方法文章

从胚胎干细胞中分离富含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的外泌体富集型细胞外囊泡

DOI：

10.3791/60170

⸱

2021年11月11日

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1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Louisville, 2Experimental Therapeutics Program, Brown Cancer Center, University of Louisville, 3Department of Medicine, University of Louisville, 4Department of Surgery, University of Louisville, 5Immuno-Oncology Program, Brown Cancer Center, University of Louisville, 6Department of Microbiology and Immunology, University of Louisville

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究描述了一种从胚胎干细胞中分离富含携带免疫刺激性粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的外泌体富集型细胞外囊泡的方法。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

胚胎干细胞（ESCs）是一类具有自我更新能力并能分化为所有类型胚胎细胞的多能干细胞。与其他多种细胞类似，ESCs 会向细胞外环境释放小的膜性囊泡，例如外泌体。外泌体作为细胞间通讯的重要介质，在多种（病理）生理过程中发挥基础性作用。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）作为一种细胞因子，可调节免疫应答。外泌体中存在 GM-CSF 可能增强其免疫调节功能。本研究中，GM-CSF 在小鼠胚胎干细胞系 ES-D3 中实现了稳定过表达。我们建立了一种从过表达 GM-CSF 的 ES-D3 细胞中分离高质量外泌体富集型细胞外囊泡（EVs）的实验方案。通过多种实验方法对外泌体富集型 EVs 进行了表征。重要的是，在外泌体富集型 EVs 中检测到大量 GM-CSF 的存在。总体而言，携带 GM-CSF 的胚胎干细胞来源的外泌体富集型 EVs 可能作为无细胞囊泡发挥其免疫调节功能。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

胚胎干细胞（ESCs）来源于着床前胚胎的囊胚阶段1。作为多能干细胞，ESCs 具有自我更新的能力，并可分化为任何类型的胚胎细胞。由于其显著的发育潜能和长期增殖能力，ESCs 在生物医学研究中具有极高的价值1。目前的研究工作主要集中于 ESCs 在多种重大病理疾病治疗中的潜力，包括糖尿病、心脏病和神经退行性疾病2,3,4。

已知包括胚胎干细胞（ESCs）在内的哺乳动物细胞会向细胞外环境释放大小不一的囊泡，这些细胞外囊泡（EVs）因其在细胞间通讯中的作用而具有多种生理和病理功能5。在不同亚型的EVs中，外泌体（exosomes）是当内体中间区室——多泡体（MVBs）与质膜融合时，由多种细胞类型释放到细胞外空间的小型膜性囊泡6。已有研究报道，外泌体介导细胞间通讯，并在多种（病理）生理过程中发挥关键作用7,8。外泌体继承了其亲代细胞的部分生物学功能，因为其含有来自细胞质的生物分子，包括蛋白质和核酸。因此，针对特定疾病激发免疫反应的相关抗原或因子可被包裹于特定类型细胞来源的外泌体中9。这为探索肿瘤来源的外泌体作为抗肿瘤疫苗的临床试验奠定了基础10。

GM-CSF 是一种由多种类型免疫细胞分泌的细胞因子11。越来越多的证据表明，GM-CSF 能够激活并调节免疫系统，在抗原呈递过程中发挥关键作用12。例如，一项临床研究报告指出，GM-CSF 作为疫苗佐剂可刺激机体对肿瘤的免疫应答13。目前已有多种基于 GM-CSF 的癌症免疫治疗策略，旨在利用 GM-CSF 强效的免疫刺激活性，并已在临床试验中得到研究验证14。其中，一种由经辐照后可分泌 GM-CSF 的肿瘤细胞组成的癌症疫苗，在晚期黑色素瘤患者中显示出一定前景，能够诱导细胞免疫和体液抗肿瘤反应，进而导致转移性肿瘤发生继发性坏死15。

由于胚胎干细胞（ESCs）来源的外泌体具有与原始胚胎干细胞相似的生物学活性，因此携带粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的胚胎干细胞外泌体可能作为无细胞囊泡来调节免疫反应。本文描述了一种从表达GM-CSF的胚胎干细胞中制备高质量外泌体富集型细胞外囊泡（EVs）的详细方法。这些外泌体富集的EVs有望作为免疫调节性囊泡，用于调控免疫反应。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 培养ES-D3细胞

  1. 为制备无外泌体的胎牛血清（FBS），将FBS加入超速离心机中，在4 °C条件下以100,000 × g 离心16小时。离心后，收集上清液作为无外泌体FBS，用于培养小鼠ESC细胞系ES-D3并获取富含外泌体的细胞外囊泡（EVs）。
  2. 在接种ES-D3细胞前，使用0.1%明胶在室温下孵育15 cm组织培养皿30分钟进行包被处理。
  3. 按照先前描述的方法16，在经明胶包被的15 cm组织培养皿中无饲养层细胞培养ES-D3细胞。ES-D3细胞培养基由DMEM、无外泌体FBS（15%）、非必需氨基酸（0.1 mM）、L-谷氨酰胺（2 mM）、β-巯基乙醇（0.1 mM）、青霉素（50 units/mL）、链霉素（50 µg/mL）和白血病抑制因子（LIF；100 units/mL）组成。将ES-D3细胞置于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中培养。
  4. 当ES-D3细胞在15 cm组织培养皿中融合度达到约90%时，通过抽吸去除培养基。用胰蛋白酶（5 mL；0.05%）洗涤细胞，随后加入胰蛋白酶（5 mL），在37 °C孵育5分钟。从培养皿中收集细胞。
  5. 向收集的细胞中加入新鲜培养基（5 mL）以灭活胰蛋白酶。在390 × g 条件下离心5分钟。用新鲜培养基重悬细胞，并使用血细胞计数板测定细胞数量。
  6. 进行细胞传代时，将ES-D3细胞（5 × 106）接种于经0.1%明胶包被的15 cm组织培养皿中，加入新鲜培养基（15 mL），培养3天后进行继代培养。
  7. 为收集用于分离富含外泌体EVs的细胞培养上清液，将ES-D3细胞（1 × 107）接种于经0.1%明胶包被的15 cm组织培养皿中，加入新鲜培养基（15 mL），培养3天后收集细胞培养上清液。

2. GM-CSF 表达质粒的构建

注意：构建转染质粒 pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP，用于在 ES-D3 细胞中过表达 GM-CSF。该质粒中，小鼠 GM-CSF cDNA 与标记蛋白人源化 Renilla reniformis GFP（hrGFP）的表达由人肽链延伸因子 1α（EF1α）启动子驱动17,18。

  1. 构建载体骨架。
    1. 使用限制性内切酶EcoRI（100单位）在37 °C下消化质粒pEF1α-FD3ER-IRES-hrG（20 µg DNA）2小时，产生两个DNA片段：载体骨架（6.0 kb）和FD3ER插入片段（2.5 kb）。
    2. 将50%的消化后质粒DNA（10 µg）转移至一个1.5 mL微量离心管中，并在37 °C下用碱性磷酸酶（20单位）处理1小时。通过琼脂糖凝胶电泳（2%）分离未处理和去磷酸化的DNA。
    3. 使用DNA凝胶回收试剂盒纯化载体骨架DNA片段（6.0 kb）。其中，未处理的载体骨架将作为空载体（pEF1α-IRES-hrGFP），而去磷酸化的载体骨架将用于构建表达GM-CSF的质粒（pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP）。
  2. 构建GM-CSF cDNA插入片段。
    1. 使用限制性内切酶EcoRI（100单位）在37 °C下消化质粒pMSCV-mGM-CSF-IRES-EGFP19（20 µg）2小时，产生两个DNA片段：载体骨架（6.5 kb）和小鼠GM-CSF cDNA插入片段（474 bp）。
    2. 通过琼脂糖凝胶电泳（2%）分离消化后的DNA。使用DNA凝胶回收试剂盒纯化小鼠GM-CSF cDNA片段（474 bp）。
  3. 构建表达质粒。
    1. 使用DNA连接试剂盒设置两个连接反应（总体积10 μL）。
      1. 为构建空载体pEF1α-IRES-hrGFP，将第2.1.3步中未处理的载体骨架（6.0 kb；500 ng）进行连接。
      2. 为构建pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP，连接以下DNA片段：（1）第2.1.3步中去磷酸化的载体骨架（6.0 kb；500 ng）和（2）第2.2.2步中获得的mGM-CSF cDNA片段（474 bp；200 ng）。
    2. 在25 °C下连接5分钟。将连接产物转化至DH5α感受态E. coli细胞中。将转化后的E. coli细胞涂布于含羧苄青霉素（50 μg/mL）的LB琼脂平板上。
    3. 使用DNA提取试剂盒从单个E. coli菌落中提取质粒DNA。通过DNA测序验证质粒的正确性。

3. 过表达GM-CSF的ES-D3细胞的制备

注意：将质粒 pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP 转染至 ES-D3 细胞中，以过表达 GM-CSF。同时共转染质粒 pBabe-Neo 至 ES-D3 细胞中，以利于稳定转染细胞的筛选18,20。

  1. 将质粒转染至 ES-D3 细胞中。
    1. 将 ES-D3 细胞（1.4 × 106）接种于经明胶（0.1%）包被的 10 cm 组织培养皿中，加入培养基（10 mL）进行转染。将接种后的 ES-D3 细胞在 37 °C 培养 24 h。
    2. 在 1.5 mL 微离心管中配制两种质粒混合物：（1）pEF1α-IRES-hrGFP（28 µg，空载体对照）与 pBabe-Neo（4 µg）；（2）pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP（28 µg，表达 GM-CSF）与 pBabe-Neo（4 µg）。使用转染试剂盒，按照制造商提供的操作说明进行转染。
    3. 向每管含有质粒混合物的溶液中加入转染培养基（1 mL）和转染试剂（64 µL），室温孵育 5 min。
    4. 将转染混合物分别加入含有 ES-D3 细胞的 10 cm 培养皿中。在 37 °C 孵育 5 h。
    5. 将 10 cm 培养皿中的培养基更换为新鲜培养基（10 mL）。在 37 °C 继续孵育 24 h。
  2. 建立稳定转染的 ES-D3 细胞群体。
    1. 移除转染后 ES-D3 细胞的培养基，用胰蛋白酶（2 mL；0.05%）洗涤细胞。加入胰蛋白酶（2 mL），在 37 °C 孵育 5 min。将细胞转移至 15 mL 离心管中，并加入 2 mL 新鲜培养基以中和胰蛋白酶。在 390 × g 离心 5 min。
    2. 将转染后的细胞重悬于新鲜培养基（10 mL）中。按照制造商的操作说明，使用荧光激活细胞分选（FACS）检测转染 ES-D3 细胞中 GFP 的荧光强度。
    3. 将转染后的细胞转移至两个含有新鲜培养基（10 mL）的 10 cm 培养皿中。加入新霉素（0.5 mg/mL）以清除未转染的细胞。
    4. 在含新霉素（0.5 mg/mL）的培养基中持续培养转染细胞。当转染的 ES-D3 细胞达到 90% 汇合度时，再次将细胞转移至 15 cm 组织培养皿中。重复该过程 2 周。
  3. 建立稳定转染的 ES-D3 细胞克隆。
    1. 在获得稳定转染的 ES-D3 细胞群体后，按前述方法收集细胞。使用血细胞计数板测定细胞数量。在 390 × g 离心 5 min。将细胞重悬于新鲜培养基中，浓度为 1 × 107 个细胞/mL。
    2. 通过无菌 40 µm 细胞滤网过滤细胞。按照制造商的操作说明，使用 FACS 分选 GFP 阳性的 ES-D3 细胞。
    3. 将单个分选后的 ES-D3 细胞接种至经明胶（0.1%）包被的 96 孔组织培养板的一个孔中，每孔含无新霉素的培养基（200 µL）及亲本 ES-D3 细胞（1 × 103 个）。将转染的 ES-D3 细胞与未转染的亲本细胞共培养，可确保稳定转染的单个 ES-D3 细胞存活并增殖形成单克隆。
    4. 培养 48 h 后，向 96 孔板中加入新霉素（0.5 mg/mL），以清除未转染的亲本 ES-D3 细胞。
    5. 在含新霉素（0.5 mg/mL）的培养基中继续培养 GFP 阳性的 ES-D3 细胞 1 周。随后将克隆的 ES-D3 细胞系转移至含新霉素（0.5 mg/mL）的培养基（5 mL）的明胶（0.1%）包被的 6 cm 组织培养皿中，继续培养 1 周。
    6. 按照制造商的操作说明，使用 FACS 检测各转染 ES-D3 细胞克隆中 GFP 荧光强度。选择表达 GM-CSF 或空载体且绿色荧光水平较高的 ES-D3 克隆。
    7. 按照制造商的操作说明，使用小鼠 GM-CSF ELISA 试剂盒测定 ES-D3 细胞分泌的 GM-CSF 含量。

4. 外泌体富集的细胞外囊泡的分离

  1. 将 ES-D3 细胞（1 × 107）在 15 cm 组织培养皿中于 37 °C 培养 72 小时。收集细胞培养上清液。将收集的上清液在 4 °C 下保存，最长可保存 1 周，以维持外泌体的完整性。
  2. 使用离心机在 4 °C 下以 5,000 × g 离心细胞培养上清液 60 分钟，以沉淀较大的细胞碎片。
  3. 收集上清液，并使用超速离心机在 4 °C 下以 100,000 × g 离心 90 分钟。
  4. 弃去上清液。用磷酸盐缓冲液（PBS；1 mL）轻轻冲洗每个沉淀物两次，以去除残留的培养上清液。
  5. 将每个沉淀物重悬于 PBS 中。通过蛋白质含量定量富含外泌体的细胞外囊泡（EVs）5。
    1. 使用二辛可宁酸（BCA）法测定富含外泌体的 EVs 的蛋白质浓度。从 ES-D3 细胞获得的富含外泌体的 EVs 预期产量约为每毫升细胞培养上清液 4 µg 蛋白质。将富含外泌体的 EVs 重悬于 PBS 中（蛋白质浓度：约 6 µg/µL）。将富含外泌体的 EVs 储存在 -80 °C。

5. 通过透射电子显微镜表征外泌体富集的细胞外囊泡

注意：使用透射电子显微镜（TEM）分析从胚胎干细胞（ESCs）中分离的富含外泌体的细胞外囊泡（EVs）的组成和结构5。

  1. 在室温下，用终浓度为2%的电镜级甲醛固定外泌体富集的细胞外囊泡（3-5 µg/µL），固定时间为2小时。
  2. 将固定后的样品（10 µL）加到带有碳支持膜的铜网上，孵育1分钟，然后用滤纸吸去多余液体。
  3. 按照生产商说明书，使用染色液对铜网进行染色。
  4. 用镊子将铜网转移至一张滤纸上，于室温下静置过夜使其自然干燥。
  5. 按照生产商说明书，使用透射电子显微镜（放大倍数50,000×）采集电镜图像。

6. 通过蛋白质印迹分析评估外泌体富集的细胞外囊泡

  1. 制备全细胞提取物。
    1. 移除在15 cm培养皿中培养的ES-D3细胞的培养基。用胰蛋白酶（5 mL；0.05%）洗涤细胞。向细胞中加入胰蛋白酶（5 mL）。在37 °C孵育5 min。收集细胞，并加入新鲜培养基（5 mL）以中和胰蛋白酶。在390 x g离心5 min。用PBS重悬细胞。
    2. 使用血细胞计数板确定细胞数量。再次在390 x g离心5 min。用含有0.5% SDS的SDS-PAGE上样缓冲液重悬细胞（5,000个细胞/µL）。
    3. 使用超声破碎仪（振幅10%，功率：500 W，超声频率：20 kHz）对样品超声处理10 s。在100 °C加热样品5 min。
  2. 制备富含外泌体的细胞外囊泡（EV）裂解液。
    1. 将富含外泌体的EV用含有0.5% SDS的SDS-PAGE上样缓冲液重悬，浓度为1.2 µg/µL。
    2. 使用超声破碎仪（振幅10%，功率：500 W，超声频率：20 kHz）对样品超声处理10 s。在100 °C加热样品5 min。
  3. 通过Western blot检测蛋白质。
    1. 将全细胞提取物（10 µL；5,000个细胞/µL）和富含外泌体的EV裂解液（10 µL；1.2 µg/µL）分别上样至Bis-Tris PAGE凝胶（4–20%）的每个孔中。将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。
    2. 用适当的一抗和二抗孵育膜。将抗体（按以下指示浓度）稀释于含有PBS、Tween-20（0.2%）和脱脂奶粉（10% w/v）的杂交缓冲液中。
      1. 使用以下一抗：抗Annexin V抗体（200 ng/mL）、抗CD81抗体（50 ng/mL）、抗Flotillin-1抗体（200 ng/mL）、抗细胞色素c抗体（100 ng/mL）、抗蛋白二硫键异构酶抗体（200 ng/mL）、抗GAPDH抗体（33 ng/mL）和抗Oxphos COX IV亚基IV抗体（600 ng/mL）。
      2. 使用以下二抗：辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔IgG（20 ng/mL）和辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG（20 ng/mL）。
    3. 使用增强型化学发光检测试剂盒检测蛋白质。

7. 通过ELISA测定富含外泌体的细胞外囊泡中的GM-CSF浓度

注意：使用小鼠 GM-CSF 检测试剂盒，按照生产商说明书进行 ELISA 检测，评估外泌体富集的细胞外囊泡中 GM-CSF 的含量，并作部分修改。

  1. 用捕获抗体包被ELISA板。将外泌体富集的EVs（0.6 µg）溶于PBS或含0.05% Tween-20的PBS中（100 µL），室温处理30分钟。将处理后的样品加入包被好的ELISA板中，室温孵育1小时。用PBS或含0.05% Tween-20的PBS洗涤平板。
  2. 向样品中加入检测抗体，室温孵育1小时。用PBS或含0.05% Tween-20的PBS洗涤平板。向样品中加入链霉亲和素-HRP，室温孵育30分钟。再次用PBS或含0.05% Tween-20的PBS洗涤平板。
  3. 使用酶标仪在450 nm处测定吸光度，以确定外泌体富集EVs中GM-CSF的浓度。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在小鼠 ESC 中，GM-CSF 呈过表达状态。
为了在 ES-D3 细胞中稳定过表达 GM-CSF，将小鼠 GM-CSF cDNA 克隆至转染载体中，构建表达载体 pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP（图 1A）。通过转染在 ES-D3 细胞中实现 GM-CSF 的过表达，约 20% 的瞬时转染 ES-D3 细胞呈 GFP 阳性。通过 FACS 获得稳定过表达 GM-CSF 或空载体对照的细胞克隆。如 图 1B 所示，表达 GM-CSF 的 ES-D3 细胞系或表达空载体的 ES-D3 细胞系的 GFP 荧光强度明显高于其亲本细胞。采用 ELISA 检测不同细胞系培养上清液中的 GM-CSF 浓度（图 2）。表达 GM-CSF 的 ES-D3 细胞在培养上清液中产生的 GM...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究展示了一种高效制备富含外泌体（exosome-enriched EVs）并携带免疫刺激蛋白GM-CSF的方法，可用于研究富含外泌体的EVs在免疫调节方面的作用。多项研究表明，外泌体具有免疫调节和抗肿瘤功能22。因此，表达GM-CSF的胚胎干细胞（ESC）来源的外泌体也可能具有调节免疫反应的生物学活性。在本实验方案中，通过转染技术在小鼠ES-D3细胞中稳定过表达外源性小鼠GM-CSF（图1）。重要的是，在过表达GM-CSF的ES-D3细胞所分离出的富含外泌体的EVs中，检测到大量GM-CSF蛋白（图5）。

这些数据表明，几乎所有GM-CSF均存在于外泌体富集的细胞外囊泡（EVs）中。作为一种细胞因子，大部分GM-CSF蛋白被分泌到细胞外11。与其他外泌体 cargo 物质（如mRNA、miRNA和蛋白质）类似，细胞质中的GM-CSF分子被包裹在多泡体（MVBs）的腔...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kavitha Yaddanapudi、Chi Li 和 John W. Eaton 提交了一项美国专利申请：“包含工程化胚胎干细胞来源的外泌体的组合物及其使用方法”。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢 Arkadiusz Slusarczyk 先生以及肯塔基生物医学研究基础设施网络（KBRIN, P20GM103436）在获取透射电子显微镜图像方面提供的帮助。本研究部分得到了以下资助：NIH AA018016-01（J.W.E.）、肯塔基州研究挑战信托基金（J.W.E.）、NIH CA106599 和 CA175003（C.L.）、NIH CA198249（K.Y.）以及 Free to Breathe 研究基金（K.Y.）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
小牛肠碱性磷酸酶New England BiolabsM0290S质粒DNA去磷酸化
抗Annexin V单克隆抗体Santa Cruz Biotechnology克隆H-3, sc-74438Western blot, RRID:AB_1118989
抗CD81单克隆抗体Santa Cruz Biotechnology克隆B-11, sc-166029Western blot, RRID:AB_2275892
抗细胞色素c单克隆抗体Santa Cruz Biotechnology克隆A-8, sc-13156Western blot, RRID:AB_627385
抗Flotillin-1单克隆抗体Santa Cruz Biotechnology克隆C-2; sc-74566Western blot, RRID:AB_2106563
抗GAPDH多克隆抗体Rockland600-401-A33SWestern blot, RRID:AB_11182910
辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG山羊抗体Thermo Fisher31430Western blot, RRID:AB_228307
抗氧化磷酸化复合物IV亚基IV（COX IV）单克隆抗体Thermo Fisher克隆20E8C12 A21348Western blot, RRID:AB_221509
抗蛋白二硫键异构酶（PDI）多克隆抗体EnzoADI-SPA-890Western blot, RRID:AB_10616242
辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG山羊抗体Thermo Fisher31460Western blot, RRID:AB_228341
BCA（双辛可宁酸）蛋白定量试剂盒Thermo Fisher23223测定蛋白质浓度
Bis-Tris PAGE凝胶，ExpressPlus，4-20%GenscriptM42015Western blot
羧苄青霉素二钠盐Thermo Fisher10177012筛选E. coli菌落
Avanti J-26 XPI离心机Beckman Coulter低速离心
JA-10离心转子Beckman Coulter09U1597低速离心
Nalgene PPCO离心瓶Thermo Fisher3120-0500PK低速离心
带碳支持膜的铜网Electron Microscopy SciencesFF200-Cu获取透射电子显微镜图像
EcoRINew England BiolabsR0101质粒DNA酶切
增强型化学发光检测系统Thermo Fisher32106Western blot
FACScalibur流式细胞仪Becton Dickinson检测ES-D3细胞中GFP表达水平
胎牛血清ATCCSCRR-30-2020ES-D3细胞培养基
Fisherbrand无菌细胞筛，孔径：40μmThermo Fisher22-363-547过滤ES-D3细胞用于FACS分选
明胶（0.1%）Thermo FisherES006BES-D3细胞培养
GM-CSF ELISA试剂盒Thermo Fisher88733422测定GM-CSF浓度
KnockOut Dulbecco’s改良Eagle’s培养基Thermo Fisher10-829-018ES-D3细胞培养基
白血病抑制因子Thermo FisherESG1106ES-D3细胞培养基
L-谷氨酰胺VWRVWRL0131-0100ES-D3细胞培养基
Lipofectamine 2000转染试剂Thermo Fisher11668019转染ES-D3细胞
Microplate读板仪，PowerWave XSBioTek测定GM-CSF浓度
MoFlo XDP高速细胞分选仪Beckman Coulter分离单个ES-D3细胞克隆
NEB 5-alpha感受态E. coliNew England BiolabsC2988J构建GM-CSF表达质粒
新霉素Thermo Fisher10-131-035筛选ES-D3细胞克隆
非必需氨基酸Thermo FisherSH3023801ES-D3细胞培养基
脱脂奶粉Thermo FisherNC9022655Western blot
Opti-MEM I低血清培养基Thermo Fisher31985062转染ES-D3细胞
多聚甲醛Electron Microscopy Sciences15710获取透射电子显微镜图像
青霉素/链霉素VWRsc45000-652ES-D3细胞培养基
质粒pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFPAddgene37270构建GM-CSF表达质粒
PVDF膜Millipore EMDIPVH00010Western blot
QIAprep Spin Miniprep试剂盒（250）QIAGEN27106构建GM-CSF表达质粒
QIAquick凝胶回收试剂盒（50）QIAGEN28704构建GM-CSF表达质粒
Quick Ligation连接试剂盒New England BiolabsM2200S构建GM-CSF表达质粒
透射电子显微镜HitachiHT7700获取透射电子显微镜图像
胰蛋白酶VWR45000-660ES-D3细胞培养
OptimaTM L-100 XP超速离心机Beckman Coulter高速离心
45Ti超速离心转子Beckman Coulter09U4454高速离心
聚碳酸酯超速离心管Beckman Coulter355622高速离心
UranyLess染色液Electron Microscopy Sciences22409获取透射电子显微镜图像

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Sakthiswary, R., Raymond, A. A. Stem cell therapy in neurodegenerative diseases: From principles to practice. Neural Regeneration Research. 7 (23), 1822-1831 (2012).
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