶消化或其他方法进行抗原修复，再与一抗和二抗孵育。抗原通过辣根过氧化物酶/氨基乙基咔唑显色，并用苏木精复染，以便在光学显微镜下观察。除特异性抗原检测外，福尔马林固定还具有其他优势，如可评估组织病理学变化、便于标本在常温条件下的储存与运输、能够检测回顾性病例，以及通过灭活病原体提高生物安全性。
引言
狂犬病是由属于丽沙病毒属（lyssavirus）的负链RNA病毒引起的一种急性进行性脑炎1。该属的代表种——狂犬病病毒（RABV）感染所致的人类死亡病例中，近99%由犬类传播2。对疑似动物进行狂犬病诊断主要依赖于在脑组织中检测病毒抗原（主要是病毒编码的核蛋白，即N蛋白）与基因组RNA形成的复合物（核糖核蛋白复合物，RNP）3。直接荧光抗体（DFA）试验检测抗原被视为狂犬病诊断的金标准4。该方法使用新鲜或新鲜冷冻的脑组织样本，在载玻片上制备涂片触印，经丙酮固定后，使用商品化的荧光素异硫氰酸盐（FITC）标记的单克隆或多克隆抗体（mAbs/pAbs）进行染色，并通过荧光显微镜观察结果5。DFA试验在新鲜脑组织中检测狂犬病抗原具有快速、敏感和特异的优点。最近研究表明，一种改良的免疫组织化学技术——直接快速免疫组织化学试验（DRIT），其敏感性与DFA相当，但具备可使用光学显微镜观察的优势6。尽管DRIT的检测原理与免疫组织化学（IHC）相似，但其初始步骤采用新鲜或冷冻组织制备样本触印涂片，随后以福尔马林固定。
免疫组织化学（IHC）是一种广泛应用的技术，用于通过特异性抗体检测福尔马林固定、石蜡包埋组....
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方案
尽管IHC实验步骤是在福尔马林固定的组织上进行的（可灭活可能存在的狂犬病病毒），但仍应严格遵守适当的生物安全规程。所有生物安全操作均在《微生物和生物医学实验室生物安全》（BMBL）第5版中有详细说明（https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm），包括穿戴适当的个人防护装备（PPE）以及疫苗接种要求12。此外，还应遵循危险化学品（如福尔马林、AEC和二甲苯）的正确 containment 和操作规范（例如使用通风橱）。
1. 组织的福尔马林固定
- 将死后检查采集的 3-5 mm 脑组织13放入 10% 磷酸盐缓冲甲醛溶液中（组织与甲醛体积比为 1:20 至 1:50），固定 24-72 小时。
注意：甲醛为有毒固定剂。 - 记录组织的大致重量（尺寸）、组织类型（脑区）以及甲醛体积。实验室记录并保存固定时间信息至关重要。
- 若需在甲醛固定后、处理前进行较长时间的组织保存，应将组织置于 70% 乙醇中。
2. 组织处理
- 标本固定后，解剖组织以包含重要的脑区，例如脑干的横切面、小脑（3个叶）或海马体（双侧海马），每块组织切取厚度为3至5 mm，并放入组织处....
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结果
图2展示了在不同脑组织中检测的阳性和阴性对照样本的代表性免疫组化（IHC）染色结果。图2A,D,G为200倍放大下的阳性样本，而图2B,E,H分别为400倍放大下的图像。图2A-C对应脑干组织；图2D-F对应小脑及浦肯野细胞；图2G-I对应海马组织。图2C,F,I为阴性对照样本。品红色染色显示了在蓝色背景（苏木精复染）下使用AEC底物显色的结果，该显色源于抗狂.......
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讨论
由于狂犬病在出现症状后的死亡率极高，对疑似感染狂犬病病毒（RABV）的动物进行及时诊断，对于实施恰当的暴露后预防治疗极为关键。狂犬病的诊断主要依赖于使用新鲜或冷冻组织的直接荧光抗体检测（DFA）、直接快速免疫组化检测（DRIT）以及基于PCR的技术。对于福尔马林固定的组织样本，免疫组织化学（IHC）检测提供了一种灵敏且特异检测RABV抗原的替代方法。尽管福尔马林固定的组织因侧链交联等修饰作用使蛋白质得以稳定，但在进行抗原检测前仍需对样本进行预处理。在本方案中，通过蛋白酶（如蛋白酶K）的部分蛋白水解消化来恢复表位，从而促进一抗与核蛋白复合物（RNP复合物）的结合。在DFA和DRIT检测中主要依赖针对核蛋白（N蛋白）反应的单克隆抗体（mAbs），而在IHC检测中则更倾向于使用可识别N蛋白上多个表位的多克隆抗体（pAbs）。此外，与单克隆抗体相比，多克隆抗体对不同RABV变异株以及非狂犬病丽沙病毒的反应性可能更广。
IHC检测的主要局限之一在于其操作流程包含多个连续步骤，完成整个过程大约需要6小时。如果组织需要经福尔马林固定并包埋于石蜡块中，则在染色前还需额外花费1至2天时间。另一个局限.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢各实验室技术人员、流行病学家以及公共卫生部门相关人员向美国疾病控制与预防中心提交的样本。本报告中的发现与结论仅代表作者观点，不一定代表美国疾病控制与预防中心的官方立场。使用商品名称和商业来源仅用于识别目的，并不意味着美国疾病控制与预防中心对此表示认可。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3% 过氧化氢 | Pharamacy 品牌 | 市售 3% H2O2 | |
| 3-氨基-9-乙基咔唑（AEC） | Millipore Sigma | A6926 | |
| 乙酸缓冲液 pH 5.2 | Poly Scientific R&D Corp. | s140 | |
| 磷酸盐缓冲福尔马林 10% | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | SF100-4 | 认证级 |
| 盖玻片 Corning | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | 12-553-471 | 24 × 50 mm |
| 190 证明乙醇 | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| 200 证明乙醇 | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Gill 苏木精染液配方 #2 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | CS401-1D | |
| HistoMark 生物素-链霉亲和素过氧化物酶试剂盒 | seracare | 71-00-18 | 小鼠一抗 |
| ImmunoHistoMount | Millipore Sigma | i1161 | 封片介质 |
| N,N-二甲基甲酰胺 GR | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | D119 | |
| 磷酸盐缓冲液 | HyClone | RR14440.01 | 01M，pH 7.2（pH 7.2–7.6） |
| Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 物镜 | 多个供应商 | ||
| Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 物镜 | 多个供应商 | ||
| 蛋白酶 K（Pronase） | Millipore Sigma | 53702 | 蛋白酶，Streptomyces griseus |
| Scott 自来水模拟液 | Poly Scientific R&D Corp. | s1887 | |
| Tissue-Tek 载玻片染色套装 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | 50-294-72 | |
| TWEEN-80 | Millipore Sigma | P1754 | |
| 二甲苯 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | X3S-4 | 组织学级 |
| 蔡司 Axioplan 2 成像显微镜 | 多个供应商 |
参考文献
- Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies. F1000Research. 6, 184(2017).
- Fooks, A. R., et al. Current status of rabies and prospects for elimination. Lancet. 384<....
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