本文介绍了一种利用海藻酸盐作为聚合物对永生化细胞进行微囊化，以实现向啮齿类动物眼部长期递送生物制剂的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
目前许多针对眼后极部疾病的在研治疗药物均为生物制剂。这类药物通常需要频繁给药，典型方式为玻璃体内注射。包封细胞可表达特定的生物制剂，正逐渐成为局部蛋白质生成与释放的工具（例如用于长期药物递送）。此外，包封系统采用可渗透材料，允许营养物质、代谢废物及治疗因子在细胞内外扩散，同时使细胞免受宿主免疫系统的识别，从而避免需要抑制宿主免疫系统。本方案描述了以海藻酸盐作为聚合物，结合电喷雾法进行微囊化包封的技术。ARPE-19细胞是一种自发形成的人视网膜色素上皮细胞系，因其长期功能性已被用于长期细胞治疗实验，本文中用于细胞包封及向小鼠眼部递送微囊。该文总结了细胞微囊化、质量控制及眼部递送的操作步骤。
引言
基于细胞的疗法是一类革命性的生物技术，已在医学领域得到广泛应用。近年来，这类疗法已成功应用于神经退行性疾病、眼部疾病和癌症的治疗。细胞疗法涵盖从细胞替代到药物递送的广泛领域，而本实验方案重点关注后者。可生物降解的海藻酸盐微胶囊（MC）已被证明是一种有效的递送系统，并在生物医学领域得到日益广泛的应用。由于海藻酸盐具有简单的凝胶化过程、可生物降解性、优异的生物相容性以及在体内条件下的稳定性，因此被广泛用于微胶囊化技术1,2,3,4。
作为一种微胶囊化技术，电喷雾法已成功用于包封多肽和蛋白质，所用材料包括海藻酸盐（基础聚合物）和聚-L-鸟氨酸（次级包被聚合物）。这两种聚合物均为天然存在，因其良好的生物相容性而被广泛应用5,6,7。然而，细胞治疗中的主要挑战在于如何抑制宿主免疫系统，以避免免疫抑制药物引起的副作用。海藻酸盐微胶囊的通透性被认为是细胞封装的理想特性，它允许营养物质、代谢废物和治疗因子在细胞内外扩散，同时使细胞免受宿主免疫反应的攻击<....
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方案
所有实验均遵循眼科与视觉研究中动物使用声明（ARVO声明），并经南卡罗来纳医科大学动物护理与使用委员会在方案编号00399下批准。
1. 细胞培养
- 根据已发表的方案14,15，构建稳定表达目标基因的人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）细胞系。
- 将细胞培养于添加了10%胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中。
- 在37 °C、5% CO2条件下孵育细胞。
- 每2–3天更换一次培养基。
- 当细胞融合度达到70%–80%时，采用标准的组织培养操作进行传代。
2. 细胞包封
- 将海藻酸钠与去离子水（DI 水）混合，配制成终浓度为 2% w/v 的溶液，并使用 0.2 µm 无菌注射器滤器过滤纯化。
- 通过胰酶消化、离心并用 10 mM HEPES 缓冲盐水溶液（pH = 7.4）洗涤，制备待与海藻酸钠溶液混合的细胞。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将细胞终浓度调整为 1 × 106 个/mL 海藻酸钠溶液。
注意：包封过程应在无菌操作台内进行。
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结果
ARPE-19 细胞是一种自发永生化的人视网膜色素上皮细胞系，已被证明适用于包封，并在将微囊植入眼内后能够长期存活。图1展示了海藻酸盐包封所用的工具。本研究中，通过明场成像证实了海藻酸盐微囊内的细胞存在（图2A）。对微囊内细胞进行活/死细胞染色检测，结果显示包封后细胞存活率达90%（图2B）。为确保微囊内细胞的长期存活能力，将微囊溶解于柠檬酸钠溶液中，随后将细胞重新接种（图2C）。在独立实验中确认稳定转染的 ARPE-19 细胞能够表达并分泌目标生物制品14，并确定了细胞安全包封的参数后，制备了用于眼内注射的微囊。
向小鼠眼球内进行玻璃体内注射时，需使用27 G钝头针（内径210 µm）及精确的递送系统，以稳定注入所需的1 µL微小体积。通过显微镜确认了在经27 G针头推出过程中未受损胶囊的尺寸（<.......
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讨论
这种细胞包封技术相对快速且易于操作；然而，为获得准确的下游结果，必须注意某些要点。在包封前，细胞应在培养皿中进行培养，并维持适当的汇合度。包封操作应尽可能在具有可控气流的适当通风橱中进行。过强的气流可能影响微胶囊的形成，尤其是在长期实验中。无菌的器具和溶液对于细胞在微胶囊内的长期维持至关重要。
目前，活-死染色法被用作一种确证工具，以确定微囊内细胞的存活能力。每个微囊中的细胞数量以及在当前条件下的细胞数（通常为每个微囊12–20个细胞）也通过目视确定。每批包封细胞的存活率均通过此方法进行监测。为进一步确定细胞的存活能力，将包封的细胞溶解后重新培养。该步骤可进一步证明微囊内细胞的存活能力与完整性，从而验证细胞包封的成功。
针对该特定细胞类型，细胞包封所用的参数已经确定。上述参数是本实验中用于ARPE-19细胞包封的条件。流速、海藻酸钠浓度、施加电压以及微囊的二次包被均为可调节变量，可根据微囊的具体应用需求进行优化。同样，特定实验所需的微囊数量也需通过经验确定，或依据已知的生物制剂药代动力学/药效学（PK/PD）参数来估算。必须始终进行适.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
本研究部分得到了美国国立卫生研究院（R01EY019320）、退伍军人事务部（RX000444 和 BX003050）以及南卡罗来纳州 SmartState 基金授予 B. R. 的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3 mL 注射器 | BD | 309656 | |
| 30 G 1" 钝头针 | SAI Infusion technology | B30-100 | |
| 海藻酸钠，来自褐藻 | Sigma | A0682 | |
| 硫酸阿托品滴眼液 (1%) | Akorn | NDC 17478-215-15 | 用于瞳孔扩张 |
| BD 1 mL 注射器 26 G x 3/8 (0.45 mm x 10 mm) | Becton, Dickinson and Company | DG518105 500029609 REF 309625 | 用于制备引导孔 |
| 氯化钙，无水，颗粒状 | Sigma | C1016 | |
| GenTeal 人工泪液 | Alcon | NDC 0078-0429-47 | 用于麻醉期间润滑眼睛 |
| Goniotaire：羟丙甲纤维素 (2.5%) 滴眼用保护液（无菌） | Altaire Pharmaceuticals Inc. | NDC 59390-182-13 | 用于麻醉期间润滑眼睛 |
| Hamilton 针/注射器头：27 G，小接头 RN 针，定制长度 (12 mm)，尖端类型 3，6 支/包 | Hamilton | 7803-01 | 用于玻璃体内递送微胶囊 |
| Hamilton 注射器：2.5 µL，型号 62 RN SYR，针头单独出售 | Hamilton | 7632-01 | 用于玻璃体内递送微胶囊 |
| HEPES 缓冲液，1 M | Fisher Bioreagents | BP299100 | |
| 高压发生器 | ESD EMC Technology | ES813-D20 | |
| LIVE/DEAD 活性/细胞毒性检测试剂盒 | Thermofisher Scientific | L3224 | |
| L-鸟氨酸盐酸盐，99% | Alfa Aesar | A12111 | |
| 新霉素和多粘菌素 B 硫酸盐及地塞米松滴眼膏 | SANDOZ | NDC 61314-631-36 | 抗生素，用于预防玻璃体内注射后感染 |
| 盐酸去氧肾上腺素滴眼液 (2.5%) | Akorn | NDC 17478-201-15 | 用于瞳孔扩张 |
| 氯化钠 | Sigma | S-5886 | |
| 无菌注射器滤器，0.2 μm | VWR | 28143-312 | |
| 注射泵 | GRASEBY | MS16A |
参考文献
- Allen, T. M., Cullis, P. R. Drug delivery systems: entering the mainstream. Science. 303 (5665), 1818-1822 (2004).
- Tonnesen, H. H., Karlsen, J. Alginate in drug delivery systems. Drug Development and Industrial Pharmacy. 28 (6), 621-630 (2002).
- Vilos, C., Velasquez, L. A. <....
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重印与许可
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