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利用siRNA电穿孔技术调控单纯疱疹病毒1型感染的单核细胞来源树突状细胞中的自噬

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DOI：

10.3791/60190

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2019年10月28日

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1Department of Immune Modulation, Universitätsklinikum Erlangen

本文内容

摘要

本研究中，我们介绍了基于抑制剂和小干扰RNA的策略，用于干扰单纯疱疹病毒1型（HSV-1）感染的单核细胞来源树突状细胞中的自噬流。

摘要

单纯疱疹病毒1型（HSV-1）可在未成熟树突状细胞（iDCs）和成熟树突状细胞（mDCs）中均诱导自噬，但自噬流仅在iDCs中被观察到。为了获得机制上的深入理解，我们开发了高效的策略以干扰HSV-1诱导的自噬降解过程。基于抑制剂的策略是调控HSV-1诱导自噬的首选方法，因其操作简便且快速。为避免此类化合物可能产生的非特异性脱靶效应，我们开发了一种基于siRNA的替代策略，用于调控HSV-1感染后iDCs中的自噬降解。事实上，在HSV-1感染前通过电穿孔将靶向FIP200的siRNA导入iDCs，是一种非常特异且有效的方法，可完全消除FIP200蛋白的表达，从而抑制自噬流。上述两种方法均可高效抑制HSV-1在iDCs中诱导的自噬降解，其中基于siRNA的技术具有更高的靶向特异性。此外，我们还开发了另一种基于siRNA的方法，可选择性沉默KIF1B和KIF2A蛋白的表达，从而促进mDCs中HSV-1感染后的自噬降解。综上所述，siRNA电穿孔技术是一种极具前景的策略，可用于选择性敲低特定蛋白的表达，并分析其在HSV-1感染过程中的作用。

引言

人单核细胞来源的树突状细胞（DCs）的制备是一种合适的体外模型，可用于研究这种重要免疫细胞类型的生物学功能。近年来，单核细胞的分离及其向树突状细胞的分化技术已较为成熟1,2。利用α-疱疹病毒单纯疱疹病毒1型（HSV-1）感染DCs，可作为研究HSV-1对DC生物学功能调控作用的模型系统2,3,4,5,6。这对于阐明疱疹病毒如何抑制或削弱宿主强大的抗病毒免疫应答，从而在宿主免疫豁免部位建立潜伏感染具有重要意义7,8。在这方面，疱疹病毒是极为成功的病原体，在人群中广泛传播，根据地理区域的不同，血清流行率可高达90 %9。为了理解甚至可能阻止这一过程，需要进一步深入了解HSV-1对宿主免疫系统、特别是对树突状细胞等免疫细胞的调控机制。

Turan 等人最近发表了一项关于树突状细胞（DCs）与 HSV-1 相互作用的全新发现10。作者证明，HSV-1 的复制完成严格依赖于 DCs 的成熟状态。在未成熟 DCs（iDCs）中，HSV-1 的完整复制由自噬依赖性机制促进。尽管 HSV-1 在 iDCs 和成熟 DCs（mDCs）中均可诱导自噬，但自噬流仅在 iDCs 中被观察到。这进而通过自噬介导的核纤层蛋白降解，促进病毒衣壳在 iDCs 中的核输出。为了深入理解 HSV-1 在 iDCs 与 mDCs 中诱导的这一降解通路的分子机制，开发新的、高效的研究策略以检测自噬流至关重要。

巨自噬（自噬）是一种高度保守的多步骤过程，可将细胞内蛋白质或完整细胞器靶向输送至溶酶体进行降解11。简而言之，自噬可分为以下阶段：(i) 起始、(ii) 膜成核、(iii) 囊泡扩张以及 (iv) 自噬溶酶体融合阶段12。在起始阶段 (i)，诸如包含200 kD黏着斑激酶家族相互作用蛋白（FIP200）的活化ULK1/2激酶复合物等组分，对于激活beclin-1-Vps34-AMBRA1复合物至关重要。随后，在膜成核阶段 (ii) 启动吞噬泡的形成13，该结构可包裹由p62等分子标记的胞质货物14。在囊泡扩张与自噬体成熟阶段 (iii)，微管相关蛋白轻链3（LC3-I）被转化为其脂化形式LC3-II，并插入自噬体膜中。因此，LC3-I向LC3-II的转化速率可反映成熟自噬体的形成，是衡量自噬诱导的指标15,16。在自噬体与溶酶体融合后 (iv)，不仅自噬货物，连同相关的p62和LC3-II蛋白也会被降解（例如通过水解作用）。因此，p62和LC3-II的减少可作为自噬流的标志物17。自噬体与溶酶体的融合，以及随之而来的自噬周转，高度依赖于细胞内溶酶体的定位。这一过程部分由驱动蛋白家族成员KIF1B和KIF2A调控，研究表明它们对自噬体-溶酶体融合具有负向调节作用18。有趣的是，KIF1B和KIF2A的蛋白表达在树突状细胞（DC）成熟过程中被诱导上调，从而导致HSV-1感染的成熟树突状细胞（mDCs）中自噬流效率低下，进而抑制HSV-1的完整复制10。

调节自噬的实验尝试包括使用已知可诱导或抑制该特定通路的化合物19,20,21在本研究中，我们描述了两种基于抑制剂的策略，用于阻断HSV-1感染的iDCs中的自噬降解过程。我们在实验中使用的第一个化合物是特异性且高效的自噬抑制剂-1（spautin-1），该化合物被报道可在自噬起始阶段促进beclin-1-Vps34-AMBRA1复合物的降解。22本研究中使用的第二种化合物是巴佛洛霉素-A1（BA1），一种V-ATPase抑制剂，可阻断晚期自噬事件（即., 自噬小体-溶酶体融合以及自噬溶酶体的酸化23,24使用这两种抑制剂中的任意一种在HSV-1感染iDC之前处理，均可强烈抑制自噬，但不会干扰病毒基因的有效表达。因此，在HSV-1感染前采用这种基于抑制剂的策略，为抑制HSV-1诱导的自噬流提供了一种强有力的工具，且该方法可轻松拓展应用于多种不同细胞类型和同样可能诱导自噬的其他病毒。

为克服基于抑制剂的方法的一个主要缺点（即., 非特异性脱靶效应），我们开发了一种基于siRNA的方法，用于阻断（HSV-1感染的）iDCs中的自噬流。siRNA电穿孔技术提供了一种强有力的替代策略，可通过选择性敲低特定蛋白（即自噬相关组分）的表达实现功能抑制。在我们的实验中，iDCs使用电穿孔仪I转染FIP200特异性siRNA（参见 材料表）以及 Gerer 等人（2017）和 Prechtel 等人（2007）描述的改进方案，以在自噬起始阶段抑制自噬25,26该技术使我们能够特异性敲低iDCs中的FIP200表达，且在电穿孔后两天内不影响细胞活力及其未成熟表型。值得注意的是，电穿孔后的iDCs仍可有效建立HSV-1感染，表现为病毒蛋白的高效表达。这种基于siRNA的技术具有独特优势，即可特异性靶向多种不同的自噬相关组分（甚至联合靶向），以实现其表达的消除。

本研究进一步描述了一种基于siRNA的方法，可在HSV-1感染的成熟树突状细胞（mDCs）中诱导自噬流。在此方法中，未成熟树突状细胞（iDCs）在通过电穿孔仪II（见材料表）诱导其成熟之前，先经靶向KIF1B和KIF2A的siRNA进行电穿孔转染。由于这两种蛋白在树突状细胞成熟过程中表达上调，且已知可负向调控自噬体与溶酶体的融合10,18，因此在HSV-1感染后，敲低这些蛋白可显著诱导mDCs中的自噬流。因此，该基于siRNA的技术使我们能够通过干扰mDCs中KIF蛋白的表达，特异性地诱导自噬周转，从而模拟其在iDCs中的表达水平。

总之，我们提出了两种不同的方法来抑制 HSV-1 感染的 iDCs 中的自噬流。第一种基于抑制剂的方法操作简便、成本低且速度快，可有效干扰自噬降解过程；而第二种基于 siRNA 的技术更具特异性，是支持和验证抑制剂实验结果的非常合适的方法。此外，我们还描述了一种通过 siRNA 介导敲低两种 KIF 蛋白来在 HSV-1 感染的 mDCs 中诱导自噬流的方法。

方案

单核细胞来源的树突状细胞（DC）由健康供体的白细胞分离产品制备。本研究已获得当地伦理委员会的批准（批准编号 4556）。本研究中的实验均遵循埃尔朗根-纽伦堡弗里德里希-亚历山大大学（"Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg）伦理委员会的建议（批准编号 4556）。所有供体均签署了书面知情同意书，同意书内容符合《赫尔辛基宣言》的要求。

1. 不成熟树突状细胞（iDCs）和成熟树突状细胞（mDCs）的制备与处理

  1. 按照先前所述方法，从白细胞减少系统腔室（LRSCs）中分离人外周血单个核细胞（PBMCs）27。避免对PBMCs进行冷冻保存，应在分离后直接使用，以获得更高的树突状细胞（DC）产量。
  2. 如先前所述10,27，在T175细胞培养瓶中利用不同健康供体的PBMCs生成人树突状细胞（DCs）。简言之，每个细胞培养瓶中加入3.5–4亿个PBMCs，置于30 mL DC培养基（RPMI 1640不含L-谷氨酰胺，1% (v/v) AB血清，100 U/mL青霉素，100 mg/mL链霉素，0.4 mM L-谷氨酰胺，10 mM HEPES）中，通过贴壁法分离单核细胞。1小时后，用RPMI 1640洗去非贴壁细胞组分。加入新鲜DC培养基，并补充800 U/mL GM-CSF和250 U/mL IL-4，培养3天。
    1. 贴壁后第3天，每瓶加入5 mL新鲜DC培养基，其中含GM-CSF和IL-4，终浓度分别为400 U/mL和250 U/mL，用于DC的分化。
    2. 在贴壁后第4天，轻轻冲洗细胞培养瓶底部松散贴壁的未成熟树突状细胞（iDCs），以收获iDCs。重复此步骤2次。为生成成熟树突状细胞（mDCs），加入成熟诱导混合液，其成分为：GM-CSF（终浓度：40 U/mL），IL-4（终浓度：250 U/mL），IL-6（终浓度：1000 U/mL），IL-1β（终浓度：200 U/mL），TNF-α（终浓度：10 ng/mL），前列腺素E2（PGE2；终浓度：1 μg/mL）。
    3. 贴壁后第6天（即使用细胞因子混合液诱导成熟后的第2天），冲洗细胞培养瓶底部的mDCs。重复此步骤两次。
      注：未成熟和成熟DCs可从同一供体在同一个细胞培养瓶中依次生成。具体操作为：(i) 分离出所需数量的iDCs；(ii) 使用步骤1.2.2中列出的细胞因子混合液诱导瓶中剩余细胞成熟。
  3. 将iDCs或mDCs连同相应的细胞培养基转移至50 mL离心管中。在300 × g条件下离心5分钟，收集细胞。
    1. 每个细胞培养瓶用5–10 mL RPMI 1640轻柔重悬（即洗涤）DCs，并将相应的DC悬液合并至同一管中。
    2. 使用细胞计数板或其他方法确定细胞数量。处理iDCs时应避免温度变化，以降低表型改变的风险。

2. 通过流式细胞术分析监测表型成熟状态

  1. 将步骤 1.3.1 中的 iDCs 或 mDCs（0.5 × 106）转移至 1.5 mL 离心管中。在 3390 × g 条件下离心 1.5 分钟收集细胞。用 FACS 缓冲液（含 2% 胎牛血清（FCS）的 PBS）洗涤细胞一次。
  2. 将细胞重悬于 100 µL 抗体染色液（FACS 缓冲液）中，该溶液含有针对特定表面分子的荧光染料标记抗体。
    1. 使用以下抗体验证细胞纯度（CD3-FITC、CD14-PE）以及 DCs 的成熟状态（CD80-PacBlue/-PE-Cy5、CD11c-PE-Cy5、CCR7-PE-Cy7、CD83-APC、CD86-PE、MHCII-APC-Cy7）。
    2. 在 100 µL FACS 缓冲液中准备一份未染色样本作为对照。
    3. 将细胞在冰上避光孵育 30 分钟进行染色。
  3. 随后用 1 mL FACS 缓冲液洗涤细胞两次，每次在 3390 × g 条件下离心 1.5 分钟。
  4. 最后，将细胞重悬于 200 µL 含 2% 多聚甲醛（PFA）的 FACS 缓冲液中，并通过流式细胞术分析细胞。固定后的细胞可在 4°C 避光保存最多 2 天。

3. 树突状细胞感染单纯疱疹病毒1型（HSV-1）及通过spautin-1或bafilomycin-A1干扰HSV-1诱导的自噬流

注意：本研究中使用的 HSV-1/17+/CMV-EGFP/UL43（HSV-1 EGFP）毒株源自实验室毒株 HSV-1 17+。HSV-1 EGFP 毒株在 CMV 启动子调控下，于 UL43 基因位点插入了增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因，从而表达 EGFP。EGFP 可作为 HSV-1 感染的标记物。此外，树突状细胞（DC）感染研究中使用了 HSV1-RFPVP26 毒株（先前在 Turan 等人，2019 年中已有描述）。该病毒表达与单体红色荧光蛋白（mRFP）融合的衣壳表面蛋白 VP26。

  1. 将步骤1.3中的iDCs或mDCs（2 × 106）转移至2 mL离心管中。随后在3390 × g条件下离心1.5分钟，并弃去上清液。
  2. 用感染培养基（含20 mM HEPES的RPMI 1640）轻轻重悬细胞。
    1. 为抑制自噬溶酶体降解通路，在感染前1小时用spautin-1或bafilomycin-A1预处理树突状细胞。向感染培养基中加入10 µM spautin-1或1 µM BA1，或加入DMSO作为未处理对照。将细胞置于37 °C、300 rpm振荡的恒温金属浴中孵育1小时。
    2. 进行感染实验时，以感染复数（MOI）为2的HSV-1病毒颗粒接种细胞。以相应体积的MNT缓冲液（30 mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）、100 mM NaCl、20 mM Tris）作为模拟感染对照。将细胞置于37 °C、300 rpm振荡的恒温金属浴中孵育1小时。
  3. 感染后1小时（hpi），在3390 × g条件下离心1.5分钟收集细胞。吸除接种液，用含有40 U/mL GM-CSF、250 U/mL IL-4以及10 µM spautin-1、1 µM BA1或DMSO（对照）的DC培养基轻轻重悬细胞。将模拟处理和HSV-1感染的细胞以终浓度1 × 106/mL接种至6孔板中。
  4. 在感染后16–24小时（hpi），通过冲洗（mDCs）或使用细胞刮刀（iDCs）收集细胞。将细胞转移至1.5 mL防脱管中。
    1. 在3390 × g条件下离心1.5分钟收集细胞，加入1 mL PBS洗涤沉淀一次。
    2. 在裂解液中剧烈重悬细胞，裂解液包含29 µL 2× Roti-Load、1 µL 100 mM MgCl2和12.5 U/mL benzonase。
    3. 为实现细胞裂解及DNA消化，将样品在37 °C孵育10分钟。随后在95 °C变性蛋白质10分钟。
    4. 进行SDS-PAGE和Western blot分析，检测LC3BI/II、p62、ICP0/5和GAPDH的蛋白水平。

4. 通过电穿孔将 FIP200-siRNA 转入未成熟树突状细胞以干扰 HSV-1 诱导的自噬流

注意：本实验中siRNA电穿孔方案经Prechtel等（2007年）和Gerer等（2017年）文献修改而来。

  1. 在贴壁后第3.5天，将iDCs（12 × 106）转移至50 mL离心管中。随后在300 × g条件下离心5分钟，并弃去上清液。同时，按照步骤2所述进行流式细胞术分析以监测细胞成熟状态（使用Life/Dead violet染料替代CD80-PacBlue）。
  2. 用5 mL不含酚红的OptiMEM轻柔洗涤iDCs，并在300 × g条件下离心5分钟。弃去上清液后，将iDCs轻柔重悬于200 µL不含酚红的OptiMEM中，调整细胞浓度至6 × 106/100 µL。切勿将细胞置于冰上，避免温度变化。操作应迅速进行，避免iDCs在不含酚红的OptiMEM中长时间孵育。
  3. 将75 pmol FIP200特异性siRNA或作为对照的75 pmol随机序列siRNA加入4 mm电穿孔杯中，随后加入100 µL细胞悬液（含6×106个细胞）。 立即使用电穿孔仪I进行电穿孔，设置参数为：500 V，持续1 ms。
    1. 实验前按照制造商说明配制siRNA悬液，分装后储存于-20 °C。使用时冰上解冻并保持低温。在对样品进行电穿孔前，需先进行测试脉冲。
  4. 电穿孔后，立即将iDCs转移至6孔板中，加入新鲜预热的DC培养基（含40 U/mL GM-CSF和250 U/mL IL-4）。将细胞接种至终浓度为1 × 106/mL，并放入培养箱中。切勿用水冲洗电穿孔杯中的细胞。
  5. 48小时后，首先在显微镜下观察电穿孔后iDCs的形态。然后使用细胞刮刀收集细胞并转移至15 mL离心管中。用含0.01% EDTA的1 mL PBS冲洗培养孔，并将冲洗液转移至相应离心管中。
  6. 随后，按照以下步骤将每种siRNA处理条件下的6 × 106个iDCs进行分组。
    1. 取0.5 × 106个细胞，按照步骤2所述评估细胞成熟状态和细胞活力。使用以下抗体：CD11c-PE-Cy5、CCR7-PE-Cy7、CD83-APC、MHCII-APC-Cy7以及Life/Dead violet。
    2. 取1 × 106个细胞用于Western blot分析，以验证FIP200特异性敲低效率。通过在3390 × g条件下离心1.5分钟，将细胞转移并收集至1.5 mL安全锁离心管中。按照步骤3.4所述制备细胞裂解液，并进行Western blot分析。
    3. 将剩余细胞（4.5 × 106）用于HSV-1感染实验。针对每种实验条件，将2.25 × 106个iDCs转移至2 mL离心管中，分别以MOI为2的HSV-1进行感染，或加入MNT缓冲液作为模拟对照。感染操作按照步骤3.3所述进行。
    4. 感染后20小时（20 hpi），使用细胞刮刀收集细胞，并按照步骤3.4所述制备细胞裂解液用于Western blot分析。

5. 利用KIF1B/2A-siRNA电穿孔技术调控HSV-1感染的mDCs中自噬小体-溶酶体通路

  1. 在贴壁后第4天，将24 × 106个iDC转移至50 mL离心管中。随后在300 × g条件下离心5分钟，并弃去上清液。
  2. 用8 mL PBS轻柔重悬（即洗涤）iDC，调整最终细胞浓度为3 × 106/mL。将3 × 106个细胞转移至1.5 mL离心管中，在3390 × g条件下离心1.5分钟以收集细胞。
  3. 将iDC重悬于100 µL含有补充剂混合物的P3缓冲液中（按照生产商说明书操作；电穿孔试剂盒装置II），并分别加入：(i) 75 pmol KIF1B特异性siRNA，(ii) 75 pmol KIF2A特异性siRNA，或(iii) 两者同时加入。使用(iv)等量的乱序siRNA作为对照。每种siRNA条件准备两个离心管（共6 × 106个细胞），并将悬液分别转移至独立的电穿孔杯中。使用电穿孔装置II直接对iDC施加"EH-100"脉冲。
    1. 实验前按照生产商说明书配制siRNA悬液，分装后于-20 °C保存。使用时冰上解冻并保持低温。切勿将iDC置于冰上，避免温度变化。操作应迅速，避免iDC在PBS或P3缓冲液中长时间孵育。
  4. 电穿孔后立即向电穿孔杯中加入500 µL预热的RPMI 1640培养基。将细胞在培养箱中孵育5–10分钟。将iDC转移至6孔板中，加入新鲜预热的DC培养基（含40 U/mL GM-CSF和250 U/mL IL-4）。将相同处理条件的细胞合并至同一孔中，以最终浓度1·106/mL接种，并放入培养箱中培养。
  5. 孵育4小时后，加入含有步骤1.2.2中所列细胞因子的成熟诱导混合液。
    注意：在电穿孔后第2天，准备一份未进行电穿孔的DC样本（1 × 106个细胞）作为对照，用于流式细胞术分析。对照组细胞的处理方式应与电穿孔样本一致。
  6. 电穿孔后第2天，通过吹打重悬收集细胞并转移至15 mL离心管中。用1 mL PBS冲洗各孔，将冲洗液转移至相应离心管中。按以下步骤将每种siRNA条件下的6·106个DC进行分组：
    1. 取0.25 × 106个DC（电穿孔与未电穿孔）用于检测成熟状态和细胞活力，方法见步骤2。使用以下抗体：CD80-PE-Cy5、CD83-APC、CD86-PE、MHCII-APC-Cy7和Life/Dead violet。
    2. 取0.75 × 106个细胞用于Western blot分析，以评估KIF1B/2A特异性敲低效率。在3390 × g条件下离心1.5分钟，将细胞收集至1.5 mL安全锁离心管中。按照步骤3.4所述方法制备细胞裂解液，并进行Western blot分析。
    3. 取每种siRNA条件下剩余的细胞（5 × 106个）进行HSV-1感染实验。每种实验条件将2.5 × 106个iDC转移至2 mL离心管中，分别以MOI为2的HSV-1感染，或加入MNT缓冲液作为模拟对照。感染操作参照步骤3.3进行。
    4. 感染后20小时，通过吹打重悬收集细胞，并按照上述步骤3.4所述方法制备细胞裂解液，进行Western blot分析，以验证HSV-1诱导的自噬周转是否被激活。

结果

在本论文中，我们描述了干扰树突状细胞中 HSV-1 诱导自噬的方法。该方法包括人单核细胞来源的不成熟树突状细胞（iDCs）和成熟树突状细胞（mDCs）的制备，并通过流式细胞术对表型进行分析（图1）。贴壁后第4天，树突状细胞呈现未成熟表型，其特征为 CD80、CCR7 和 CD83 表达较弱，CD11c 表达较高，MHCII 表达处于中等水平。由于 CD3 和 CD14 信号缺失，可排除T细胞和单核细胞污染。贴壁后第6天（即诱导成熟后第2天），树突状细胞呈现成熟表型，表现为 CD80、CCR7、CD83 和 MHC-II 表面表达显著升高。使用表达 eGFP 的 HSV-1 毒株感染（图2）可实现对 iDCs（图2A 上图）或 mDCs（图2A 下图，图2B）几乎完全的感染，这通过荧光显微镜和流式细胞术检测到的强GFP信号得以证实。

正如我们最近的报告所示，HSV-1 可在未成熟树突状细胞（iDCs）和成熟树突状细胞（mDCs）中均诱导自噬，但自噬体的降解仅发生在 iDCs 中10。在初步实验中，我们使用 spautin-1（图 3A）处理 iDCs 和 mDCs 以阻断自噬起始，或使用巴佛洛霉素 A1（BA1；图 3B）以抑制自噬体与溶酶体的最终融合。在未使用 spautin-1 和 BA1 的情况下，HSV-1 感染 iDCs 后，自噬流通过 p62 和 LC3B 表达水平的下降得以体现。相比之下，在未使用 spautin-1 的情况下，HSV-1 感染 mDCs 对 p62 表达无明显影响，而 spautin-1 和 BA1 处理则导致 LC3B-II 的积累。这反映了 mDCs 中自噬的启动，但自噬体降解过程受阻。在 iDCs 中，使用 spautin-1 预处理可显著恢复 HSV-1 感染后 p62 的自噬性降解，这是由于在自噬起始阶段抑制了自噬过程。经 BA1 预处理后，模拟感染（mock）和 HSV-1 感染的 iDCs 均表现出 LC3B-II 蛋白水平的显著积累，表明通过阻断晚期自噬体-溶酶体融合成功抑制了自噬体降解。与此一致的是，mDCs 经 spautin-1 和 BA1 预处理后，p62 蛋白水平保持稳定，同时 LC3B-II 蛋白水平升高。

在第二种抑制自噬流的方法中，通过电穿孔将靶向 FIP200 的 siRNA 导入细胞，检测其在 HSV-1 感染的不成熟树突状细胞（iDCs）中阻断自噬流的能力。如图 4A所示，与对照 siRNA 组相比，电穿孔后 48 小时的 iDCs 中 FIP200 蛋白水平显著降低。在此时间点，iDCs 未表现出任何细胞死亡的迹象（图 4B），并保持其未成熟表型（图 4C）。在 FIP200 沉默的 iDCs 中感染 HSV-1 后，与对照 siRNA 处理的细胞相比，自噬流显著减少（图 4D）。同时，在 HSV-1 感染的 iDCs 中沉默 FIP200 会导致 LC3B 和 p62 蛋白水平升高。

作为反向验证，我们研究了通过siRNA介导的KIF1B和KIF2A蛋白表达敲低是否能够在HSV-1感染的mDCs中实现自噬小体-溶酶体的降解更新。因此，使用靶向其中一种或两种蛋白的特异性siRNA对iDCs进行电穿孔转染，随后诱导细胞成熟（图5）。电穿孔后2天，当使用特异性siRNA时，mDCs中KIF1B和/或KIF2A的蛋白表达显著降低（图5A）。该方法既未引起明显的细胞死亡（图5B），也未改变其表型成熟状态（图5C）。支持KIF1B和KIF2A在自噬小体-溶酶体降解过程中的重要作用的是，在HSV-1感染前敲低这两种蛋白可促进mDCs中自噬流的增强。这一点体现在p62蛋白残留水平较相应对照组明显降低（图5D）。

流式细胞术直方图；染色/未染色的免疫标志物：CD3、CD14、CD11c、CD80、CCR7、CD83、MHCII。
图1：利用流式细胞术对人单核细胞来源的未成熟树突状细胞（iDCs）和成熟树突状细胞（mDCs）进行表型鉴定。通过体外诱导生成树突状细胞，并使用特异性抗体染色以验证其纯度：（A）CD3用于排除T细胞污染，（B）CD14用于排除单核细胞污染，以及（C）CD11c作为树突状细胞的标志物。为评估其表型成熟状态，使用了以下抗体：（D）CD80，（E）CCR7，（F）CD83，以及（G）MHCII。这些分子在成熟树突状细胞（mDCs）上高表达，因此可用于区分未成熟与成熟树突状细胞的表型。数据采用FCS express 5.0软件进行分析。请点击此处查看该图的放大版本。

HSV-1 感染分析；iDCs/mDCs 中的透射光与 GFP 荧光；流式细胞术图谱。
图2：HSV-1 感染的 iDCs 和 mDCs 的显微镜及流式细胞术分析。iDCs 和 mDCs 用表达 EGFP 的 HSV-1 毒株（HSV-1 EGFP）进行感染，以便基于 GFP 信号定量感染率。（A）在感染后 24 小时，以 MOI 为 2 感染的 GFP 阳性 HSV-1 感染 iDCs 和 mDCs 与其未感染对照组的显微镜分析结果。为观察感染细胞，检测 GFP 荧光信号。比例尺代表 400 µm。（B）模拟感染或 HSV-1 感染 mDCs 在感染动力学过程中的流式细胞术检测结果。上排图（黑色线框直方图）显示模拟感染条件，下排图（黑色填充直方图）显示感染后指定时间点的 HSV-1 感染细胞。数据使用 FCS express 5.0 进行分析。请点击此处查看该图的放大版本。

DMSO、Spautin-1 和 BA1 条件下 HSV-1 感染 iDC/mDC 的蛋白质表达的 Western 印迹分析。
图 3：Spautin-1 和巴佛洛霉素-A1 调节 HSV-1 感染的 iDC 中的自噬流。iDC 和 mDC 在感染前 1 小时分别用 (A) Spautin-1 或 (B) 巴佛洛霉素-A1 (BA1) 处理。随后，细胞进行模拟感染或 HSV-1 感染（HSV1-RFPVP26），感染复数（MOI）为 2。感染后 16–18 小时，收集树突状细胞（DC），制备蛋白裂解液，并通过 Western 印迹检测自噬标志物 p62 和 LC3B-I/-II 的表达，以 ICP0 作为感染对照，GAPDH 作为上样对照。使用 Bio1D 软件（光密度）对 LC3B-I 和 LC3B-II 蛋白水平进行定量，并归一化至参照蛋白 GAPDH。图中显示了归一化的 LC3B-II 信号与归一化的 LC3B-I 信号的比值。本图经修改和改编自 ©2019 Turan 等，最初发表于 JCB。https://doi.org/10.1083/jcb.20180115110。请点击此处查看此图的放大版本。

siRNA对FIP200作用的Western印迹分析、CD标志物流式细胞术数据、HSV-1感染研究
图4：FIP200-siRNA电穿孔后HSV-1感染iDCs中自噬流的分析。iDCs使用电穿孔仪I通过对照siRNA或FIP200特异性siRNA进行电穿孔。（A）通过Western印迹分析，在电穿孔后48小时检测FIP200敲低效率以评估DCs。（B）细胞活力以及（C）成熟状态在电穿孔前（浅蓝色直方图）和电穿孔后48小时（深蓝色和灰色直方图）通过流式细胞术进行分析。展示了三位不同供体的中位数值。在确认FIP200高效敲低及未成熟表型后，用MOI为2的HSV-1（HSV-1 EGFP）感染细胞。数据使用FCS express 5.0进行分析。（D）感染后20小时，进行Western印迹分析以检测LC3B-I/-II和p62的表达，作为自噬标志物。ICP5用于感染对照，GAPDH作为上样对照。图A和图D经修改和改编自©2019 Turan等，最初发表于JCB。https://doi.org/10.1083/jcb.20180115110。请点击此处查看此图的放大版本。

siRNA对KIF2A、KIF1B蛋白及CD标志物影响的Western印迹和流式细胞术分析。
图5：通过siRNA介导的KIF1B和/或KIF2A敲除调控HSV-1感染的mDCs中的自噬周转。 iDCs使用电穿孔装置II转染特异性靶向KIF1B和/或KIF2A的siRNA，以及对照siRNA。电穿孔后4小时，通过添加成熟化混合物诱导细胞成熟。电穿孔后48小时，通过（A）Western印迹法检测KIF基因敲降效率，（B）细胞活力，以及（C）通过流式细胞术分析其表型成熟状态（展示两个不同供体的数据）。“w/o EP”表示未进行电穿孔但进行了成熟化诱导；“post control EP”表示使用对照siRNA进行电穿孔后；“post KIF1B, KIF2A, KIF1B/2A EP”表示使用KIF1B和/或KIF2A特异性siRNA进行电穿孔后。在确认KIF1B和/或KIF2A高效敲降及细胞成熟表型后，用HSV-1（HSV-1 EGFP）以MOI为2感染细胞。数据使用FCS express 5.0软件进行分析。（D）感染后20小时对细胞进行Western印迹分析，以评估自噬标志物p62的表达。ICP5作为感染对照，GAPDH作为上样对照。图A和图D经修改并改编自©2019 Turan 等人，最初发表于JCB。https://doi.org/10.1083/jcb.20180115110。 请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

本实验方案的范围包括：（i）人单核细胞来源的未成熟树突状细胞（iDCs）以及成熟树突状细胞（mDCs）的培养与处理，（ii）用HSV-1病毒感染这些细胞，（iii）使用已知可抑制自噬的化合物处理细胞，以及（iv）采用两种不同的技术设置对细胞进行siRNA电穿孔转染。通过本实验方案，可在HSV-1感染的iDCs中阻断自噬流，或在HSV-1感染的mDCs中诱导自噬流。

由于树突状细胞（DCs），尤其是未成熟树突状细胞（iDCs），属于非常脆弱的细胞，因此操作这些细胞时需要格外精细。在DC的制备过程中，我们建议使用 freshly isolated PBMCs，并避免对其进行冷冻保存，以获得更高的细胞得率。此外，在实验过程中处理iDCs时（包括后续培养阶段），应避免剧烈或长时间的温度变化。否则，iDCs可能发生表型改变，因此有必要通过流式细胞术验证其未成熟表型。需要注意的是，与成熟的DC相比，iDCs缺乏明显的标志物，例如CD80、CD83和CD8628,29。利用HSV-1感染iDCs和mDCs是一种已被广泛建立的方法2,3,4,5,6,10。我们及其他研究者已证实，当使用1或2的感染复数（MOI）时，DCs对HSV-1感染具有高度易感性（图2）。在我们的实验条件下，将感染体系的体积保持在较低水平（250–350 µL中含1–3 × 106个细胞），可获得更高的感染效率。

干扰特定细胞通路的经典方法是使用特异性化合物。目前已有多种不同的自噬调节剂，即 自噬激活剂和抑制剂可供使用30。关于树突状细胞（DCs）中HSV-1诱导的自噬，Turan等（2019年）近期研究表明，spautin-1和bafilomycin-A1（BA1）可抑制iDCs中的自噬体降解过程10。该自噬抑制技术适用于与后续HSV-1感染联合使用，因为其既不影响感染率，也不影响DCs（尤其是iDCs）的成熟状态。在未来的应用中，这种基于抑制剂的方法还可与其他病原体感染、应激条件（如营养剥夺）以及不同细胞类型联合使用。然而，在使用抑制剂时，确定能够有效抑制自噬而又不严重损害细胞活力的合适浓度存在困难。使用抑制剂的主要局限性在于可能出现潜在的脱靶效应或不良效应，从而导致误导性的实验结果31,32。

本方案中涉及的第二种干扰自噬的方法是使用siRNA进行特异性敲低33,34,35。一方面，我们使用电穿孔仪I特异性消除FIP200的表达，从而抑制HSV-1诱导的iDCs中的自噬降解。另一方面，我们使用电穿孔仪II沉默两种不同的KIF蛋白（即KIF1B和KIF2A），以促进HSV-1感染的mDCs中的自噬流。两种电穿孔方案均几乎完全消除了iDCs中的FIP200以及mDCs中的KIF1B/KIF2A，该结果通过Western blot分析得到验证（图4A，图5A）。与不影响DCs存活率的电穿孔仪I相比，使用电穿孔仪II对mDCs进行电穿孔会导致死亡细胞比例略有升高（图4B，图5B）。因此，在未来的应用中，应优先将电穿孔仪I用于iDCs和mDCs。值得注意的是，这两种基于siRNA调控自噬流的技术均适用于后续对iDCs或mDCs的HSV-1感染实验。此外，电穿孔后iDCs的未成熟表型和mDCs的成熟表型均未发生改变。

使用FIP200特异性siRNA对iDCs进行电穿孔是一种高效且高度特异的基因敲低方法，可在HSV-1感染期间有效抑制自噬流。除特异性沉默FIP200外，本方案还可适用于沉默自噬级联反应不同阶段参与的其他自噬相关组分。然而，确定siRNA介导自噬抑制的合适靶点时需考虑多个方面。首先，自噬相关基因（ATG）的敲低效率并不一定与自噬抑制效率呈正相关，且该效果高度依赖于被沉默的具体ATG蛋白36其次，不同的ATG蛋白还参与了除自噬以外的其他通路，因此其缺失也可能导致不良副作用37,38,39第三，不同的自噬相关基因（ATGs）可能存在功能冗余，因此仅敲低其中一个组分可能不足以抑制自噬（例如., beclin-1 和 beclin-240.

此外，基于电穿孔仪 I 的树突状细胞电穿孔方案也适用于 mRNA，并可用于多种其他原代细胞类型，例如外周血单个核细胞（PBMCs）25。因此，该系统提供了一种通用策略，可将不同类型的 RNA 递送至多种原代细胞中。总之，我们提出了两种抑制自噬流的方案，分别是通过使用抑制剂或 siRNA 方法，并结合后续对诱导型树突状细胞（iDCs）进行单纯疱疹病毒 1 型（HSV-1）感染。此外，我们还描述了一种在 HSV-1 感染后通过 siRNA 电穿孔诱导成熟树突状细胞（mDCs）自噬流的方法。

披露

作者无任何披露信息。

致谢

本工作由德国研究基金会（DFG）通过授予AS的项目STE 432/11-1以及由埃尔朗根-纽伦堡大学医学院ELAN计划通过授予LG的项目18-12-21-1资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4D-Nucleofector 核心单元（电穿孔仪 II）Lonza (Basel, Switzerland)AAF-1002B
AB-血清Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)H4522树突状细胞培养
ACD-ASigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)9007281
Amaxa P3 原代细胞 4D-Nucleofector X 试剂盒 L（电穿孔试剂盒装置 II）Lonza (Basel, Switzerland)V4XP-3024
Amersham ECL Prime 蛋白印迹检测试剂GE Healthcare (Solingen, Germany)RPN2232蛋白印迹检测
过硫酸铵（APS）Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)A3678
抗小鼠 IgG（小鼠，多克隆，HRP）Cell Signaling (Leiden, Netherlands)7076蛋白印迹检测
抗兔 IgG（山羊，多克隆，HRP）Cell Signaling (Leiden, Netherlands)7074蛋白印迹检测
巴佛洛霉素 A1Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)tlrl-baf1自噬和溶酶体降解的抑制
BD FACS Canto II 流式细胞仪BD Biosciences (Heidelberg, Germany)338962
苯并核酸酶Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)E1014
Blotting Chamber Fastblot B44Biometra (Göttingen, Germany)846-015-100
CCR7（小鼠，Pe-Cy7）BioLegend (Fell, Germany)557648流式细胞术
稀释比例：1:100
克隆：G043H7
CD11c（小鼠，Pe-Cy5）BD Biosciences (Heidelberg, Germany)561692流式细胞术
稀释比例：1:100
克隆：B-ly6
CD14（小鼠，PE）BD Biosciences (Heidelberg, Germany)555398流式细胞术
稀释比例：1:100
克隆：M5E2
CD3（小鼠，FITC）BD Biosciences (Heidelberg, Germany)555332流式细胞术
稀释比例：1:100
克隆：UCHT1
CD80（小鼠，V450）BD Biosciences (Heidelberg, Germany)560442流式细胞术
稀释比例：1:100
克隆：L307.4
CD83（小鼠，APC）eBioscience Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany)17-0839-41流式细胞术
稀释比例：1:200
克隆：HB15e
CD86（小鼠，PE）BD Biosciences (Heidelberg, Germany)553692流式细胞术
稀释比例：1:100
EVOS FL 细胞成像系统System AMG/Life Technologies (Carlsbad, USA)AMF4300
FIP200（兔）Cell Signaling (Leiden, Netherlands)12436蛋白印迹检测
稀释比例：1:1000
克隆：D10D11
GAPDH（小鼠）Merck Millipore (Massachusetts, USA)AB2302蛋白印迹检测
稀释比例：1:5000
克隆：MAB374
Gene Pulser II 装置（电穿孔仪 I）BioRad Laboratories GmbH (München, Germany)165-2112
GM-CSF（4×104 U/mL）Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany)130-093-868
HLA-DR（小鼠，APC-Cy7）BioLegend (Fell, Germany)307618流式细胞术
稀释比例：1:200
克隆：L243
HSV-1/17+/CMV-EGFP/UL43BioVex树突状细胞感染
 
ICP0（小鼠）Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA)sc-53070蛋白印迹检测
稀释比例：1:1000
克隆：11060
ICP5（小鼠）Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA)sc-56989蛋白印迹检测
稀释比例：1:1000
克隆：3B6
IL-1β（0.1×106 U/mL）Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany)1411-050
IL-4（1×106 U/mL）Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany)130-093-924
IL-6（1×106 U/mL）Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany)1404-050
ImageQuant LAS 4000GE Healthcare (Solingen, Germany)28955810
KIF1B（小鼠）Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA)sc-376246蛋白印迹检测
稀释比例：1:1000
克隆：E-12
KIF2A（小鼠）Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA)sc-271471蛋白印迹检测
稀释比例：1:1000
克隆：D-7
LC3B（兔）Cell Signaling (Leiden, Netherlands)3868蛋白印迹检测
稀释比例：1:1000
克隆：D11
L-谷氨酰胺Lonza (Basel, Switzerland)17-605E
LIVE/DEAD 可固定紫红色死细胞染色试剂盒Life Technologies (Carlsbad, CA, USA)L34964流式细胞术中的活/死染色
LymphoprepAlere Technologies AS (Oslo, Norway)04-03-9391/01
氯化镁Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)A537.1
Megafuge 2.0 RSHeraeus (Hanau, Germany)75015505
N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)T9281
Neubauer 计数板Brand (Wertheim, Germany)717805
Nunc 细胞培养瓶（175.0 cm2）Thermo Scientific (Rockford, USA)159910
p62（兔）Cell Signaling (Leiden, Netherlands)88588蛋白印迹检测
稀释比例：1:1000
克隆：D5L7G
PageRuler 预染蛋白 MarkerThermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany)26616
16% 戊二醛Alfa Aesar, Haverhill, USA43368.9M
PerfectSpin 24 PlusPeqlab (Erlangen, Germany)C2500-R-PL
PGE2（1 mg/mL）Pfizer (Berlin, Germany)BE130681
磷酸盐缓冲液（PBS）Lonza (Basel, Switzerland)17-512F
Protein gel system MiniProtean IIBio-Rad Laboratories GmbH (München, Germany)1652960
RestoreTM 蛋白印迹 stripping 缓冲液Thermo Scientific, Rockford, USA21059
Rocking Platform wt 15Biometra (Göttingen, Germany)042-590
RotiBlockCarl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)A151.4
Roti-Load 1（4×）Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)K929.3
Rotiphorese Gel 30（37.5:1）Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)3029.1
RPMI 1640Lonza (Basel, Switzerland)12-167F
十二烷基硫酸钠（SDS）Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)2326.2
Thermomixer comfortEppendorf (Hamburg, Germany)5355 000.011
TNF-α（10 μg/mL）Peprotech (Hamburg, Germany)300-01A
TrisCarl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)4855.3
台盼蓝溶液（0.4%）Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)T8154
Tween 20Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)9127.1
Whatman 0.2 μm 硝酸纤维素膜GE Healthcare (Solingen, Germany)10600001
WhatmanTM 色谱纸 3 mm ChrFisher Scientific GmbH (Schwerte, Germany)3030917

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利用siRNA电穿孔技术调控单纯疱疹病毒1型感染的单核细胞来源树突状细胞中的自噬
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