用于向小鼠眼部递送生物制剂的包封细胞技术

摘要

本文介绍了一种利用海藻酸盐作为聚合物对永生化细胞进行微囊化，以实现向啮齿类动物眼部长期递送生物制剂的实验方案。

摘要

目前许多针对眼后极部疾病的在研治疗药物均为生物制剂。这类药物通常需要频繁给药，典型方式为玻璃体内注射。包封细胞可表达特定的生物制剂，正逐渐成为局部蛋白质生成与释放的工具（例如用于长期药物递送）。此外，包封系统采用可渗透材料，允许营养物质、代谢废物及治疗因子在细胞内外扩散，同时使细胞免受宿主免疫系统的识别，从而避免需要抑制宿主免疫系统。本方案描述了以海藻酸盐作为聚合物，结合电喷雾法进行微囊化包封的技术。ARPE-19细胞是一种自发形成的人视网膜色素上皮细胞系，因其长期功能性已被用于长期细胞治疗实验，本文中用于细胞包封及向小鼠眼部递送微囊。该文总结了细胞微囊化、质量控制及眼部递送的操作步骤。

引言

基于细胞的疗法是一类革命性的生物技术，已在医学领域得到广泛应用。近年来，这类疗法已成功应用于神经退行性疾病、眼部疾病和癌症的治疗。细胞疗法涵盖从细胞替代到药物递送的广泛领域，而本实验方案重点关注后者。可生物降解的海藻酸盐微胶囊（MC）已被证明是一种有效的递送系统，并在生物医学领域得到日益广泛的应用。由于海藻酸盐具有简单的凝胶化过程、可生物降解性、优异的生物相容性以及在体内条件下的稳定性，因此被广泛用于微胶囊化技术^1,2,3,4。

作为一种微胶囊化技术，电喷雾法已成功用于包封多肽和蛋白质，所用材料包括海藻酸盐（基础聚合物）和聚-L-鸟氨酸（次级包被聚合物）。这两种聚合物均为天然存在，因其良好的生物相容性而被广泛应用^5,6,7。然而，细胞治疗中的主要挑战在于如何抑制宿主免疫系统，以避免免疫抑制药物引起的副作用。海藻酸盐微胶囊的通透性被认为是细胞封装的理想特性，它允许营养物质、代谢废物和治疗因子在细胞内外扩散，同时使细胞免受宿主免疫反应的攻击^8,9,10。

在眼部，包封细胞已用于临床试验，以持续递送生物制剂（例如生长因子^11,12和生长因子拮抗剂¹³），用于治疗视网膜色素变性或年龄相关性黄斑变性。其他靶点如补体抑制剂¹⁴目前也正在临床前研究中进行探索。

方案

所有实验均遵循眼科与视觉研究中动物使用声明（ARVO声明），并经南卡罗来纳医科大学动物护理与使用委员会在方案编号00399下批准。

1. 细胞培养

1. 根据已发表的方案^14,15，构建稳定表达目标基因的人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）细胞系。
2. 将细胞培养于添加了10%胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中。
3. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育细胞。
4. 每2–3天更换一次培养基。
5. 当细胞融合度达到70%–80%时，采用标准的组织培养操作进行传代。

2. 细胞包封

1. 将海藻酸钠与去离子水（DI 水）混合，配制成终浓度为 2% w/v 的溶液，并使用 0.2 µm 无菌注射器滤器过滤纯化。
2. 通过胰酶消化、离心并用 10 mM HEPES 缓冲盐水溶液（pH = 7.4）洗涤，制备待与海藻酸钠溶液混合的细胞。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将细胞终浓度调整为 1 × 10⁶ 个/mL 海藻酸钠溶液。
   注意：包封过程应在无菌操作台内进行。
3. 将约 300 µL 海藻酸钠与细胞的混合液装入 3 mL 注射器中，并将其连接至注射泵。溶液将以 7 mm 的针尖至液面喷涂距离，通过 30 G 钝头针头被泵入置于无菌 50 mL 烧杯中的无菌凝胶浴中。
4. 凝胶浴包含 40 mL 含 100 mM 氯化钙（CaCl₂）和 0.5% w/v 多聚-L-鸟氨酸（PLO）的 10 mM HEPES 缓冲盐水。PLO 是一种可选的次级聚合物包被材料，可根据研究者需求省略或更换。
5. 调节电压和流速，并在包封过程中保持恒定，流速设为 60 mm/h，初始电压为 6.0 kV，以生成直径约为 150 µm 的微胶囊。
6. 将高压电源的阳极导线夹（红色）连接至针头，将接地夹（黑色）连接至部分浸入凝胶浴中的铜丝。每批 1 mL 的海藻酸钠 + 细胞混合液约需 30 分钟完成包封，可制得约 25,000 个微胶囊。
7. 用洗涤液（含 1.5 mM CaCl₂ 的 10 mM HEPES 缓冲盐水，pH = 7.4）对形成的含细胞微胶囊清洗两次。禁止使用 PBS 进行洗涤。
8. 将包封后的细胞置于含 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养基中，在 37 °C、5% CO₂ 的加湿培养箱中孵育。
   注意：包封过程所用仪器如 图 1 所示。

3. 验证包封不影响细胞活力

1. 将包封的细胞在培养基中孵育 24 小时后，取约 500 µL（约 30 个微胶囊）的小样用于染色。
2. 用洗涤液（含 1.5 mM CaCl₂ 的 10 mM HEPES 缓冲盐水）洗涤微胶囊 2 次，并使用活/死细胞活力检测试剂盒进行活-死染色。
3. 配制染色混合液，其中钙黄绿素 AM（乙酰氧基甲酯）和碘化丙啶同型二聚体-1（ethidium homodimer-1）的终浓度分别为 2 µM 和 4 µM。
4. 向包封的细胞中加入 2 mL 染色混合液，在室温（RT）避光条件下孵育 30–45 分钟。
5. 小心吸除染色液，用洗涤液将微胶囊洗涤 2 次。使用荧光显微镜系统观察并成像包封的细胞。
   注意：包封效果的记录如图 2所示。

4. 确认胶囊尺寸适合递送以及生物制剂的递送效果

1. 小鼠眼内玻璃体注射通常使用连接至2.5 µL Hamilton注射器的27 G钝头针（内径210 µm）进行。
2. 制备直径在100至200 µm范围内的微胶囊，将其悬浮于无血清培养基中，并小心吸入Hamilton注射器内。磷酸盐缓冲液（PBS）不适合作为载体，因为海藻酸盐微胶囊在PBS中会溶解。
3. 缓慢将含微胶囊的1 µL液滴排出至显微镜载玻片上，使用直立式明场显微镜检测其完整性。
4. 通过相应调节电压和流速来调整微胶囊大小（见步骤2.3）。提高电压并略微降低流速可非线性地生成更小的微胶囊⁸。在我们的实验中，直径为150 µm的微胶囊效果最为理想。微胶囊大小的调节还需在改变其他参数的同时保持海藻酸盐浓度恒定。
5. 将另一组细胞封装于合适尺寸的微胶囊中，并在无血清培养基中培养，以测定目标生物制品的分泌量。使用高灵敏度ELISA或蛋白质印迹法（Western blotting）检测上清液中生物制品的浓度。
6. 根据已知治疗药物的药代动力学/药效学（PK/PD）数据，确定所需注射的微胶囊数量。在我们的实验中，每只小鼠眼注射10个微胶囊效果最佳。

5. 将胶囊递送至小鼠玻璃体

1. 使用解剖显微镜进行玻璃体内注射。手术设置及操作过程中所用材料见图3。有关玻璃体内注射的详细方案，可参见其他文献¹⁶。
2. 通过腹腔注射赛拉嗪和氯胺酮（剂量分别为20 mg/kg和80 mg/kg）或其他经本机构动物护理与使用委员会批准的麻醉剂对小鼠进行麻醉。通过脚趾夹捏测试确认麻醉深度是否合适¹⁷。
3. 使用盐酸去氧肾上腺素（2.5%）和硫酸阿托品（1%）散大鼠瞳孔，以便清晰观察玻璃体腔，并在眼睛上涂抹润滑性眼用凝胶，以保持术中眼球湿润。
4. 在角巩膜缘处用26 G针头刺穿巩膜作为引导孔，操作时需确保：1）针头与眼球及操作台呈45°角；2）斜面针尖朝上，以避免刺破晶状体。
5. 在直视下，使用连接至哈密尔顿注射器的27 G钝头针以45°角小心注入微胶囊，注意避免针头接触晶状体。晶状体损伤将导致白内障形成。注入后，微胶囊应在玻璃体中可见（通过解剖显微镜观察，图4A）。
6. 拔出针头后，对注射部位使用新霉素和硫酸多粘菌素B软膏，同时加用地塞米松眼用抗生素软膏。
7. 向双眼滴加2.5%羟丙甲纤维素眼用胶体溶液，以防止恢复期间角膜干燥。
8. 将小鼠置于设定为37°C的加热垫上，并持续监测直至完全清醒。
9. 成功注射包裹的ARPE-19细胞后，通过光学相干断层扫描或其他成像方法观察小鼠眼内玻璃体腔，应可见完整微胶囊，仅伴有少量碎片（图4B）。
10. 小鼠眼部在经历数天术后恢复后，现已准备好进入当前实验方案。
    注意：手术设置及眼内微胶囊的记录分别如图3和图4所示。

结果

ARPE-19 细胞是一种自发永生化的人视网膜色素上皮细胞系，已被证明适用于包封，并在将微囊植入眼内后能够长期存活。图1展示了海藻酸盐包封所用的工具。本研究中，通过明场成像证实了海藻酸盐微囊内的细胞存在（图2A）。对微囊内细胞进行活/死细胞染色检测，结果显示包封后细胞存活率达90%（图2B）。为确保微囊内细胞的长期存活能力，将微囊溶解于柠檬酸钠溶液中，随后将细胞重新接种（图2C）。在独立实验中确认稳定转染的 ARPE-19 细胞能够表达并分泌目标生物制品¹⁴，并确定了细胞安全包封的参数后，制备了用于眼内注射的微囊。

向小鼠眼球内进行玻璃体内注射时，需使用27 G钝头针（内径210 µm）及精确的递送系统，以稳定注入所需的1 µL微小体积。通过显微镜确认了在经27 G针头推出过程中未受损胶囊的尺寸（<...

讨论

这种细胞包封技术相对快速且易于操作；然而，为获得准确的下游结果，必须注意某些要点。在包封前，细胞应在培养皿中进行培养，并维持适当的汇合度。包封操作应尽可能在具有可控气流的适当通风橱中进行。过强的气流可能影响微胶囊的形成，尤其是在长期实验中。无菌的器具和溶液对于细胞在微胶囊内的长期维持至关重要。

目前，活-死染色法被用作一种确证工具，以确定微囊内细胞的存活能力。每个微囊中的细胞数量以及在当前条件下的细胞数（通常为每个微囊12–20个细胞）也通过目视确定。每批包封细胞的存活率均通过此方法进行监测。为进一步确定细胞的存活能力，将包封的细胞溶解后重新培养。该步骤可进一步证明微囊内细胞的存活能力与完整性，从而验证细胞包封的成功。

针对该特定细胞类型，细胞包封所用的参数已经确定。上述参数是本实验中用于ARPE-19细胞包封的条件。流速、海藻酸钠浓度、施加电压以及微囊的二次包被均为可调节变量，可根据微囊的具体应用需求进行优化。同样，特定实验所需的微囊数量也需通过经验确定，或依据已知的生物制剂药代动力学/药效学（PK/PD）参数来估算。必须始终进行适...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3 mL 注射器	BD	309656
30 G 1" 钝头针	SAI Infusion technology	B30-100
海藻酸钠，来自褐藻	Sigma	A0682
硫酸阿托品滴眼液 (1%)	Akorn	NDC 17478-215-15	用于瞳孔扩张
BD 1 mL 注射器 26 G x 3/8 (0.45 mm x 10 mm)	Becton, Dickinson and Company	DG518105 500029609 REF 309625	用于制备引导孔
氯化钙，无水，颗粒状	Sigma	C1016
GenTeal 人工泪液	Alcon	NDC 0078-0429-47	用于麻醉期间润滑眼睛
Goniotaire：羟丙甲纤维素 (2.5%) 滴眼用保护液（无菌）	Altaire Pharmaceuticals Inc.	NDC 59390-182-13	用于麻醉期间润滑眼睛
Hamilton 针/注射器头：27 G，小接头 RN 针，定制长度 (12 mm)，尖端类型 3，6 支/包	Hamilton	7803-01	用于玻璃体内递送微胶囊
Hamilton 注射器：2.5 µL，型号 62 RN SYR，针头单独出售	Hamilton	7632-01	用于玻璃体内递送微胶囊
HEPES 缓冲液，1 M	Fisher Bioreagents	BP299100
高压发生器	ESD EMC Technology	ES813-D20
LIVE/DEAD 活性/细胞毒性检测试剂盒	Thermofisher Scientific	L3224
L-鸟氨酸盐酸盐，99%	Alfa Aesar	A12111
新霉素和多粘菌素 B 硫酸盐及地塞米松滴眼膏	SANDOZ	NDC 61314-631-36	抗生素，用于预防玻璃体内注射后感染
盐酸去氧肾上腺素滴眼液 (2.5%)	Akorn	NDC 17478-201-15	用于瞳孔扩张
氯化钠	Sigma	S-5886
无菌注射器滤器，0.2 μm	VWR	28143-312
注射泵	GRASEBY	MS16A