我们将含有肠道和肝脏类器官的微生理系统（MPS）暴露于对乙酰氨基酚（APAP）中。本文介绍了在MPS中进行类器官制备以及APAP药代动力学和毒理学特性评估的方法，同时还描述了验证结果所必需的组织功能分析。
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摘要
摘要
近年来新出现的微生理系统（MPS）通过培养人类类器官，在药物研发的临床前测试阶段有望优于动物模型，因为其具有人类基因背景并能模拟组织间的相互作用。本研究将人肠屏障（由Caco-2和HT-29细胞共培养构建）与肝等效物（由分化后的HepaRG细胞和人肝星状细胞组成的球状体构建）集成于一种双器官芯片（2-OC）微流控装置中，用于评估对乙酰氨基酚（APAP）的部分药代动力学（PK）和毒理学特性。该MPS包含三种构型：仅肠道2-OC、仅肝脏2-OC，以及肠道/肝脏2-OC（两种类器官由相同培养基灌注）。在药代动力学评估中，我们分别通过肠屏障上方给药（模拟口服途径）或直接加入培养基中（模拟静脉注射途径），在预设时间点以12 µM和2 µM的浓度给予APAP。培养基样品采用反相高效液相色谱法（HPLC）进行分析。对类器官进行了基因表达、跨上皮电阻（TEER）值、蛋白质表达与活性分析，并随后收集、固定，进行一系列形态学评估。MTT法在评估类器官活力方面表现良好，但高内涵分析（HCA）能够更早地检测到APAP处理引发的毒性事件。我们证实，培养基流动对APAP吸收无显著影响，但显著提升了肝等效物的功能。该MPS成功模拟了APAP在人体肠道的吸收及其肝脏代谢过程。MPS实验数据与计算机模拟建模相结合，具有巨大潜力，可提高体外方法的预测能力，在药代动力学和毒理学研究中提供比动物模型更高的准确性。
引言
由于基因组和蛋白质组的差异，动物模型在预测多种人类生理结果方面的价值有限。此外，动物实验耗时长、成本高，且存在伦理争议1。微生理系统（MPS）是一项相对较新的技术，旨在提高临床前测试的预测能力，同时降低其成本和耗时。MPS 是一种微流控装置，可在培养基流动条件下培养类器官（即模拟器官功能的人工功能单元），促进类器官之间的相互交流。使用人类细胞构建的类器官可显著提高研究的转化相关性2,3,4。由于 MPS 在遗传上属于人类来源，并能模拟不同组织间的相互作用，其表现预期优于动物实验。当功能完全实现时，MPS 将以更高的速度、更低的成本和风险提供更具意义的研究结果4。目前，许多研究团队正在开发用于多种用途的 MPS，尤其是用于评估药物疗效的疾病模型。
暴露水平是评估药物有效性和毒性的最关键参数之一5,6,7,8,
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方案
1. 用于2-OC培养的组织等效物的制备
- 小肠屏障等效物的制备
- 使用肠上皮等效培养基培养 Caco-2 和 HT-29 细胞：DMEM 添加 10% 胎牛血清、1% 青霉素和链霉素以及 1% 非必需氨基酸，本论文中将该培养基命名为“DMEM S”。
- 移除培养基，用 1× DPBS 洗涤两次，然后加入 8 mL 0.25% 胰蛋白酶/EDTA，以解离在细胞培养瓶（175 cm²）中培养的 Caco-2 细胞2）。在37 °C孵育5分钟，然后加入至少两倍体积的胰蛋白酶抑制剂以终止反应。对HT-29细胞执行相同操作，但需根据细胞数量较少以及培养于较小培养瓶（75 cm²）的情况调整试剂用量。2).
- 以 250 x g 离心 g 孵育5分钟，弃去两管中的上清液，将细胞沉淀重悬于10 mL DMEM S中。进行细胞计数，确保细胞活力高于80%。在24孔板的每个孔基底外侧（代表人体血液侧）预先加入400 µL DMEM S，无菌操作将细胞培养小室整合至该24孔板中。
- 以9:1的比例共培养Caco-2和HT-29细胞21. 使用 2.25 x 105 Caco-2 和 2.5 x 104 将HT-29细胞加入每个肠类器官，终体积为200 µL DMEM S。根据所需类器官数量调整细胞数量和体积。轻柔混匀。<....
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结果
为了在2-OC MPS中进行对乙酰氨基酚（PK APAP）测试，第一步是制备人肠和肝等效物（类器官）。它们将被整合到2-OC微流控装置中（图1A) 在开始PK APAP实验前24小时。第二天更换培养基，使模型暴露于APAP。 图1 展示置于2-OC装置内的肠道和肝脏等效物（图1B) 以及 APAP 药代动力学实验的时间进程（图1C）。我们采用MTT实验、TEER测量、高内涵分析（HCA）、实时PCR、蛋白质印迹、组织学以及共聚焦荧光显微镜技术，在二维培养和三维类器官中评估组织的活性并检测可能的对乙酰氨基酚（APAP）毒性效应。在共聚焦荧光显微镜图像中，经DAPI和鬼笔环肽（Phalloidin）分别染色细胞核和肌动蛋白的肠类器官样本，在未处理组中呈现出连续的屏障结构图2A）以及12 µM APAP处理的样品（
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讨论
准确可靠地评估新药研究中的药理学特性，对于降低后续研发步骤的风险至关重要。微生理系统（MPS）是一项相对较新的技术，旨在提高预测能力，并减少临床前测试所需的成本和时间。我们团队正在推进对先导化合物优化阶段最需要的药代动力学和毒理学特性的评估。我们使用了2-OC微流控装置，该装置具有两个腔室，可实现两个类器官的整合。选择对乙酰氨基酚（APAP）是因为其具有大量高质量的人体数据，主要由肝脏代谢，且具有肝毒性特征。研究方案旨在模拟人体I期临床试验中的某些步骤，即药物经口服给予志愿者后，定期采集血样以测定药物浓度，从而了解其药代动力学特性，同时收集生化和临床参数以评估药物的安全性和耐受性。因此，当MPS发展到足以提供可靠预测时，将显著降低I期临床试验失败的风险。未来若加入疾病模型，这一设想也可能适用于II期和III期临床试验。
所有研究均在三种模型中进行：肠道2-OC（对乙酰氨基酚口服给药）、肝脏2-OC（静脉给药）以及肠道/肝脏2-OC（口服给药）。第一种模型用于分离吸收过程，第二种用于分离代谢过程，第三种则整合了这两个过程。我们首先生成类器官并将其整合至微流控装置中，其次给予对乙酰氨基.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢克里斯蒂·古根-吉卢瓦佐博士、菲利普·格里蓬博士（法国国家健康与医学研究院第522研究组）以及克里斯蒂安·特雷波博士（法国国家健康与医学研究院第271研究组），感谢他们提供生物材料（Hepa RG细胞）并将其提供给我们，以开展学术研究。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1x DPBS | 赛默飞世尔科技 | 14190235 | 无钙，无镁 |
| 2-OC | TissUse GmbH | 双器官芯片 | |
| 384孔球状体微孔板 | 康宁 | 3830 | 黑色/透明，圆底，超低吸附 |
| 4% 甲醛 | 用于固定细胞 | ||
| 对乙酰氨基酚 | Sigma Aldrich | A7085 | 用于MPS检测 |
| 乙腈 | Tedia | 用于进行高效液相色谱（HPLC） | |
| Alexa Fluor 647 鬼笔环肽 | 赛默飞世尔科技 | 共聚焦实验 | |
| 乙酸铵 | Sigma Aldrich | 用于进行高效液相色谱（HPLC） | |
| Caco-2 细胞 | Sigma Aldrich | 86010202 | |
| 卡考得酸盐缓冲液 | |||
| 细胞培养瓶 | Sarstedt | ||
| 共聚焦荧光显微镜 | Leica | DMI6000 | |
| 冷冻切片机 | Leica | CM1950 | |
| DMEM高糖 | 赛默飞世尔科技 | 12800017 | 添加补充物：10% 胎牛血清、100 单位/毫升青霉素、100 µg/mL 链霉素，以及 1% 非必需氨基酸 |
| DMSO | Sigma Aldrich | D4540 | 向 HepaRG 培养基中添加 2% |
| 乙醇 | 合成 | ||
| 胎牛血清 | 赛默飞世尔科技 | 12657029 | |
| 冷冻介质OCT | Tissue-Tek | Tissue-Tek® O.C.T.™ 化合物是一种水溶性乙二醇和树脂的混合物，可为冷冻切片机切片在-10℃条件下提供便捷的样本包埋基质°C 及以下。 | |
| 苏木精 && 伊红 | |||
| HepaRG 细胞 | Biopredic International | HPR101 | 未分化的细胞 |
| HHSTeC | ScienCell 研究实验室 | 5300 | 细胞及所有培养补充剂 |
| Hoechst 33342 | HCA 实验 | ||
| HT-29 细胞 | Sigma Aldrich | 85061109 | |
| 人胰岛素 | Invitrogen - 赛默飞世尔科技 | 12585014 | |
| 氢化可的松 | Sigma Aldrich | H0888 | |
| 异丙醇 | 默克 | 278475 | |
| 卡诺夫斯基’固定剂 | |||
| L-谷氨酰胺 | 赛默飞世尔科技 | A2916801 | |
| Luna C18 保护柱 SS | Phenomenex | 用于进行高效液相色谱（HPLC） | |
| 显微镜 | Leica | DMi4000 | |
| 切片机 | Leica | RM2245 | |
| Millipore 0.4 µm孔径插件 | 默克 | PIHP01250 | |
| Millicell ERS-2 电压电阻测量仪 | 默克 | MERS00002 | 用于TEER测量 |
| MitoTracker Deep Red | HCA 实验 | ||
| MTT | 赛默飞世尔科技 | M6494 | |
| MX3000P 系统 | 安捷伦科技 | ||
| 血细胞计数板 | 细胞计数 | ||
| Operetta 高内涵成像系统 | Perkin Elmer | 用于执行高内涵筛选（HCA） | |
| P450-Glo CYP3A4 检测（使用 Luciferin-IPA） | Promega | 货号 V9001 | |
| 青霉素/链霉素 | 赛默飞世尔科技 | 15070063 | 细胞培养 |
| 佩尔蒙特 | 赛默飞世尔科技 | 组织学 | |
| 引物 | RT-qPCR | ||
| PVDF膜 | 伯乐（BioRad） | ||
| PVDF 注射器滤器 | 0.22 μm 孔径 | ||
| 反相Luna C18色谱柱 | Phenomenex | 用于进行高效液相色谱（HPLC） | |
| Shaker（IKA VXR Basic Vibrax） | IKA Works GmbH & 公司 | 2819000 | 用于类球体以优化MTT实验 |
| 星状细胞培养基（STeC CM） | ScienCell | 5301 | 添加STeC CM补充剂 |
| SuperScriptII™ 逆转录酶 | 赛默飞世尔科技 | ||
| SYBR Green PCR Master Mix | 赛默飞世尔科技 | ||
| TRizol TM 试剂 | 赛默飞世尔科技 | Trizol 是一种苯酚与异硫氰酸胍的单相溶液。 | |
| 胰蛋白酶/EDTA 溶液 | 赛默飞世尔科技 | R001100 | |
| 超低吸附培养板 | 康宁 | CLS3471-24EA | 6孔 |
| Vectashield plus DAPI 封片剂 | |||
| 白色不透明96孔微孔板 | PerkinElmer | ||
| 宽孔吸头 | |||
| Williams E | Pan Biotech | P04-29510 | 添加补充物：10% 胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、100 单位/毫升青霉素、100 µg/mL 链霉素和 5 µg/mL 人胰岛素 |
参考文献
- Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2 (6), 549-561 (2012).
- Hynds, R. E., Giangreco, A.
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重印与许可
