在微流控进化加速器上生成跨越癌细胞群体的异质性药物梯度以实现实时观察

摘要

我们介绍了一种微流控芯片上的癌症模型，即"进化加速器"技术，该技术可在明确定义的环境条件下，在单细胞水平上对癌症动态进行长期、实时、定量的可控研究。该技术有望作为基础研究或临床前药物开发的体外模型。

摘要

传统的细胞培养仍然是最常用的临床前模型，尽管其在预测癌症临床结果方面的能力已被证实存在明显局限。微流控芯片上的癌症模型被提出，旨在弥合过于简化的传统二维培养与更为复杂的动物模型之间的差距，后者在产生可靠且可重复的定量结果方面能力有限。本文介绍一种微流控芯片上的癌症模型，该模型能够全面地重现复杂肿瘤微环境的关键组分，同时结构足够简单，可对癌症动态提供稳健的定量描述。这种微流控芯片上的癌症模型——"进化加速器"——将大量癌细胞群体分解为相互连接的肿瘤微环境阵列，同时生成异质性的化疗药物压力分布。通过该系统，可在数周内实时监测癌症在药物浓度梯度作用下的进展及进化动态，并可在实验过程中结合延时成像，开展多种下游实验。

引言

癌症 increasingly 被认为是一个复杂的生态系统，其不仅依赖于突变细胞群体的持续失调，还依赖于癌细胞与宿主微环境之间的关键相互作用。从这一角度来看，癌症的演化发生在一个由多种因素构成的适应性景观中，包括异质性的肿瘤微环境以及与多种宿主细胞的交互对话，这些因素共同施加选择压力，促使进一步的遗传或表观遗传改变^1,2,3。在实体瘤的背景下，化疗药物及其他资源梯度的不均匀分布导致了其分子异质性，并可能在耐药性的产生、特定肿瘤亚群的血管生成增强乃至转移过程中发挥重要作用^4,5,6。传统的体外二维细胞培养研究虽然具备大规模、操作便捷的实验能力，但所提供的均一、静态和均场条件往往缺乏精确的空间与时间环境控制，难以真实模拟体内肿瘤的动态行为。因此，在药物研发流程中，需要在动物模型之前建立更具代表性的离体模型，以更准确地预测癌症的进展以及在动态应激环境下对药物的反应。微流控技术被认为有望弥合二维细胞培养研究与更复杂的体内动物研究之间的鸿沟，后者可能难以支持可控的定量研究^7,

方案

1. 微流控装置的制备

1. 使用版图设计软件生成所需的微流控图案（参见补充材料）。
2. 制备光掩模。详见材料表。
   1. 使用激光直写仪，将图案写入涂有100 nm铬层和500 nm光刻胶AZ1518的钠钙玻璃片上。
   2. 用显影液AZ300MIF显影光刻胶60秒。
   3. 使用Cr-7铬蚀刻剂去除未被光刻胶保护的铬层。
   4. 在70 °C条件下，使用去胶剂去除残留光刻胶，处理45分钟。
3. 光刻胶图案化。详见材料表。
   1. 在硅片上以4000 rpm转速旋涂HMDS，持续40秒。
   2. 在硅片上以4000 rpm转速旋涂光刻胶AZ4330，持续40秒。
   3. 在95 °C条件下对硅片进行前烘60秒。
   4. 使用掩模对准仪对硅片进行紫外光曝光。
   5. 用显影液AZ300MIF显影光刻胶4分钟。
4. 进行DRIE刻蚀。详见材料表。
   1. 使用硅深反应离子刻蚀（DRIE）系统对带有光刻胶图案的硅片进行干法刻蚀，深度为100 µm。
   2. 用丙酮去除光刻胶，并使用等离子刻蚀机进行等离子清洗。
   <....

结果

芯片上细胞最佳生长的验证
实验平台的主要目标是以全面但足够简洁的方式重现复杂肿瘤微环境中关键的组分与相互作用，从而提供定量、可靠且可重复的数据。只有在我们能够完全控制物理和生物化学环境因素的情况下，才能实现这一目标。我们必须排除不需要的因素，或找到将不可控因素纳入定量模型的方法，以正确解读群体行为。

第一个测试是确保细胞在装置上的最佳生长状态。该装置上的细胞增殖速率必须与传统细胞培养中的生长特征相同或相近。作为原理验证，将人前列腺癌细胞系PC3细胞在无外界应力条件下培养于PDMS芯片中。这些细胞的细胞质经荧光标记，以便通过倒置荧光显微镜观察并定量细胞数量。细胞汇合度（定义为细胞覆盖的面积）通过Fiji¹⁵软件对荧光图像设定特定荧光强度阈值后，在不同时间点对每个微环境区域进行测量。各选定位置的细胞生长曲线如图4

讨论

传统的细胞培养技术发展于近一个世纪前，尽管其在癌症研究中预测临床结果的能力已被证实存在局限性，但至今仍是生物医学研究中最常用的临床前模型。¹⁷动物模型在生理相关性和遗传相似性方面与人类最为接近，但长期以来人们也认识到其在预测人类结果方面存在显著局限性¹⁸在所有现有的临床前模型中，基于微流控技术的器官芯片癌症模型似乎是满足癌症研究未竟需求的最有前景的候选者^9,19,20然而，目前的芯片上癌症模型尚未提供一个能够全面模拟肿瘤微环境关键组分和相互作用，同时又足够简单以获得可靠且可重复的定量数据的平台。我们的代表性数据表明，我们开发的微流控细胞培养技术可为异质性微环境中长期细胞培养提供稳定的物理和生化条件­环境。该多功能平台可对时间进行精密调节­依赖性化学梯度以及环境气体成分。该平台具有便携性，并可与大多数荧光倒置显微镜兼容，用于高­高.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 mL BD Luer-Lok 尖端注射器	BD	14-823-16E
抗生素-抗真菌素	Sigma-Aldrich	A5955	1x 抗生素-抗真菌素混合液
AZ 300 MIF	Merck KGaA	18441123163	光刻胶显影液
AZ1518	Merck KGaA	AZ1518	光刻胶
AZ4330	Merck KGaA	AZ4330	光刻胶
Cr 铬蚀刻剂	Sigma-Aldrich	651826
胎牛血清（FBS）	Life Technologies Corporation	10437028
Heidelberg DWL 66+ 激光直写系统	Heidelberg Instruments	DWL66+	用于制作光掩模
六甲基二硅氮烷（HMDS）	Sigma-Aldrich	379212	用于增强光刻胶附着力
空心不锈钢针	New England Small Tube	NE-1300-01	.025 外径，.017 内径，长 .500 / 304 型，全硬态
ibidi 多孔板加热系统，K-Frame	ibidi	10929	载物台培养箱
Luer-Lok 23 G 分液针头	McMaster-Carr	75165A684	用于连接注射器与管路
Lumox 35 培养皿	Sarstedt	94.6077.331	透气性细胞培养皿
Microposit 去除剂 1165	Dow Electronic Materials	Microposit Remover 1165	光刻胶剥离剂
Microseal B 粘合密封膜	Bio-Rad Laboratories	MSB1001	粘合密封剂
O 型圈（用于 Lumox 培养板密封）	McMaster-Carr	9452K114	编号 27；内径 1-5/16"，外径 1-7/16"；硬度 Duro 70
O 型圈（用于底部玻璃窗密封）	McMaster-Carr	9452K74	编号 20；内径 7/8"，外径 1"；硬度 Duro 70
Plasma-Preen 等离子清洗/刻蚀系统	Plasmatic Systems, Inc	Plasma-Preen	氧气等离子体系统
RPMI 1640 培养基	Life Technologies Corporation	11875-093
Samco RIE800iPB 深反应离子刻蚀系统	Samco	RIE800iPB	深反应离子刻蚀系统
Suss MA6 掩模对准器	SUSS MicroTec	MA6	掩模对准器
Sylgard 184 硅橡胶弹性体	Fisher Scientific	NC9285739	PDMS 弹性体
TePla M4L 等离子刻蚀机	PVA TePla	M4L	等离子刻蚀机
三氯-1H,1H,2H,2H-全氟辛基硅烷（PFOTS）	Sigma-Aldrich	448931	用于硅片硅烷化处理
Tygon 微孔管（0.020" × 0.060" 外径）	Cole-Parmer	EW-06419-01	用于培养基输送的管路