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方法文章

小鼠乳腺上皮HC11和EpH4细胞的分化

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DOI：

10.3791/60147

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2020年2月27日

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1Department of Biomedical and Molecular Sciences and Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University, Kingston, 2Department of Chemical and Physical Sciences, University of Toronto, Mississauga, 3Department of Laboratory Medicine, Brampton Civic Hospital Campus, William Osler Health System, 4Latner Thoracic Surgery Research Laboratories

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们描述了两种乳腺上皮细胞系HC11和EpH4的分化诱导技术。尽管两种细胞系均需要胎牛血清、胰岛素和催乳素以产生乳蛋白，但EpH4细胞可在三维培养条件下完全分化为乳腺球。这两种互补模型可用于分化及肿瘤发生过程中信号转导研究。

摘要

钙黏蛋白在细胞分化以及肿瘤发生过程中发挥着重要作用。本文介绍了两种小鼠乳腺上皮细胞系HC11和EpH4的来源及其诱导分化的实验方法，并阐述了它们在研究乳腺发育不同阶段及肿瘤转化过程中的互补性应用。

HC11 小鼠乳腺上皮细胞系源自妊娠 Balb/c 小鼠的乳腺组织。当在含有胎牛血清以及Hydrocortisone（氢化可的松）、Insulin（胰岛素）和Prolactin（催乳素）的培养基（HIP 培养基）中，于塑料培养皿表面生长至汇合时，HC11 细胞会发生分化。在此条件下，HC11 细胞可产生乳蛋白 β-酪蛋白和乳清酸性蛋白（WAP），类似于泌乳期的乳腺上皮细胞，并形成称为"穹窿"的初级乳腺腺体样结构。

EpH4 细胞系源自一只孕产 Balb/c 小鼠的乳腺上皮细胞，这些细胞为自发永生化。与 HC11 细胞不同，EpH4 细胞在三维（3D）培养条件下使用 HIP 培养基培养时，能够完全分化为球状体（也称为乳腺球）。细胞经胰蛋白酶消化后，悬浮于由 Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肉瘤细胞分泌的细胞外基质蛋白混合物构成的 20% 基质中，接种至预先包被了浓缩基质的塑料培养皿或多孔板表面，并覆盖含 10% 基质的 HIP 培养基。在此条件下，EpH4 细胞形成中空的球状体，具有顶端-基底极性、中空腔室，并可产生 β-酪蛋白和乳清酸性蛋白（WAP）。

利用这些技术，我们的结果表明，钙黏蛋白/Rac 信号的强度对 HC11 细胞的分化至关重要。Rac1 对于细胞分化是必需的，低水平的活化 RacV12 可促进分化，而高水平的 RacV12 则会抑制分化并诱导肿瘤发生。相比之下，EpH4 细胞代表了乳腺上皮分化更早的阶段，即使低水平的 RacV12 也会抑制其分化。

引言

在正常组织或肿瘤中，细胞在三维结构中具有与邻近细胞广泛黏附的机会，这种特性在体外培养中可通过高密度细胞生长来模拟。细胞间的黏附主要通过钙黏蛋白受体介导，这类受体决定了细胞和组织的结构。有趣的是，最近研究表明，钙黏蛋白在信号转导中也发挥着重要作用，尤其是在存活信号传导中1。矛盾的是，最近发现部分来源于钙黏蛋白的细胞间黏附信号在细胞分化和肿瘤发生过程中均发挥作用2。本文中，我们描述了两种代表性的小鼠乳腺上皮细胞系HC11和EpH4的分化诱导与评估方法。

HC11 小鼠乳腺上皮细胞系可为上皮细胞分化研究提供一个有用的模型。HC11 细胞是一种源自 COMMA-1D 的细胞系，来源于妊娠中期 Balb/c 小鼠的乳腺组织3。与其他 COMMA-1D 衍生克隆不同，HC11 克隆在乳源性激素体外诱导内源性 β-酪蛋白基因表达时，无需外源添加细胞外基质或与其他细胞类型共培养3。该细胞系已被广泛用于分化研究，因其保留了正常乳腺上皮的重要特征：HC11 细胞可在清除脂肪垫的乳腺组织中部分重建导管上皮结构4。此外，在存在类固醇（如Hydrocortisone 或 Dexamethasone）以及Insulin 和Prolactin（HIP 培养基）但不含表皮生长因子（EGF，一种分化抑制剂）的条件下，当细胞在塑料培养皿表面生长至融合时，可在二维（2D）培养中发生分化5,6,7。在此条件下，HC11 细胞可在诱导后 4 天内产生可通过 Western 印迹检测到的乳蛋白，如 β-酪蛋白和 WAP。同时，部分 HC11 细胞会以随机方式形成称为"穹窿（domes）"的原始乳腺腺体样结构。穹窿结构在诱导后 4–5 天可见，并随着 β-酪蛋白产量的增加而逐渐增大，至第 10 天达到最大尺寸8。有趣的是，HC11 细胞携带突变型 p539，因此代表一种癌前状态。正因如此，HC11 模型非常适合在同一细胞系统中联合研究分化与肿瘤发生相关的信号网络。

EpH4 细胞是 IM-2 细胞的衍生细胞系，是一种非致瘤性细胞系，最初来源于从中孕期 Balb/c 小鼠分离的自发永生化小鼠乳腺腺上皮细胞10EpH4 细胞在二维培养中形成连续的上皮单层，但不会分化为腺样结构10,11然而，在由EHS小鼠肉瘤细胞产生的细胞外基质蛋白混合物构成的材料中进行三维培养后12 （EHS基质，基质，或Matrigel，参见 材料表除了用HIP刺激外，EpH4细胞还能重现乳腺分化初期阶段。在这些条件下，EpH4细胞可形成球状体（也称为乳腺球），表现出顶-基底极性并具有中空腔，且能够产生乳蛋白β-酪蛋白和WAP，类似于泌乳期的乳腺上皮细胞。与未分化的HC11细胞不同，后者部分表达间充质标志物13EpH4 细胞呈现纯粹的腔内形态14EpH4细胞在二维培养中经地塞米松、胰岛素和催乳素刺激后，也被报道可产生乳蛋白。15然而，这种方法排除了在三维培养中模拟乳腺微环境的调控作用的研究。

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方案

1. HC11 细胞接种

  1. 在超净工作台中，采用无菌操作技术准备一瓶含有50 mL HC11细胞培养基的容器：RPMI-1640培养基，添加10%胎牛血清（FBS）、5 μg/mL胰岛素和10 ng/mL表皮生长因子（EGF）（参见材料表）。
  2. 每3 cm培养皿接种约400,000个细胞：将两个10 cm、50%融合度的培养皿中的细胞传代至二十个3 cm培养皿中，使用HC11培养基。细胞应均匀分散，但需避免干燥。
    1. 使用真空泵将培养基吸出至锥形瓶中。
    2. 每10 cm培养皿加入250 µL胰蛋白酶（参见材料表）。轻轻晃动并从侧面轻敲培养皿，同时保持其水平，以使胰蛋白酶均匀分布并使贴壁细胞脱落。
    3. 在相差显微镜下使用4倍物镜观察，确认细胞边缘已开始脱落，再进行移液操作。
    4. 用无菌的9英寸巴斯德吸管吸取约1.5 mL HC11培养基，垂直对准细胞喷射。喷射时旋转培养皿，以确保所有细胞均被冲下。操作必须迅速，以避免细胞干燥。
    5. 将全部细胞转移至含有HC11培养基的瓶中，并轻轻摇匀。
    6. 向每个3 cm培养皿中加入2 mL细胞悬液。交叉方向轻轻晃动培养皿，使细胞均匀分布。将培养皿置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养。
  3. 次日或当细胞融合度达到约90–100%时，吸除培养基，更换为含FBS和胰岛素但不含EGF的培养基。

2. HC11 细胞的分化诱导、监测与定量

  1. 在细胞于不含EGF的培养基中培养24小时后，向十个3 cm培养皿中加入分化培养基（HIP培养基）：RPMI-1640，添加10% FBS、1 μg/mL H氢化可的松（见 材料表)，5 μg/mL 我胰岛素和 5 μg/mL P催乳素（参见 材料表长达10天。
  2. 将另外10个3 cm培养皿作为对照：更换为含10% FBS和5 μg/mL胰岛素但不含EGF和HIP的培养基。
  3. 每隔2–3天为HIP处理组细胞和对照组细胞更换培养基。用移液器小心吸取培养基，确保细胞不脱落。
  4. 为了 监测 分化（即形成 "穹顶"），在相差显微镜下观察细胞图1A，左侧面板）。如果细胞表达绿色荧光蛋白（GFP），则在荧光显微镜下观察（激发波长 = 485/20；发射波长 = 530/25；放大倍数 240×；物镜 20×）（图1A，右侧面板）。
  5. 为定量分析分化程度，每天分别从经 HIP 处理的细胞和对照细胞各取一个培养皿，提取蛋白质，持续 10 天，通过 Western 印迹检测 β-酪蛋白（参见 材料表) (图1B).
    1. 在冰上用1.5 mL预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）刮取细胞，收集至1.8 mL塑料离心管中。
    2. 350 × g 离心收集细胞 g，1 分钟，4 °C。
    3. 用预冷的PBS快速洗涤沉淀物2次，弃去残留液体。
    4. 配制裂解缓冲液：50 mM HEPES（pH = 7.4），150 mM NaCl，10 mM EDTA，10 mM Na4P2O7，1% NP-40，100 mM NaF，2 mM Na3视频操作4，0.5 mM 苯基甲基磺酰氟（PMSF），10 μg/mL 抑肽酶（aprotinin），10 μg/mL 亮抑酶肽（leupeptin）16每3 cm培养皿中加入100 µL。
    5. 通过在 10,000 x g 条件下离心澄清裂解液 g 在低温下静置10分钟。
    6. 测定蛋白质浓度（参见 材料表) 并从每个样品中上样10–20 µg蛋白质至10%聚丙烯酰胺-SDS凝胶中。
    7. 45 V 电压下电泳 15 小时，或 100 V 电压下电泳约 2–2.5 小时。
    8. 使用电转印装置将蛋白转移至硝酸纤维素膜或PVDF膜上（参见 材料表).
    9. 用含0.1% Tween-20的Tris缓冲盐水（TBST）配制的5%牛血清白蛋白（BSA）封闭。
    10. 加入一抗，即用1:2,000稀释的山羊抗-β-酪蛋白抗体或1:1,000稀释的小鼠抗-β-actin抗体（参见 材料表).
    11. 用 TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
    12. 加入二抗，即辣根过氧化物酶（HRP）标记的驴抗山羊抗体，按1:2,500稀释，或HRP标记的马抗小鼠抗体，按1:10,000稀释。
    13. 用 TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
    14. 根据制造商说明书将ECL试剂加入膜中（参见 材料表).

3. EpH4 细胞在 EHS 基质中的铺板与三维生长

注意：基质在特定温度下呈液态 <10 °C 以下为液态，高于此温度时呈固态。储存于 -80 °C。使用前一晚在 4 °C 解冻。操作前将细胞培养板和移液器吸头于 -20 °C 预冷，并将基质、培养板和吸头置于冰上，以防其凝固。

  1. 在 RPMI-1640 培养基中培养 EpH4 细胞，添加 10% 胎牛血清（FBS）和 5 µg/mL 胰岛素（无需添加 EGF）。
  2. 在两个 50 mL 圆锥形离心管中分别制备含 10%（v/v，3,500 µL）或 20%（v/v，2,000 µL）基质的 EpH4 生长培养基。使用前置于冰上保存。
  3. 用 150 μL 未稀释的基质对 24 孔板中的 10 个孔（每孔 1 cm2）进行包被。使用移液器吸头将基质均匀铺开，避免产生气泡。水平持握培养板并轻轻敲击其侧壁，以确保基质在孔底均匀分布。
  4. 将 24 孔板置于 37 °C 培养箱中孵育 1 小时，使基质凝固。
  5. 按照 HC11 细胞的方法对 EpH4 细胞进行胰酶消化，并用血细胞计数板计数。将每孔 5 × 104 个细胞转移至 1.5 mL 无菌圆锥形离心管中，在 250 × g 条件下离心 5 分钟。
  6. 小心吸除上清液，并将离心管置于冰上。
  7. 将离心管保持在冰上，使用 1 mL 移液器吸头将细胞重悬于 350 µL 含 20% 基质的 EpH4 生长培养基中，避免产生气泡。确保形成单细胞悬液至关重要。
  8. 当底层基质完全凝固后（基质应呈现半透明状，颜色较初始包被时更浅），向每个包被孔中加入 350 µL 细胞悬液，并置于 37 °C 的 CO2 培养箱中孵育约 1 小时，使含 20% 基质的上层凝固。
    1. 在倒置显微镜下使用 4 倍物镜进行相差观察。应可见单个细胞。
  9. 在含有 20% 基质的 350 µL 细胞悬液上层，加入 200 µL 含 10% 基质的 EpH4 培养基。于 37 °C 继续孵育。

4. 三维培养条件下EpH4细胞的分化诱导（图2）

注意：除了分化之外，EpH4 细胞在三维培养中受到 HGF（肝细胞生长因子）刺激时也可发生管状形成。在 HIP 和 HGF 刺激 10 天后即可观察到管状结构的生长。

  1. 在细胞接种于基质中1天后开始诱导EpH4细胞分化。使用塑料移液枪头小心移除孔中含10%基质的150 µL上清培养基，随后加入含HIP和10%基质的200 µL EpH4培养基。
  2. 每2天更换一次含10%基质-HIP的培养基，持续最多10天。对照组细胞在相同含10%基质但不含HIP的培养基中培养。
  3. 在相差显微镜下观察乳腺球体的形成情况（图3A，下图）。

5. 三维培养中EpH4细胞的管状结构形成诱导（图3A 和 3C）

  1. 按照步骤 3.1–3.9 所述，准备 24 孔板和用于基质中生长的 EpH4 细胞。细胞接种于基质后的第二天，使用塑料移液枪头从孔中移除 150 µL 含 10% 基质的 EpH4 培养基，然后加入 200 µL 含 10% 基质、HIP 和 20 ng/mL HGF 的 EpH4 培养基（见材料表）。
  2. 每 2 天更换一次含 10% 基质/HIP/HGF 的培养基，持续更换最多 12–14 天。
  3. 使用 20x 或 40x 物镜在显微镜下观察管状结构的形成（图 3A，右侧面板）。

6. 分化定量：β-酪蛋白的蛋白质印迹分析

  1. 小心地用移液器吸去孔中的10%基质-HIP培养基。用350 µL冰冷的PBS冲洗20%基质层2次。类球体应仍存在于基质层中。
  2. 直接向孔中加入700–1,000 µL含1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的冰冷PBS。用移液器枪头轻轻剥离100%基质的底层，以回收该层中存在的类球体。在4 °C下轻轻振荡30分钟。
  3. 小心将类球体悬液转移至锥形管中。用约500 µL PBS-EDTA冲洗孔板，以回收孔中残留的任何类球体，并将其加入锥形管中。
  4. 在冰上轻轻摇动额外30分钟。确保基质已完全溶解。若观察到可见的基质团块，可添加更多PBS-EDTA或延长振荡时间。
  5. 将溶液离心，以350 x g离心5分钟，使类球体沉淀。
  6. 吸去上清液，用冰冷裂解缓冲液裂解类球体，并按照上述步骤2.5的方法通过Western blot检测β-酪蛋白、细胞周期蛋白D1和p120RasGAP16。一抗使用山羊抗-β-酪蛋白（1:2,000稀释）、兔抗-细胞周期蛋白D1（1:2,000稀释）和小鼠抗-p120（1:2,000稀释）。二抗使用HRP标记的驴抗山羊抗体（1:2,500稀释）、HRP标记的驴抗兔抗体（1:2,500稀释）和HRP标记的马抗小鼠抗体（1:10,000稀释）。

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结果

长期以来，人们已知上皮细胞和脂肪细胞的分化需要细胞达到汇合状态并激活钙黏蛋白2。我们及其他研究者已证明，细胞间黏附以及E-或N-钙黏蛋白和钙黏蛋白-11的激活（如体外培养细胞汇合时所发生的情况）会显著增强小GTP酶Rac和细胞分裂控制蛋白42（Cdc42）的活性，该过程进而导致白细胞介素-6（IL6）家族细胞因子及Stat3（信号转导和转录激活因子-316,17）的激活1,18,19。由于钙黏蛋白/Rac/IL6/Stat3信号通路中的许多组分可能同时参与细胞分化和肿瘤性转化，因此这些分子为研究这两种截然相反过程之间的关联性提供了重要的分子切入点。

利用上述技术，我们证明了HC11细胞的分化能力显著依赖于Rac信号的强度：内源性cRa...

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讨论

HC11 细胞非常适合用于研究分化与肿瘤性转化的关联。其另一个优势在于，HC11 细胞易于感染基于 Mo-MLV 的逆转录病毒载体，从而表达多种基因。据我们实验经验，EpH4 细胞使用相同逆转录病毒载体的感染难度高于 HC112。

细胞间接触和生长停滞是HC11细胞分化的关键前提条件。因此，为了在细胞层中实现均匀分化，在接种时确保细胞在培养皿中的分布均匀至关重要。如果需要对分化程度进行定量分析，这一点尤为重要。必须优化胰蛋白酶消化条件，以获得单细胞悬液，并避免因操作导致细胞活力下降。

消化细胞时，细胞应处于亚融合状态（50–70%），因为密度过高的细胞会相互紧密黏附，难以分离。为避免细胞干燥，应在将培养皿平放于超净台台面时进行吸液，然后倾斜以快速排净液体，并立即用皿盖盖好培养皿。如有需要，可将培养皿置于37 °C培养箱中，以加快胰酶的消化作用。

由于细胞在诱导后的10天内非常密集，及时更换已耗尽的营养物质非常重要。换液时需小...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

HC11 细胞系由 D. Medina 博士（美国德克萨斯州休斯顿）惠赠。作者感谢加拿大皇后大学的 Andrew Craig 博士提供了多种试剂和宝贵的建议。EpH4 细胞由 C. Roskelley 博士（不列颠哥伦比亚大学，温哥华）惠赠。Colleen Schick 为三维培养研究提供了出色的技术支持。

作者谨此感谢加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）、加拿大卫生研究院（CIHR）、加拿大乳腺癌基金会（CBCF，安大略省分会）、加拿大乳腺癌研究联盟、安大略省卓越中心、金斯顿乳腺癌行动组织（BCAK）以及通过赠款资助LR的克莱尔·尼尔森遗赠基金所提供的财政支持。BE获得了CIHR、CBCF、BCAK和癌症研究协会公司的资助。PTG获得了加拿大研究讲席、加拿大创新基金会、CIHR、NSERC和加拿大癌症协会的支持。MN获得了加拿大国家癌症研究所（NCIC）跨学科癌症研究特里·福克斯培训项目的学生奖学金、研究生奖学金（QGA）以及女王大学院长奖的支持。MG获得了美国陆军乳腺癌项目、安大略省政府研究与创新部以及女王大学咨询研究委员会的博士后奖学金支持。VH获得了加拿大乳腺癌基金会博士奖学金以及特里·福克斯基金会跨学科癌症研究培训项目（与CIHR合作）博士后奖学金的支持。Hanad Adan 获得了NSERC暑期学生奖学金。BS获得了女王大学研究生奖学金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
30% 丙烯酰胺/0.8% 双丙烯酰胺溶液Bio Rad1610154蛋白质印迹
抗细胞周期蛋白 D1 抗体兔源，Santa Cruzsc-717蛋白质印迹
抗 p120 抗体小鼠源，Santa Cruzsc-373751蛋白质印迹
抗-β 肌动蛋白抗体小鼠源，Cell Signalling Technology3700蛋白质印迹
抗-β 酪蛋白抗体山羊源，Santa Cruz Biotechnologysc-17971蛋白质印迹
抑肽酶Bio ShopAPR600裂解缓冲液
双辛可宁酸溶液SigmaB9643-1L-KC蛋白质定量
牛血清白蛋白Bio ShopALB007.500蛋白质定量
Clarity 蛋白质印迹化学发光底物Bio Rad170-5061蛋白质印迹
硫酸铜(II)SigmaC2284-25ML蛋白质定量
DAPIThermofisher ScientificD1306染色
皂苷Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd14952-500染色
EDTABio ShopEDT001.500
表皮生长因子SigmaE9644HC11 细胞培养基
胎牛血清PAAA15-751细胞培养基
山羊抗兔 HRPSanta CruzSC-2004蛋白质印迹
重组肝细胞生长因子GibcoPHG0321
HEPESSigma7365-45-9细胞培养
马抗小鼠 HRPCell Signalling Technology7076蛋白质印迹
氢化可的松SigmaH0888HIP 培养基
胰岛素SigmaI6634HIP 培养基
层流罩BioGard Hood细胞培养
亮抑蛋白酶肽Bio ShopLEU001.10裂解缓冲液
基质（Engelbreth-Holm-Swarm 基质，Matrigel）CorningCACB 354230
小鼠抗山羊 HRPSanta Cruzsc-8360蛋白质印迹
Mowiol 4-88 试剂Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd475904-100GM染色
多光子共聚焦显微镜Leica TCS SP2
Na3VO4Bio ShopSOV850裂解缓冲液
Na4P2O7Sigma125F-0262裂解缓冲液
NaClBio ShopSOD001.1蛋白质印迹
NaFFisher Scientific7681-49-4裂解缓冲液
尼康数码相机Coolpix 995
硝酸纤维素膜Bio Rad1620112蛋白质印迹
NP-40Sigma9016-45-9
多聚甲醛Fisher Scientific30525-89-4染色
相差显微镜Olympus IX70细胞培养
苯甲基磺酰氟Sigma329-98-6裂解缓冲液
pMX GFP Rac G12VAddgene14567
催乳素SigmaL6520HIP 培养基
RPMI-1640SigmaR8758细胞培养基
组织培养皿 35Sarstedt83.3900.细胞培养
24 孔组织培养板Sarstedt83.1836.300细胞培养
转膜装置CBS Scientific CoEBU-302蛋白质印迹
Tris 乙酸盐Bio ShopTRA222.500蛋白质印迹
胰蛋白酶Sigma9002-07-7.细胞培养
Tween-20Bio ShopTWN510.500蛋白质印迹
垂直凝胶电泳系统CBS Scientific CoMGV-202-33蛋白质印迹

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