通过胚胎移植生成具有突变单倍体肢体的嵌合体墨西哥钝口螈

摘要

本实验方案的目标是利用胚胎组织移植技术，产生具有源自Cas9诱变供体组织的单倍体前肢的嵌合体墨西哥钝口螈。

摘要

越来越多的遗传学技术与资源使研究人员能够探究某些蝾螈物种（如墨西哥钝口螈）在成体阶段再生完整肢体能力的分子基础。本文概述了用于构建嵌合型墨西哥钝口螈的技术，其单倍体前肢经 Cas9 诱导突变，可用于探索基因功能及肢体再生的保真度。我们将多种胚胎学与遗传学技术结合，包括体外激活产生单倍体、CRISPR/Cas9 诱变以及组织移植，整合为一套完整的实验流程，从而在再生研究的模式生物中建立一种独特的单倍体遗传筛选系统。该策略减少了肢体再生相关基因功能分析所需的动物数量、空间和时间。同时，该方法还允许研究那些可能在器官发生、组织形态发生及其他重要胚胎过程等必需生物学功能中发挥作用的基因在再生过程中的特异性功能。本文所述方法为在脊椎动物模式系统中开展单倍体遗传筛选提供了一个独特的平台。

引言

历史上，两栖动物胚胎组织移植技术对于探索发育生物学和再生的基本机制具有重要意义。墨西哥钝口螈（axolotl）是一种蝾螈物种，具有在损伤或截肢后再生组织以及肢体和器官等复杂结构的惊人能力。同样令人印象深刻的是，它们在胚胎期、幼体期乃至成体阶段均可接受来自其他个体的组织移植，且不会发生排斥反应^1,2,3。在胚胎中，能够发育为完整结构（如肢体、尾部、眼睛和头部）以及更特化的组织（如神经外胚层和体节）的区域，可在不同胚胎之间进行移植，从而产生嵌合体动物^1,2,4,5,6。近一个世纪以来，对这类嵌合体动物的研究为再生机制、组织分化、大小调控以及模式形成等关键问题提供了至关重要的见解^1,7,8。

在过去十年中，大量关于再生组织的转录组学研究揭示了蝾螈再生过程中潜在的遗传程序^{9,10,11,12,13}。这些研究不断扩充着候选基因列表，而迄今为止，这些基因在再生背景下的功能在很大程度上仍未被阐明。如今，CRISPR/Cas等靶向突变技术使得对这些基因的研究成为可能，而近年来完成测序与组装的大型墨西哥钝口螈基因组，极大促进了此类遗传学研究的开展^14,15,16。

我们致力于开发将经典发育生物学与新兴遗传技术相结合的方法，以解析再生的机制。多年来，人们已建立了产生蝾螈及其他有尾类动物单倍体胚胎的技术¹⁷。尽管这些技术长期以来被认为使蝾螈成为理想的遗传学模式生物¹⁸，但后续的遗传学研究中极少利用单倍体个体。我们在墨西哥钝口螈中采用体外激活方法产生单倍体胚胎，并将其作为组织移植的供体¹⁹。利用携带荧光遗传标记的胚胎，我们建立了可靠的方法，能够获得几乎完全来源于供体组织的肢体（图1A）。通过结合这两种技术，我们克服了单倍体胚胎后期致死的问题，成功获得了完全发育的、经移植的单倍体肢体（图1B、图1B' 和 图2）。

通过在移植前对单倍体胚胎进行CRISPR/Cas介导的诱变，从而构建具有突变单倍体肢体的嵌合型墨西哥钝口螈，我们可以在肢体发育与再生的特定背景下研究基因功能。这种方法能够挽救可能因胚胎致死性突变表型而无法存活的肢体。尽管CRISPR/Cas显微注射可产生高度突变的个体，但这些个体通常具有高度嵌合性，仍不同程度地保留野生型等位基因，并在靶向位点出现多种不同的突变^14,20。在单倍体细胞中进行基于CRISPR的诱变可提高单等位基因功能缺失突变的外显率，因为不存在野生型等位基因的掩盖效应。正因如此，基于CRISPR的单倍体细胞系筛选正被 increasingly 广泛用于研究多种细胞过程的遗传基础^21,22,23。将基于CRISPR的谱系示踪技术与我们的单倍体肢芽移植方案相结合，本文所述方法可作为在活体动物中开展单倍体遗传筛选的平台²⁰。

方案

本方案中使用的实验程序已获得耶鲁大学机构动物护理和使用委员会（IACUC，2017–10557）的批准，并符合所有关于脊椎动物使用方面的联邦政策和指南。所有动物实验均在耶鲁大学的设施内对Ambystoma mexicanum（墨西哥钝口螈，axolotl）进行。

1. 二倍体胚胎的制备

1. 通过自然交配使用一个或两个gfp亲本获得GFP+二倍体胚胎，作为移植宿主²⁴。
2. 收集 freshly laid 的二倍体卵，并将其放入金属筛中。
3. 用40% Holtfreter溶液（20 mM NaCl、0.2 mM KCl、0.8 mM NaHCO₃、0.2 mM CaCl₂、4 mM MgSO₄，调pH至7.4）彻底冲洗卵。
4. 将卵置于新鲜的40% Holtfreter溶液中，并在12 °C下保存。
   注意：应在进行单倍体胚胎制备之前始终先获得二倍体胚胎。

2. 单倍体胚胎的生成

1. 雌性配子供体准备
   1. 在进行体外激活前48小时，将一条性成熟的白色或白/红色荧光蛋白（RFP）雌性墨西哥钝口螈浸入含1 g/L HEPES缓冲的MS-222的40% Holtfreter溶液中进行麻醉²⁵。
   2. 浸没约30分钟后，用拇指和食指用力夹捏其尾部以确认动物是否完全麻醉。完全麻醉的个体对任何夹捏均无反应。
   3. 配制人绒毛膜促性腺激素（HCG）溶液，浓度为10,000 U/mL，溶于无菌生理盐水中。
   4. 使用30 G胰岛素注射器，将0.15 mL HCG（1,500单位）以与中线呈45°角的方向注射至麻醉后雌性个体后肢背侧肌肉中，以避免接触脊髓。
   5. 将雌性个体转移至新鲜的40% Holtfreter溶液中，并置于8−12 °C冰箱内。
   6. 48小时后，将雌性个体恢复至室温环境。在其容器中放置若干石块或塑料植物，作为产卵基质。
      注意：注射HCG后的雌性个体在正式产卵前常会持续数小时排出空胶状卵囊。
   7. 当雌性个体开始稳定地产卵后，移除石块或塑料植物。
   8. 让雌性个体在空缸中静置30分钟至1小时。
      注意：不提供可供产卵的材料有助于更精确地控制卵母细胞的收集。
2. 雄性配子采集
   1. 在雌性个体产卵暂停期间，将一条性成熟的绿色荧光蛋白阳性（GFP+）雄性墨西哥钝口螈按步骤2.1.1的方法麻醉，作为精子供体。
   2. 将完全麻醉的雄性个体仰卧放置于湿润的纸巾上，并置于解剖显微镜下。
   3. 若操作者为右利手，用右手持P1000移液器，将其尖端置于泄殖腔基部。
   4. 用左手的食指和拇指置于骨盆前方2−3 cm处，轻轻挤压动物身体，并将手指向后肢方向移动，以冲出含精子的尿液样本。
   5. 将每次从泄殖腔排出的液体收集至独立的微量离心管中。重复该过程以收集6至10份样本。
   6. 从每份样本中吸取5.0 µL滴加至培养皿中，使用倒置显微镜检查精子质量。
      注意：浓缩的精子样本呈乳白色，体积通常为5至20 µL，通常在多次提取出较大体积的含精子尿液后获得。静置后，精子会在较大体积样本的管底聚集。健康的高浓度精子活力强，随着浓度降低其活性逐渐减弱。健康雄性个体可产生多达50 µL的浓缩精子。
3. 雌性配子采集
   1. 在获得并确认精子样本质量良好后，按步骤2.1.1的方法麻醉已注射HCG的雌性墨西哥钝口螈。
   2. 将完全麻醉的雌性个体仰卧放置于湿润的纸巾上。
   3. 采用与步骤2.2.4类似的手法动作，从雌性个体中挤出未受精卵。
   4. 使用湿润的镊子收集卵子，并转移至直径10 cm的培养皿中。采集后15分钟内使用经辐照处理的精子对卵子进行处理。
4. 雄性配子处理与体外激活
   1. 使用P10或P20移液器反复吹打精子，打散团块，形成均匀的悬浮液。
   2. 取0.5 µL未稀释的精子悬浮液滴于培养皿盖或载玻片上，用倒置显微镜观察，估算活动精子所占百分比。
   3. 向该样本中加入9.5 µL的0.1x Marc's改良林格液（MMR；材料表），制成20倍稀释的精子溶液。轻柔吹打混匀。
   4. 使用倒置显微镜，在培养皿盖或血细胞计数板上对三个1.0 µL的20倍稀释样品进行计数，以估算原始未稀释悬浮液的精子浓度。
   5. 将原始精子样本的一部分用无菌0.1x MMR稀释至约80,000个活动精子/mL，用于后续辐照处理。
   6. 统计过去15分钟内获得的卵子数量。按每枚卵加入0.5 µL步骤2.4.5中新鲜稀释的精子的比例，将精子加入培养皿中。用移液器枪头将悬浮液铺展成约1 mm厚的薄层。
   7. 使用塑料支架将样品置于254 nm交联仪灯管下方4 cm处，以800,000 uJ/mm²剂量辐照，使精子基因组失活。
   8. 使用P10移液器将辐照后的精子悬浮液滴加至未受精卵上，使每枚卵表面覆盖0.25−0.5 µL辐照精子。让卵子在室温下静置30分钟。
   9. 30分钟后，用0.1x MMR淹没卵子。立即将其置于8−10 °C培养箱中，供次日注射；或置于18 °C培养箱中，供激活后7小时内（hpa）注射。
   10. 在水化后30分钟，使用尖头镊子去除单倍体卵的胶膜。立即将其置于8−10 °C培养箱中，供次日注射；或置于18 °C培养箱中，供当天注射。

3. 单倍体诱变与维持

1. CRISPR/Cas9 显微注射
   1. 使用 CRISPRscan 设计 sgRNA 并进行合成^26,27。
   2. 对于多重诱变，配制含有 5 种 sgRNA（每种 sgRNA 10 ng/µL）和 Cas9 蛋白（1 µg/µL）的储备液。将该储备液稀释 100 倍（每种 sgRNA 0.1 ng/µL，Cas9 10 ng/µL）用于注射。对于单基因高突变频率诱变，请遵循先前所述方案²⁸。
   3. 若胚胎储存在 18 °C，则在单细胞阶段（受精后 7 小时）进行注射；若储存在 8−10 °C，则于次日在 2−8 细胞阶段注射。
   4. 将胚胎转移至含 20% 多聚蔗糖 400 的 1.0x MMR 溶液中。
   5. 若为单细胞胚胎，向每个胚胎注射 5 nL 注射液（约等于卵子半径的 ¼），其中包含每种 sgRNA 0.5 pg 和 Cas9 蛋白 50 pg 的总质量。若为多细胞胚胎，则通过向多个细胞注射较小体积的方式分配该总量。
   6. 将胚胎在含多聚蔗糖 400 的环境中于 18 °C 下恢复，时间不少于 4 小时，不超过 18 小时。
2. 单倍体胚胎培养
   1. 将胚胎转移至含抗生素-抗真菌剂的 0.1x MMR 溶液中。
   2. 将每个胚胎单独培养于 24 孔板的独立孔中，因为部分胚胎可能死亡或发育异常。培养温度维持在 16−18 °C。必要时可采用较低温度以延缓发育进程。
   3. 每隔一天更换一次培养基，使用新鲜的含抗生素-抗真菌剂的 0.1x MMR 溶液。

4. 二倍体宿主胚胎制备

1. 将胚胎保留在胶状包膜中，于 12 至 16 °C 条件下培养，直至发育至 22 至 26 期。
2. 收集适合移植的胚胎，放入筛网（4 mm 孔径）中，并用 40% Holtfreter 溶液轻轻冲洗。
3. 将胚胎转移至含 1.5% 次氯酸钠的滤膜除菌 0.1x MMR 溶液中，处理时间不超过 2 分钟。确保胚胎完全浸没在次氯酸钠溶液中，并轻轻摇动，使胶状包膜充分接触溶液，以杀灭胚胎表面存在的微生物。
4. 2 分钟后，向含有胚胎的次氯酸钠溶液中加入等体积的滤膜除菌 0.1x MMR 溶液进行稀释。
5. 将胚胎轻柔地倒入经次氯酸钠消毒的筛网（4 mm 孔径）中，并用滤膜除菌的 0.1x MMR 溶液冲洗 5 次。
6. 将胚胎放入含有抗生素的无菌 10 cm 培养皿中，加入 0.1x MMR 进行去胶处理（青霉素 100 单位/mL，链霉素 100 µg/µL，0.25 µg/mL，庆大霉素 25 µg/mL）。
7. 在荧光体视显微镜下，使用尖头镊子（尖端尺寸 0.05 x 0.01 mm²）去除 GFP+ 胚胎的胶状包膜和卵黄膜。
8. 将 GFP+ 胚胎转移至新的培养皿中，尽量减少从去胶操作的培养皿中带出的液体量。
9. 用含抗生素的无菌 0.1x MMR 溶液对 GFP+ 宿主胚胎冲洗 4 至 6 次，以去除污染物。
10. 将清洁后的胚胎置于 4 °C 过夜，以备移植。
    注意：低温处理可使胚胎变得更坚硬，便于中胚层与内胚层的清晰分离。

5. 单倍体-二倍体嵌合体的生成

1. 手术皿和培养基的制备
   1. 将经高压灭菌的2%琼脂糖倒入无菌的35 mm易握培养皿中，制备无菌手术操作皿，琼脂糖中含0.1x MMR培养基。琼脂糖填充至培养皿一半高度。
   2. 待琼脂糖冷却后，使用无菌手术刀在琼脂糖中切出一条长约25 mm、倾斜的槽道，用于固定胚胎。
   3. 向培养皿中加入无菌手术培养基（含抗支原体2.5 µg/mL、两性霉素B 0.25 µg/mL和环丙沙星10.0 µg/mL的0.1x MMR），并在4 °C下冷藏保存。
2. 胚胎移植操作
   1. 将一个健康的单倍体供体与一个或两个发育阶段匹配的GFP+二倍体宿主胚胎放入预冷的、含有手术培养基的操作槽中（图3）。
      注意：如有可能，应在冷却台上（10 °C或更低温度）进行操作。
   2. 使用两把超细、经高压灭菌的镊子（直头，尖端尺寸为0.05 × 0.02 mm²），去除宿主中靠近中央的肢芽区域的外胚层和中胚层组织（图4）。
      注意：矩形组织移植区域包括肢芽，沿前后轴从第九体节延伸至鳃隆起的后半部分，约2 mm；沿背腹轴，移植区域跨度约为1.5 mm，包括体节至鳃隆起腹侧边缘以外的部分。移植区域包含所有侧板中胚层及体节的外侧半部，但不扰动下方的内胚层。详见图4及配套视频。
   3. 将宿主组织暂置一旁，使用相同方法从单倍体供体中取出大小相当的组织片。
   4. 将单倍体供体的组织片移植至宿主胚胎的对应区域。
   5. 用一块经高压灭菌的矩形玻璃碎片（由破碎的显微镜盖玻片制成）覆盖移植组织，并轻轻按压使其固定于宿主胚胎体内。
   6. 将单倍体供体胚胎翻转至另一侧，以获取用于第二个宿主胚胎的肢芽组织。重复步骤5.2.2至5.2.5。
   7. 小心地将剩余的多余宿主组织和供体胚胎从培养皿中移除。
   8. 将移植组织连同玻璃碎片锚定物一起保留60−75分钟，每隔20分钟检查一次，确保玻璃碎片未滑脱。
   9. 待组织移植完全黏附后，使用镊子缓慢剥离玻璃碎片锚定物。
3. 嵌合体的维持
   1. 将移植后的胚胎转移至新鲜的手术培养基中，并在8−12 °C下过夜培养以促进愈合。将移植胚胎分别置于12孔或24孔板中单独培养。
   2. 36−48小时后，将移植胚胎转移至无菌的含抗生素-抗真菌剂的0.1x MMR培养基中。手术培养基中的强效抗生素在3天后会对移植胚胎产生毒性。
   3. 每2−3天更换一次新鲜的0.1x MMR培养基及抗生素。
   4. 将移植胚胎在18 °C下继续培养，直至其能够自主摄食²⁸。
   5. 经过1至2个月的发育与护理后，可使用荧光解剖显微镜评估单倍体肢芽移植的纯度。
      注意：若肢芽中出现非神经或非血液来源的宿主GFP+组织，表明移植不纯，通常与肢体发育异常相关。此类个体应排除在后续分析之外。

结果

单倍体胚胎可通过其“单倍体综合征”表型与二倍体胚胎相区分²⁹。在嫁接期，单倍体胚胎在前后轴上表现出弯曲程度降低，且卵黄栓封闭不完全（图3A）。可利用荧光显微镜确认单倍体胚胎中无父源性GFP表达（图3B）。

当移植物洁净时，GFP 表达应主要局限于臂丛神经，即源自宿主脊髓的神经网络，如图2所示。在单个细胞中也可观察到点状的 GFP 表达，这些细胞似乎是感觉神经元以及迁移到发育中肢体的血液来源的宿主细胞。当使用 RFP+ 供体时，单倍体移植物肢体将普遍表达 RFP（图1B'...

讨论

在我们的单倍体-二倍体嵌合体制备方案中，有几个关键步骤需要操作技术人员加以考虑，以获得稳定一致的嫁接结果。

单倍体产生的最可能失败原因是体外激活条件不佳。必须使用适量的活动精子来激活卵子。为延长精子活动力，精子样品应始终保存在 4 °C。在将任何精子样品施加于卵子之前，应使用倒置显微镜检查精子的活力。完全无活动力的精子绝不可使用，精子浓度应调整至 80,000 个活动细胞/mL。在激活步骤中使用过多精子也可能阻碍卵子的正常发育。精子坑（sperm pits）是卵子表面出现的小而深色的凹陷，是精子已穿透卵子的物理标志，通常在施加精子后 20 至 60 分钟内出现。含有十个或更多精子坑的卵子可能无法正常激活。

如果在水中产卵后15分钟内收集未受精卵，将其置于干燥的培养皿中，并在加精前用纸巾彻底吸干，即可激活卵子。或者，如视频所示，也可从经激素注射的雌鱼体内挤出卵子。我们发现，这种"干燥"处理的卵子结果更为稳定，尽管我们通常会同时使用这两种方法。

成功的移植需要...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
#55 达蒙特镊子	精细科学工具公司	11295-1	仅使用杜莫斯塔材料（可高压灭菌）
两性霉素B	西格玛-奥德里奇	A2942-20ML	20 mL
抗生素-抗真菌素 100倍浓缩液	赛默飞世尔	15240062
环丙沙星	西格玛-奥德里奇	17850-5G-F
Ficoll 400（聚蔗糖400）	bioworld	40600032-3	Ficoll 400
庆大霉素	西格玛-奥德里奇	G1914-250MG
加热/冷却培养箱	RevSci	RS-IF-233
人绒毛膜促性腺激素	默克		Chorulon
Megascript T7 转录试剂盒	赛默飞世尔	AM1334	40次反应
显微镜冷却台	Brook Industries	Custom	Custom
NLS Cas9 蛋白	PNAbio	CP01-200	4小瓶，每瓶含50 µg蛋白
Plasmocin	Invivogen	ant-mpt-1	治疗浓度
配方
1.0x 马克氏改良林格液（MMR）			0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8)，调pH至7.4
40% Holtfreter溶液			20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4，调pH至7.4