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方法文章

一种用于药物药代动力学与毒理学评估的肠/肝微生理系统

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DOI：

10.3791/60184

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2020年12月3日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Brazilian Biosciences National Laboratory (LNBio), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM), 2Brazilian Synchrotron Light Laboratory (LNLS), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM), 3Grupo Boticário, 4Institute of Biology, University of Campinas

本文内容

摘要

我们将含有肠道和肝脏类器官的微生理系统（MPS）暴露于对乙酰氨基酚（APAP）中。本文介绍了在MPS中进行类器官制备以及APAP药代动力学和毒理学特性评估的方法，同时还描述了验证结果所必需的组织功能分析。

摘要

近年来新出现的微生理系统（MPS）通过培养人类类器官，在药物研发的临床前测试阶段有望优于动物模型，因为其具有人类基因背景并能模拟组织间的相互作用。本研究将人肠屏障（由Caco-2和HT-29细胞共培养构建）与肝等效物（由分化后的HepaRG细胞和人肝星状细胞组成的球状体构建）集成于一种双器官芯片（2-OC）微流控装置中，用于评估对乙酰氨基酚（APAP）的部分药代动力学（PK）和毒理学特性。该MPS包含三种构型：仅肠道2-OC、仅肝脏2-OC，以及肠道/肝脏2-OC（两种类器官由相同培养基灌注）。在药代动力学评估中，我们分别通过肠屏障上方给药（模拟口服途径）或直接加入培养基中（模拟静脉注射途径），在预设时间点以12 µM和2 µM的浓度给予APAP。培养基样品采用反相高效液相色谱法（HPLC）进行分析。对类器官进行了基因表达、跨上皮电阻（TEER）值、蛋白质表达与活性分析，并随后收集、固定，进行一系列形态学评估。MTT法在评估类器官活力方面表现良好，但高内涵分析（HCA）能够更早地检测到APAP处理引发的毒性事件。我们证实，培养基流动对APAP吸收无显著影响，但显著提升了肝等效物的功能。该MPS成功模拟了APAP在人体肠道的吸收及其肝脏代谢过程。MPS实验数据与计算机模拟建模相结合，具有巨大潜力，可提高体外方法的预测能力，在药代动力学和毒理学研究中提供比动物模型更高的准确性。

引言

由于基因组和蛋白质组的差异，动物模型在预测多种人类生理结果方面的价值有限。此外，动物实验耗时长、成本高，且存在伦理争议1。微生理系统（MPS）是一项相对较新的技术，旨在提高临床前测试的预测能力，同时降低其成本和耗时。MPS 是一种微流控装置，可在培养基流动条件下培养类器官（即模拟器官功能的人工功能单元），促进类器官之间的相互交流。使用人类细胞构建的类器官可显著提高研究的转化相关性2,3,4。由于 MPS 在遗传上属于人类来源，并能模拟不同组织间的相互作用，其表现预期优于动物实验。当功能完全实现时，MPS 将以更高的速度、更低的成本和风险提供更具意义的研究结果4。目前，许多研究团队正在开发用于多种用途的 MPS，尤其是用于评估药物疗效的疾病模型。

暴露水平是评估药物有效性和毒性的最关键参数之一5,6,7,8,9,10,11,12。微生理系统（MPS）可实现类器官整合，模拟全身暴露状态，其表现预期优于传统的人源二维组织培养。该技术可显著提高对化合物肠道吸收和肝脏代谢的预测能力4。

考虑到肠道和肝脏在药物生物利用度和全身暴露中的核心作用，整合了人体等效肠道和肝脏模型的微生理系统（MPS）是一个良好的起点13,14,15。对乙酰氨基酚（APAP）是研究不含肾脏等效模块的MPS的理想药物，因其代谢主要由肝脏完成16,17。

2-OC 是一种双腔微流控装置，适用于培养两种不同的人体等效组织/类器官，二者通过微通道相互连接16为了模拟药物在体外的人体口服/静脉给药，并评估肠和肝类器官之间相互作用对乙酰氨基酚（APAP）药代动力学的影响，同时考察类器官的功能性与存活状态，共构建了三种不同的微生理系统（MPS）组装模式：（1）“肠-双通道器官芯片系统（Intestine 2-OC MPS）”，由基于培养小室的肠类器官组成，其中包含Caco-2与HT-29细胞的共培养体系，并集成于2-OC装置中；（2）“肝-双通道器官芯片系统（Liver 2-OC MPS）”，由肝类球体组成，包含HepaRG细胞与人肝星状细胞（HHSteC），并集成于2-OC装置中；（3）“肠/肝-双通道器官芯片系统（Intestine/Liver 2-OC MPS）”，在一个装置腔室中集成肠类器官，通过培养基流动与另一腔室中的肝类器官相连，实现两者间的交互作用。 微流控通道。

由于机械刺激（压缩、拉伸和剪切）对细胞活力和功能的影响，所有检测均在静态（无流动）和动态（有流动）条件下进行18,19,20。本文描述了在包含人肠和肝等效模型的2-器官芯片系统（2-OC MPS）中模拟对乙酰氨基酚（APAP）口服/静脉注射给药，以及相应的吸收/代谢和毒理学分析的实验方案。

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方案

1. 用于2-OC培养的组织等效物的制备

  1. 小肠屏障等效物的制备
    1. 使用肠上皮等效培养基培养 Caco-2 和 HT-29 细胞：DMEM 添加 10% 胎牛血清、1% 青霉素和链霉素以及 1% 非必需氨基酸，本论文中将该培养基命名为“DMEM S”。
    2. 移除培养基，用 1× DPBS 洗涤两次，然后加入 8 mL 0.25% 胰蛋白酶/EDTA，以解离在细胞培养瓶（175 cm²）中培养的 Caco-2 细胞2）。在37 °C孵育5分钟，然后加入至少两倍体积的胰蛋白酶抑制剂以终止反应。对HT-29细胞执行相同操作，但需根据细胞数量较少以及培养于较小培养瓶（75 cm²）的情况调整试剂用量。2).
    3. 以 250 x g 离心 g 孵育5分钟，弃去两管中的上清液，将细胞沉淀重悬于10 mL DMEM S中。进行细胞计数，确保细胞活力高于80%。在24孔板的每个孔基底外侧（代表人体血液侧）预先加入400 µL DMEM S，无菌操作将细胞培养小室整合至该24孔板中。
    4. 以9:1的比例共培养Caco-2和HT-29细胞21. 使用 2.25 x 105 Caco-2 和 2.5 x 104 将HT-29细胞加入每个肠类器官，终体积为200 µL DMEM S。根据所需类器官数量调整细胞数量和体积。轻柔混匀。
    5. 将200 µL细胞悬液移液至每个小室的顶侧（代表人肠腔侧），每个小室接种250,000个细胞。将小室中的细胞共培养三周22每周至少更换培养基三次，使用无菌巴斯德吸管从顶端和基底外侧吸取培养基，注意避免损伤完整的细胞屏障。
      注意：从细胞小室的顶端进行吸液操作，避免接触细胞屏障（将巴斯德吸管靠在细胞小室的塑料边缘上以支撑并完成吸液）。
    6. 每隔三天使用伏特计测量跨上皮电阻（TEER），以检测紧密单层的形成情况23，按照制造商的说明进行。
      1. 使用不含细胞但含有相同细胞培养基的细胞培养小室，在相同的细胞培养板上进行空白对照，测量其电阻值。
      2. 通过从组织等效电阻中减去空白电阻来计算组织电阻，并乘以滤膜的有效表面积（0.6 cm²）2良好的肠道屏障电阻范围为 150 至 400 Ω∙cm2.
        注意：21天后细胞必须完全分化并形成肠道屏障，此时肠模拟物即可用于整合到微生理系统（MPS）中。
  2. 肝脏等效物的制备
    1. 使用肝等效培养基培养 HepaRG 细胞，该培养基为添加了10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、100 单位/毫升青霉素、100 µg/毫升链霉素、5 µg/毫升人胰岛素和 5 x 10-5 M 氢化可的松，并在本文中称为“Williams E S”。每2-3天更换一次HepaRG培养基，持续培养细胞两周，以启动向肝细胞和胆管细胞的分化。
    2. 在最初的两周后，向 HepaRG 培养基中添加 2% DMSO，持续额外两周，以完成细胞分化24,25使用多聚-L-赖氨酸包被的细胞培养瓶，在星状细胞培养基（SteC CM）中培养HHSTeC，每两到三天更换一次培养基。
    3. 移除培养基，用1×DPBS洗涤两次，加入8 mL 0.05%胰蛋白酶/EDTA，以解离在细胞培养瓶（175 cm²）中培养的HepaRG细胞。2）。在37 °C孵育5至10分钟，然后加入至少两倍体积的胰蛋白酶抑制剂以终止反应。对HHSTeC进行相同操作，根据细胞数量较少的情况调整试剂用量，因为这些细胞所需数量较少，可在较小的培养瓶（75 cm²）中维持培养。2).
    4. 两者均以 250 x g 孵育5分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于Williams E S培养基中。进行细胞计数，确保细胞活力高于80%。
    5. 以24:1的比例，在Williams E培养基中将HepaRG细胞与HHSTeC细胞共培养生成肝类球体16. 加入 4.8 x 104 分化的 HepaRG 和 0.2 x 104 使用HHSTeC将每个肝类球体配置为50,000个细胞，体积为80 µL。根据所需的类球体数量调整细胞数量和体积。轻轻混匀。
    6. 使用多通道移液器，将80 µL混合细胞悬液加入每孔具有圆底结构的384孔球状体微孔板的各孔中。
      注意：培养四天后，可形成直径约300 µm的球状体。
    7. 使用宽孔移液吸头将肝类球体转移至超低吸附6孔板中，以便进行所需的“逐个”计数。

2. 在双器官芯片系统中整合肠道和肝脏类器官

  1. 用于吸收实验的肠道2-OC MPS组装
    1. 将500 µL DMEM S加入2-OC的较大腔室，300 µL加入较小腔室。吸除24孔板中每个肠屏障等效模型的基底外侧和顶侧培养基。使用无菌镊子将一个插入式培养小室整合至每个2-OC电路的较大腔室中。在顶侧加入200 µL肠培养基。
      注意：将类器官整合到微生理系统（MPS）时，应避免产生气泡。
    2. 将MPS连接至控制单元，控制单元必须连接至加压空气供应装置。设置参数：压力约为±300 bar，泵送频率为0.3 Hz。在给予测试物质前24小时启动流体流动。次日，进行APAP处理。
  2. 肝脏2-OC MPS组装用于代谢检测
    1. 将650 µL Williams E培养基加入大 compartment，350 µL加入将要接收类球体的小 compartment。在超低吸附6孔板中，使用宽口吸头计数类球体。每个肝等效物由20个类球体组成26将二十个肝等效物通过宽孔径吸头（仅允许类器官转移）加入至2-OC的较小腔室中。
    2. 将MPS连接至控制单元，控制单元必须连接至加压空气供应装置。设置参数：压力约为±300 bar，泵送频率为0.3 Hz。在给予测试物质前24小时启动流体流动。次日进行APAP处理。
  3. 肠道/肝脏 2-OC MPS 装置组装用于吸收与代谢分析
    1. 将两种培养基按1:4的比例混合，即在肠腔侧加入200 µL DMEM S，在基底侧加入800 µL Williams E S。同时将肠和肝等效物整合至2-OC中。
    2. 将MPS连接至控制单元，控制单元必须连接至加压空气供应装置。设置参数：压力约为±300 bar，泵送频率为0.3 Hz。在给予测试物质前24小时启动流体流动。次日进行APAP处理。
      注意：所有实验均需设置三个重复样本，即三个独立的2-OC回路（即1½个2-OC装置）。每个2-OC回路的总体积为1 mL。

3. 对乙酰氨基酚（APAP）的制备

  1. 配制对乙酰氨基酚（APAP）储备液，将APAP溶解于无水乙醇中。在实验当天，用相应的培养基稀释APAP，配制成“口服给药”用12 µM和“静脉注射给药”用2 µM的APAP溶液。
  2. 确保空白对照组和处理组溶液中乙醇的终浓度在两种给药方式下均为0.5%。对于阳性对照（100 mM APAP），乙醇浓度为2%。

4. 测试物质给药与培养基取样

  1. APAP“口服”给药及培养基取样
    1. 吸取2-OC中每个肠屏障等效物的基底外侧和顶侧培养基。将500 µL相应的培养基用移液器加入类器官基底外侧的大腔室，300 µL加入小腔室。
    2. 检查是否存在气泡，并在顶侧加入待测物质进行肠屏障等效物处理，以模拟口服给药。通过在肠培养小室的顶侧加入200 µL浓度为12 µM的APAP溶液，模拟APAP“口服”给药，该侧代表肠腔“管腔侧”（图1B）。将MPS连接至控制单元。
    3. 在以下时间点收集顶侧和基底外侧的全部体积：0 h、5 min、15 min、30 min、1 h、3 h、6 h、12 h和24 h15,27。所有实验均需在静态和动态条件下设三个重复，每个重复的样品分别收集至独立的微量离心管中。使用HPLC/UV分析样品。
      注意：顶侧和基底外侧样品需分别收集。
  2. APAP“静脉注射”给药及培养基取样
    1. 通过将2 µM APAP溶液直接加入肝腔室，模拟“静脉注射”途径。吸除2-OC中的全部培养基。向大腔室中加入650 µL含待测物质的Williams E S培养基，向含有20个类球体的小腔室中加入350 µL相同培养基。在以下时间点收集全部体积：0 h、30 min、1 h、2 h、3 h、6 h、12 h和24 h27,28。
    2. 所有实验均需在静态和动态条件下设三个重复。每个重复的样品分别收集至独立的微量离心管中。使用HPLC/UV分析样品。

5. 仪器与色谱条件

  1. 高效液相色谱（HPLC）分析
    1. 根据表1设置高效液相色谱分析的所有相关参数。
    2. 在真空条件下，使用0.45 µm膜过滤器过滤流动相。使用孔径为0.22 µm的聚偏二氟乙烯（PVDF）注射式过滤器（直径13 mm）过滤样品，并将其储存于样品瓶中。开始检测。
  2. 储备液、校准标准品和质控（QC）样品
    1. 在乙酸铵缓冲液（100 mM，pH 6.8）中配制10 mM的对乙酰氨基酚（APAP）储备液，再用乙酸铵缓冲液（1:1, v/v）稀释的DMEM S和Williams E S细胞培养基进一步稀释，得到浓度范围为0.25至100.00 µM的工作溶液。
    2. 包括一组三份的校准样品，以及四个浓度水平的三份质控样品。通过连续稀释法配制这些标准品。
    3. 绘制APAP峰面积相对于APAP标称标准浓度的校准曲线。确定每条校准曲线的线性回归拟合。通过目视检查、相关系数、日内和日间准确度与精密度值评估不同校准模型的拟合优度。
    4. 将用乙酸铵缓冲液（1:1, v/v）稀释的DMEM S和Williams E S培养基空白样品以六份平行样进样。在用乙酸铵缓冲液（1:1, v/v）稀释的DMEM S和Williams E S培养基中，分别配制三份平行样的质控样品，APAP浓度分别为0.50（定量下限，LOQ）、4.50、45.00和90.00 µM。
    5. 确保质控样品使用与绘制标准曲线所用不同的新配制的储备液。使用质控样品考察日内和日间变异。
  3. 方法学验证程序
    1. 按照先前报道的方法29,30进行生物分析方法学验证。分别在五至六次独立运行中完成色谱分析，涵盖Williams E S和DMEM S细胞培养基。
    2. 确保在用乙酸铵缓冲液（1:1, v/v）稀释的DMEM S或Williams E S细胞培养基中，APAP浓度范围为0.25至100.00 µM的校准点，以APAP峰面积（y轴）对相应的标称浓度（x轴）作图。将这些标准校准曲线的斜率与在乙酸铵缓冲液中制备的校准曲线斜率进行比较。确保所有校准曲线的相关系数至少为0.998。
    3. 在五或六天内，使用替代基质中四个不同浓度水平（LLOQ、低、中、高浓度质控）的重复样品，测定分析物的精密度和准确度（日内和日间）。在同一天内，对含有0.50、4.50、45.00和90.00 µM APAP浓度的用乙酸铵缓冲液（1:1, v/v）稀释的DMEM S或Williams E S细胞培养基进行日内精密度和准确度测定（n = 3）。
    4. 根据最近获得的校准曲线评估每组质控样品中APAP浓度。通过目标化合物与可能由干扰成分引起的其他色谱峰之间的分离程度，测试分析方法的选择性。
  4. 定量下限（LLOQ）与检测限（LOD）
    1. 基于响应值的标准偏差和斜率法确定定量下限（LLOQ）。使用公式10α/S计算，其中α为校准曲线线性回归y轴截距的标准偏差，S为校准曲线直线的斜率29,30。估算检测限（LOD）时，采用空白样品标准偏差的3.3倍除以校准曲线斜率29,30。

6. 组织等效物的活力/功能性

  1. MTT
    1. 采用MTT法检测MPS实验所有时间点的类器官活力。阴性对照使用含溶剂的细胞培养基。阳性对照使用含100 mM APAP和1% NaOH的细胞培养基处理类器官。
    2. 将每个重复组的20个类球体转移至96孔板的单独孔中，并将含有肠类器官的细胞培养插件转移至24孔细胞培养板中，每孔放置一个肠类器官。用1×DPBS对组织类器官洗涤三次。
    3. 每孔加入300 µL用相应细胞培养基稀释的1 mg/mL MTT溶液。在标准细胞培养条件下孵育3小时。
    4. 用移液器小心吸出每孔中的 MTT 溶液。每孔加入 200 µL 异丙醇，在 4 °C 条件下过夜萃取肠和肝等效物中的 MTT 甲臜。
      注意：密封盖子以防止蒸发。
    5. 将每种上清液各200 µL转移至已预先确定的96孔微孔板中的相应孔内。以异丙醇作为空白对照。
    6. 在酶标仪中于570 nm处读取甲臜的吸光度。以阴性对照组为100%细胞活力，根据各时间点的平均光密度值计算细胞还原MTT的相对能力（%）。
  2. 细胞化学/组织学
    1. 在室温下，使用含 4% (w/v) 多聚甲醛的 0.1 M 磷酸盐-生理盐水缓冲液（pH 7.4）固定肠和肝类器官，持续 25 分钟。用 PBS 缓冲液洗涤类器官 5 次，每次 10 分钟。用四甲基罗丹明异硫氰酸酯-鬼笔环肽或 Alexa Fluor 647 鬼笔环肽按 1:50 比例溶于 PBS 中对肠和肝类器官进行染色31.
    2. 将它们转移至OCT冷冻介质中，在室温下平衡数分钟，然后转移至液氮中直至完全冷冻。使用冷冻切片机对肝类球体进行约10–12 µm厚的冷冻切片。
    3. 使用含 DAPI 的封片剂封片，通过共聚焦荧光显微镜观察。
    4. 固定后将类器官冷冻以进行苏木精染色 & 伊红染色，按照既定的实验方案进行。按上述方法切片后，用封片剂封片，并使用光学显微镜采集组织学图像。
  3. 高内涵分析
    1. 细胞的线粒体和细胞核染色
      1. 将冻干粉溶于DMSO中，配制成1 mM的线粒体染色储备液（例如MitoTracker Deep Red FM）。分装后避光保存于-20 °C。将1 mM线粒体染色储备液加入预热（37 °C）的无血清组织培养基中，稀释至终浓度200 nM。
      2. 移除细胞培养基，加入线粒体染色液以完全覆盖样本，在37 °C、5% CO₂的湿润环境中孵育15–45分钟。2.
      3. 小心移除线粒体染色工作液，加入含2-4%多聚甲醛的PBS固定液，在室温下固定15分钟。
      4. 用 PBS 轻柔冲洗固定后的细胞，每次 5 分钟，重复洗涤过程两次。
      5. 通过将100 mg Hoechst 33342染料溶解于10 mL超纯水中，配制10 mg/mL（16.23 M）的核酸染色储备液。
        注意：应将储备液分装后避光保存于 -20 °C。
      6. 在 PBS 中配制 0.2–2.0 µg/mL 的核酸染色工作液，将固定后的细胞与核酸染色工作液在室温下孵育 10 分钟。
      7. 移除核酸染色工作液，用 PBS 轻柔冲洗细胞，每次 5 分钟，共冲洗三次。细胞应置于 PBS 中，于 4 °C 避光保存。
    2. 线粒体与细胞核染色分析
      1. 使用荧光显微镜，选择适用于核酸染料（λEx/λEm：361/497 nm）和线粒体染料（λEx/λEm：665 nm）的滤光片组对细胞进行分析。根据核酸阳性染色定位细胞，并计数细胞数量。定量线粒体内线粒体染料的荧光强度。
  4. 在 ImageJ 中进行形态计量学测量（类球体计算）
    1. 从Columbus软件中将高内涵分析（HCA）图像导出为*.flex文件。使用Bio-Formats插件在ImageJ中将.flex文件以灰度图形式导入32: 文件 > 导入 > Bio-Formats.
    2. 在 导入选项 窗口，选择 超堆栈 查看并启用 拆分通道 在“拆分为单独窗口”下。此选项将允许访问特定通道中的所有文件（例如，DAPI、mitotracker 等）。请勿选择 使用虚拟堆栈 在内存管理下。
      注意：建议使用 DAPI 通道，因为在紫外波长（如 405 nm）下，培养基中的“碎片”在图像中会减少。
    3. 调整像素大小（分析 > 设定比例尺）如果未根据 .flex 文件中的嵌入值加载，则应用一个 高斯模糊 滤波以去除过多的噪声并避免形状轮廓的不规则性。 过程 > 滤光片 > 高斯模糊Sigma（半径）的取值在2.0至3.0之间时，适用于大多数情况。如果图层包含多幅图像，请将其应用于所有图像（选择全部） 是 在 工艺堆叠 窗口
    4. 使用阈值生成二值图像，以区分背景和类器官（目标物体）。点击 图像 > 调节 > 阈值使用红色蒙版根据图像强度调整数值，以匹配类器官的形状，同时保持其形态完整。禁用 暗背景 如果图像具有白色背景。单击 应用.
    5. 在 将图像栈转换为二值图像 窗口，选择 阈值 方法。通常， 默认 或 三角形 在此类图像处理中更为优选。保持 背景 作为 暗选择 为每幅图像计算阈值 如果图像堆栈中有多个图像。
    6. 选择 过程 > 二元的 > 填补孔洞可选择性地去除背景中的孔洞。在 过程 > 二元的 > 选项秒，选择 黑色背景 并执行 填补孔洞 再次。禁用 黑色 在进入下一步之前，请先选择背景选项。
    7. 分离对象。对于类器官，推荐使用分水岭方法。点击 过程 > 二元的 > 分水岭执行形态学分析。
      1. 选择 分析 > 设置测量参数有多种选项可供选择（详情请见 https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html）。对于类器官，选择 面积, 平均灰度值, 分钟 & 最大灰度值 和 形状描述符可选地，选择 显示标签 识别图像中的物体 科学计数法. 点击 好的.
      2. 选择 分析 > 分析颗粒. 选择 大小 和 圆形度 限制。分别保持 0 至无穷大和 0.00 至 1.00，以测量图像中的所有对象。在 显示，选择 大纲 因此，对象将被识别。启用 显示结果 输出结果； 排除边缘区域 排除接触边界的物体； 包含孔洞 因此，物体内部最终形成的孔洞被视为主要形状的一部分。
    8. 重复 形态分析 对于每个图像堆栈，结果将被追加到单个表格中。导出结果表格 文件 > 另存为… 作为逗号分隔值（.csv）文件。
  5. 实时荧光定量 PCR
    1. 使用苯酚与异硫氰酸胍的单相溶液，按照制造商说明书从组织等效物中提取RNA。
    2. 通过1–2 µg总RNA的逆转录反应进行cDNA合成。
    3. 使用基因特异性引物扩增所有目标片段（表5) 进行实时定量 PCR。每次 qRT-PCR 反应包含 30 ng 反转录的 RNA 和每种引物各 100 nM。
    4. 按照PCR反应条件进行：50 °C 3分钟（1个循环）；95 °C 5分钟（1个循环）；95 °C 30秒，59 °C 45秒，72 °C 45秒（35–40个循环）。
  6. CYP 检测
    1. 按照第2.2节进行肝脏2-OC组装。实验分组包括无细胞对照组、2 µM APAP处理12 h组、2 µM APAP处理24 h组以及溶剂对照组。按照第3.3节和第4.2节进行2 µM APAP的配制与处理。
      注意：为了确保所有样本在进行CYP检测时能同时准备就绪，应在开始24小时处理后的12小时，启动12小时处理。CYP活性的无细胞对照组以及溶剂对照组均使用0.5%乙醇溶液处理。
    2. 室温下解冻3 mM发光底物储备液，用William’s E S培养基按1:1000稀释，避光保存。
    3. 收集类球体，将每个实验组转移至96孔板的一个孔中。移除培养基，用100 µL 1x DPBS洗涤两次，每孔加入80 µL 3 µM底物溶液。将无细胞对照组保留在William’s E S培养基中。保留一个不含类球体和底物溶液的孔作为背景对照。在37 °C、5% CO₂条件下孵育30–60分钟2，避光保存。
    4. 用含有酯酶的复溶缓冲液重悬冻干的荧光素检测试剂（LDR），通过轻柔涡旋或颠倒混匀。将适量体积的试剂于室温保存，直至进行下一步操作。
      注意：重悬后的LDR在室温下可保存24小时，或在4 °C下保存1周，活性不会丧失。如需长期保存，请置于–20 °C。
    5. 孵育后，将完整球状体上清液各25 µL转移至白色不透明96孔微孔板中的三个不同孔中。每孔加入25 µL LDR试剂并混匀。
    6. 将白色培养板在室温下孵育20分钟。使用发光仪检测发光信号。请勿使用荧光仪。
    7. 通过从经测试化合物处理组和未处理组（溶剂对照组）的发光值中减去背景发光值（无细胞对照），计算净信号值。将经处理组的净信号值除以未处理组的净信号值，再乘以100，计算CYP3A4活性的百分比变化。
  7. 蛋白质印迹法
    1. 将肝类器官转移至已标记的1.5 mL微量离心管中，弃去培养基，用100 µL 1x DPBS洗涤两次。
    2. 在4 °C下，用100 µL细胞裂解RIPA缓冲液裂解肝类球体，孵育20 min。于4 °C、11000 rpm离心15 min。将上清液转移至另一标记好的1.5 mL微量离心管中。
    3. 采用Bradford法测定蛋白含量。根据定量结果，每孔上样10至50 µg细胞裂解液蛋白，于3-15%梯度聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE。
    4. 将凝胶中的蛋白质通过半干式转膜仪转移至0.22 µm PVDF膜上。使用含50 mM Tris-HCl和192 mM甘氨酸的转膜缓冲液。根据待转膜凝胶数量（每次1至2块）设置仪器参数。
    5. 用含0.1% Tween 20的TBS-T缓冲液（Tris缓冲盐水：50 mM Tris pH 7.6，150 mM氯化钠）配制3–5%脱脂奶粉溶液，封闭PVDF膜上的非特异性结合位点。室温下轻轻振荡孵育1小时。
    6. 在室温下用 TBS-T 轻柔地持续振荡洗涤 3-5 分钟。重复此洗涤步骤两次。
    7. 将白蛋白和vinculin一抗分别用TBS-T按1:1000和1:2000稀释。将膜置于一抗溶液中，4 °C轻轻振荡孵育过夜。
      注意：稀释抗体时，请始终遵循生产商的说明书。
    8. 除去一抗，用TBS-T缓冲液将膜清洗3次（步骤6.7.6）。将ECL抗小鼠IgG二抗用TBS-T缓冲液按1:5000比例稀释，室温下轻轻振荡孵育膜2小时。
    9. 除去二抗，洗涤膜（步骤6.7.6）。使用ECL Western Blotting Substrate进行蛋白检测。将X射线胶片曝光30秒至30分钟。免疫印迹检测重复三次。

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结果

为了在2-OC MPS中进行对乙酰氨基酚（PK APAP）测试，第一步是制备人肠和肝等效物（类器官）。它们将被整合到2-OC微流控装置中（图1A) 在开始PK APAP实验前24小时。第二天更换培养基，使模型暴露于APAP。 图1 展示置于2-OC装置内的肠道和肝脏等效物（图1B) 以及 APAP 药代动力学实验的时间进程（图1C）。我们采用MTT实验、TEER测量、高内涵分析（HCA）、实时PCR、蛋白质印迹、组织学以及共聚焦荧光显微镜技术，在二维培养和三维类器官中评估组织的活性并检测可能的对乙酰氨基酚（APAP）毒性效应。在共聚焦荧光显微镜图像中，经DAPI和鬼笔环肽（Phalloidin）分别染色细胞核和肌动蛋白的肠类器官样本，在未处理组中呈现出连续的屏障结构图2A）以及12 µM APAP处理的样品（

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讨论

准确可靠地评估新药研究中的药理学特性，对于降低后续研发步骤的风险至关重要。微生理系统（MPS）是一项相对较新的技术，旨在提高预测能力，并减少临床前测试所需的成本和时间。我们团队正在推进对先导化合物优化阶段最需要的药代动力学和毒理学特性的评估。我们使用了2-OC微流控装置，该装置具有两个腔室，可实现两个类器官的整合。选择对乙酰氨基酚（APAP）是因为其具有大量高质量的人体数据，主要由肝脏代谢，且具有肝毒性特征。研究方案旨在模拟人体I期临床试验中的某些步骤，即药物经口服给予志愿者后，定期采集血样以测定药物浓度，从而了解其药代动力学特性，同时收集生化和临床参数以评估药物的安全性和耐受性。因此，当MPS发展到足以提供可靠预测时，将显著降低I期临床试验失败的风险。未来若加入疾病模型，这一设想也可能适用于II期和III期临床试验。

所有研究均在三种模型中进行：肠道2-OC（对乙酰氨基酚口服给药）、肝脏2-OC（静脉给药）以及肠道/肝脏2-OC（口服给药）。第一种模型用于分离吸收过程，第二种用于分离代谢过程，第三种则整合了这两个过程。我们首先生成类器官并将其整合至微流控装置中，其次给予对乙酰氨基...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢克里斯蒂·古根-吉卢瓦佐博士、菲利普·格里蓬博士（法国国家健康与医学研究院第522研究组）以及克里斯蒂安·特雷波博士（法国国家健康与医学研究院第271研究组），感谢他们提供生物材料（Hepa RG细胞）并将其提供给我们，以开展学术研究。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1x DPBS赛默飞世尔科技14190235无钙，无镁
2-OCTissUse GmbH双器官芯片
384孔球状体微孔板康宁3830黑色/透明，圆底，超低吸附
4% 甲醛用于固定细胞
对乙酰氨基酚Sigma AldrichA7085用于MPS检测
乙腈Tedia用于进行高效液相色谱（HPLC）
Alexa Fluor 647 鬼笔环肽赛默飞世尔科技共聚焦实验
乙酸铵Sigma Aldrich用于进行高效液相色谱（HPLC）
Caco-2 细胞Sigma Aldrich86010202
卡考得酸盐缓冲液
细胞培养瓶Sarstedt
共聚焦荧光显微镜LeicaDMI6000
冷冻切片机LeicaCM1950
DMEM高糖赛默飞世尔科技12800017添加补充物：10% 胎牛血清、100 单位/毫升青霉素、100 µg/mL 链霉素，以及 1% 非必需氨基酸
DMSOSigma AldrichD4540向 HepaRG 培养基中添加 2%
乙醇合成
胎牛血清赛默飞世尔科技12657029
冷冻介质OCTTissue-TekTissue-Tek® O.C.T.™ 化合物是一种水溶性乙二醇和树脂的混合物，可为冷冻切片机切片在-10℃条件下提供便捷的样本包埋基质°C 及以下。
苏木精 && 伊红
HepaRG 细胞Biopredic InternationalHPR101未分化的细胞
HHSTeCScienCell 研究实验室5300细胞及所有培养补充剂
Hoechst 33342HCA 实验
HT-29 细胞Sigma Aldrich85061109
人胰岛素Invitrogen - 赛默飞世尔科技12585014
氢化可的松Sigma AldrichH0888
异丙醇默克278475
卡诺夫斯基’固定剂
L-谷氨酰胺赛默飞世尔科技A2916801
Luna C18 保护柱 SSPhenomenex用于进行高效液相色谱（HPLC）
显微镜LeicaDMi4000
切片机LeicaRM2245
Millipore 0.4 µm孔径插件默克PIHP01250
Millicell ERS-2 电压电阻测量仪默克MERS00002用于TEER测量
MitoTracker Deep RedHCA 实验
MTT赛默飞世尔科技M6494
MX3000P 系统安捷伦科技
血细胞计数板细胞计数
Operetta 高内涵成像系统Perkin Elmer用于执行高内涵筛选（HCA）
P450-Glo CYP3A4 检测（使用 Luciferin-IPA）Promega货号 V9001
青霉素/链霉素赛默飞世尔科技15070063细胞培养
佩尔蒙特赛默飞世尔科技组织学
引物RT-qPCR
PVDF膜伯乐（BioRad）
PVDF 注射器滤器0.22 μm 孔径
反相Luna C18色谱柱Phenomenex用于进行高效液相色谱（HPLC）
Shaker（IKA VXR Basic Vibrax）IKA Works GmbH & 公司2819000用于类球体以优化MTT实验
星状细胞培养基（STeC CM）ScienCell5301添加STeC CM补充剂
SuperScriptII™ 逆转录酶赛默飞世尔科技
SYBR Green PCR Master Mix赛默飞世尔科技
TRizol TM 试剂赛默飞世尔科技Trizol 是一种苯酚与异硫氰酸胍的单相溶液。
胰蛋白酶/EDTA 溶液赛默飞世尔科技R001100
超低吸附培养板康宁CLS3471-24EA6孔
Vectashield plus DAPI 封片剂
白色不透明96孔微孔板PerkinElmer
宽孔吸头
Williams EPan BiotechP04-29510添加补充物：10% 胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、100 单位/毫升青霉素、100 µg/mL 链霉素和 5 µg/mL 人胰岛素

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MTT Caco 2 HT 29
一种用于药物药代动力学与毒理学评估的肠/肝微生理系统
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