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分离小鼠心室肌细胞的光学成像

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DOI：

10.3791/60196

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2020年1月17日

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1Anhui Province Key Laboratory of Hepatopancreatobiliary Surgery, The First Affiliated Hospital of USTC, Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China, Hefei, Anhui, China, 2Central Nodal (Anhui) Bioscience and Technology Research Center, Hefei, Anhui, China, 3Pediatric Cardiac and Thoracic Surgery, University Hospitals Cleveland Medical Center

本文内容

摘要

我们介绍了分离小鼠心肌细胞的方法，以及如何利用荧光光度法结合同时进行的数字细胞形态测量，同步获得动作电位或钙瞬变信号与肌节缩短信号。

摘要

分离成年心肌细胞的技术使研究人员能够在单细胞水平上研究多种心脏病理状态。尽管钙离子敏感性染料的发展已实现了对单个细胞钙动力学的稳定光学记录，但对跨膜光学电压信号的可靠记录仍然存在困难。这主要是由于传统电位敏感染料的信噪比较低，以及存在光毒性和光漂白问题。因此，长期以来单细胞电压测量主要依赖于膜片钳技术——尽管该技术被视为金标准，但其操作复杂且通量较低。然而，随着新型电位敏感染料的开发，现已能够获得幅度大、响应快的光学电压信号，且几乎不产生光毒性和光漂白。本实验方案详细描述了如何分离成年小鼠心肌细胞，用于细胞缩短、钙离子及光学电压的测量。具体而言，方案中介绍了如何使用一种比率型钙离子染料、一种单激发钙离子染料以及一种单激发电压染料。该方法可用于评估各种化学物质的心脏毒性及致心律失常性。尽管在单细胞水平上光毒性问题仍然存在，本文也讨论了降低该问题的方法学策略。

引言

为了研究心脏在健康和病理状态下的功能，通常需要在单细胞水平上分析其表型。尽管科学技术的进步已实现了对单细胞钙动力学的可靠测量，但单细胞光学电压测量仍然较为罕见1。这可能是因为传统电位敏感染料的信噪比（SNR）较低，并存在光毒性和光漂白问题2,3。尽管如此，已有研究成功获得了分离心肌细胞的光学动作电位2,3,4。此外，随着电压敏感染料在化学和物理性能方面的进步，其信噪比已得到改善5。新型膜电位探针（材料表）可在亚毫秒时间内响应膜电位变化，其荧光响应范围约为每100 mV产生25%的信号变化。此外，本实验方案中使用的膜电位检测试剂盒（例如 FluoVolt；材料表）的激发/发射波长与标准的异硫氰酸荧光素（FITC）或绿色荧光蛋白（GFP）设置兼容6。

FITC 和 GFP 的激发/发射光谱与结合钙离子的 fluo-4 荧光光谱存在重叠7。传统上，荧光光度测量与数字细胞形态测量的同步采集已被用于同时获取钙信号和细胞缩短信号8。本方案详细描述了如何分离小鼠心肌细胞，以及如何使用标准的 FITC 设置记录钙信号或电压信号。此外，还介绍了如何通过成像工作站上激发/发射滤光片的简单切换，利用比率型钙指示剂 fura-2 同时获取钙信号和细胞缩短的测量结果。与 fluo-4 相比，fura-2 对钙离子具有更高的亲和力，并且相对更耐光漂白9。因此，利用同一台工作站，本方案可实现对单个心肌细胞兴奋-收缩耦联的全面研究。

方案

本方案中描述的所有方法和操作程序均已获得凯斯西储大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。

1. 溶液、仪器和盖玻片的准备

注意：1× 溶液可使用长达一个月。

  1. 在1,000 mL烧瓶中，将68.96 g NaCl、3.57 g KCl、59.58 g HEPES、2.18 g K2HPO4、3.08 g MgSO4和19.82 g葡萄糖加入800 mL双蒸水中，配制不含钙的10倍Krebs-Henseleit缓冲液（KHB-HB）。待成分完全溶解后，转移至1,000 mL容量瓶中定容。
    注：传统的Krebs-Henseleit溶液使用碳酸氢钠作为缓冲剂，而本方案中的溶液采用含HEPES缓冲剂的Krebs-Henseleit溶液。若经无菌过滤，该溶液可稳定保存6个月。
  2. 在1,000 mL烧瓶中，将86.51 g NaCl、0.552 g NaH2PO4、2.03 g MgCl2、9.91 g葡萄糖、4.03 g KCl、2.65 g CaCl2和35.76 g HEPES加入800 mL双蒸水中，配制10倍Tyrode's溶液。待成分完全溶解后，转移至1,000 mL容量瓶中定容。
    注：若经无菌过滤，该溶液可稳定保存6个月。
  3. 取100 mL 10倍KHB-HB储备液，加入盛有875 mL双蒸水的1,000 mL烧瓶中，配制1倍KHB-HB溶液。将烧瓶置于37 °C水浴中。待溶液温度达到37 °C后，使用NaOH调节pH至7.39。调节pH后，在1,000 mL容量瓶中定容。使用真空过滤系统对溶液进行无菌过滤。
  4. 取100 mL 10倍Tyrode's储备液，加入盛有875 mL双蒸水的1,000 mL烧瓶中，配制1倍Tyrode's溶液。将烧瓶置于37 °C水浴中。待溶液温度达到37 °C后，使用NaOH调节pH至7.39。调节pH后，在1,000 mL容量瓶中定容。使用真空过滤系统进行无菌过滤。
  5. 取100 mL 10倍Tyrode's储备液，加入盛有875 mL双蒸水的1,000 mL烧瓶中，配制1倍改良Tyrode's溶液。在烧瓶中溶解3.07 g还原型L-谷胱甘肽。将烧瓶置于37 °C水浴中。待溶液温度达到37 °C后，使用NaOH调节pH至7.39。调节pH后，在1,000 mL容量瓶中定容。使用真空过滤系统对溶液进行无菌过滤。
  6. 将855 µL二甲基亚砜（DMSO）加入25 mg粉末中，配制100 mM blebbistatin储备液。分装为每管20 µL，于-80 °C冰箱中保存，最长可保存六个月。
  7. 在100 mL 1倍KHB-HB溶液中加入2 g牛血清白蛋白（BSA）和1管分装的blebbistatin储备液，配制终止缓冲液，并使用真空过滤系统对溶液进行无菌过滤。
  8. 在95 mL M199 HEPES培养基中加入5 mL胎牛血清和1管分装的blebbistatin储备液，配制铺板缓冲液，并使用真空过滤系统对溶液进行无菌过滤。
  9. 在396 mL M199（25 mM HEPES）培养基中加入1管分装的blebbistatin储备液和4 mL青霉素-链霉素溶液，配制心肌细胞培养缓冲液，并使用真空过滤系统对溶液进行无菌过滤。
  10. 对2对Dumont镊子、2对Iris弯头剪刀、2把止血钳、1对塑料外科镊子、6段已预置为外科双结的黑色编织4-0丝线缝合线以及四个100 mL烧杯进行高压灭菌处理。
  11. 对22 × 22 mm2玻璃盖玻片进行灭菌处理。首先，将单个盖玻片放入6孔板的每个孔中。随后，打开生物安全柜的UV灯，在无盖状态下将盖玻片暴露于紫外光下照射1小时。
  12. 首先将一瓶层粘连蛋白（laminin）在冰上解冻，然后将其内容物加入足量的冷无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中，使终浓度达到0.04 mg/mL，配制工作用层粘连蛋白储备液。将溶液分装为每管1.3 µL，装入已高压灭菌的1.5 mL离心管中，于-80 °C保存。
    注：每管层粘连蛋白足够用于一个6孔板。避免反复冻融。
  13. 首先将工作用层粘连蛋白溶液在冰上解冻。使用P1000移液器吸取200 µL层粘连蛋白溶液，轻轻将移液器枪头沿盖玻片的一边拖动，利用毛细作用引出微量层粘连蛋白，以促进盖玻片在6孔板中的附着。
  14. 随后，将剩余的层粘连蛋白溶液排至盖玻片中央。以环形方式将液滴均匀涂布于整个盖玻片表面。在细胞分离前，将其置于37 °C培养箱中孵育至少1小时，最长可至24小时。

2. 兰格多夫装置的准备

注意：本方案中使用的兰格多夫装置的各个组件列于材料表中。

  1. 打开循环水浴。调节温度，使灌流液温度达到 37 °C。
    注意：当溶液储液罐高度设置为 60 cm 时，循环水浴需设定为 41 °C，才能使灌流液温度维持在 37 °C。与先前报道的方案不同，储液罐的高度无需调整。
  2. 用 70% 乙醇冲洗 Langendorff 装置，随后用高压灭菌的双蒸水冲洗两次。冲洗后，向储液罐中加入 KHB-HB 并用 100% 氧气进行氧合。
  3. 通过让氧合的 KHB-HB 首先进入一个 100 mL 烧杯来预充系统。当有 50 mL 溶液流入烧杯后，切换三通旋塞位置，停止来自 KHB-HB 储液罐的液体流动。将烧杯中的 50 mL 氧合 KHB-HB 倒入胶原酶储液罐中。
  4. 让 KHB-HB 从消化储液罐中排出，直至胶原酶储液罐中剩余 5 mL。在预充胶原酶储液罐的同时，反复切换三通旋塞在各储液罐之间的位置，以排出管路中的气体。系统预充完成后，记得使用加热盘管顶部的脱气阱，使系统中残留的空气排出。
  5. 配制胶原酶溶液。对于大鼠，将 100 mg II 型胶原酶、100 mL 氧合 KHB-HB 和 2 瓶肌球蛋白抑制剂（blebbistatin）储备液混合。对于小鼠，将 100 mg II 型胶原酶、40 mL 氧合 KHB-HB 和 2 瓶肌球蛋白抑制剂储备液混合。溶液配制后可在 1 小时内保持稳定。
    注意：不同批次的 II 型胶原酶可能影响心肌细胞的存活率。建议利用胶原酶样品测试项目，在批量订购前对批次进行测试。

3. 心肌细胞分离

  1. 向动物注射 1,000 U 肝素。等待 5 分钟。
    注意：可使用任何年龄的小鼠或大鼠。但通常情况下，动物年龄越大或疾病越严重，心肌细胞的得率越低。
  2. 首先采用开放滴注法（每 500 cc 体积使用 1 cc 异氟烷）用异氟烷麻醉动物，随后通过腹腔注射戊巴比妥钠混合液（150 mg/kg）实施安乐死。
  3. 迅速取出心脏：首先抓住剑突上方的毛发。使用虹膜剪在剑突下方做一个小切口，并将皮肤向上朝头部方向拉起以暴露胸腔区域。
  4. 抓住剑突并剪开膈肌以暴露胸腔。做一扇形切口，用止血钳向后拉开胸骨，再用弯头镊子在升主动脉上方切除心脏，并将其置于冰冷的 KHB-HB 溶液中。
  5. 使用体视显微镜和 5 号镊子进行心脏插管。确保心脏完全浸没，并在心脏切除前预先灌注导管以防止栓塞。通过观察导管尖端位于心室主动脉插入点上方约 1 mm 处，确认导管位置正确。
    注意：插管操作越快，心肌细胞得率越高。
  6. 旋转兰格多夫装置上的旋塞阀以启动 KHB-HB 溶液的流动。将导管连接至兰格多夫装置，对心脏进行 5 分钟的灌注。
    注意：由于灌注系统依赖重力驱动，流经心脏的流速取决于冠状动脉的顺应性。
  7. 将灌注液从 KHB-HB 储液瓶切换至消化缓冲液储液瓶。一旦消化缓冲液到达心脏，立即启动计时器（小鼠 5 分钟，大鼠 15 分钟）。务必使用无菌 100 mL 烧杯收集灌注液。根据需要，用收集的灌注液补充消化缓冲液储液瓶，直至消化时间结束。
  8. 消化完成后，在无菌 100 mL 烧杯中使用镊子和虹膜剪将心脏各腔室分离。将每个腔室分别放入六孔板中的不同孔内。向每孔加入 5 mL 胶原酶溶液。
  9. 立即使用剪刀开始剪碎心脏组织。组织块大小应约为 1 mm3。使用无菌移液管轻轻吹打剪碎的心脏组织，使溶液变浑浊。
  10. 当组织块变为白色且呈羽毛状时，使用倒置显微镜观察细胞。若活细胞比例超过 80%，则继续操作，使用 100 µm 细胞滤网将细胞过滤至 50 mL 圆底离心管中。每个心脏腔室应使用不同的离心管和滤网。
    1. 若活细胞比例低于 80%，请检查插管所用时间。若插管时间超过 5 分钟，建议更换另一颗心脏；否则，应通过胶原酶取样程序检测新的胶原酶批次。
  11. 以 215 × g 离心 2 分钟使细胞沉淀。沉淀应紧密而不松散。若沉淀松散，则表明制备物中含有大量死亡细胞。在组织培养超净台中，将沉淀重悬于 10 mL 终止缓冲液中。
  12. 再次以 215 × g 离心 2 分钟使细胞沉淀。沉淀应紧密而不松散。若沉淀松散，则表明制备物中含有大量死亡细胞。
  13. 将细胞重悬于 5 mL 铺板缓冲液中。进行细胞计数，并调整铺板缓冲液的体积，使最终心肌细胞浓度达到 2 × 104 个细胞/mL。
  14. 从培养箱中取出预先包被 laminin 的盖玻片，吸除表面的 laminin 液滴。
  15. 在每张盖玻片上接种 200 µL 心肌细胞悬液。置于 37 °C 培养箱（21% O2，5% CO2）中孵育 2 小时，以促进细胞贴壁。2 小时后，吸除未贴壁细胞，加入 2 mL 培养基，继续培养最多 4 天。

4. Fura-2 染料负载

  1. 通过将25 µL DMSO加入50 µg fura-2乙酰氧基甲酯（fura-2 AM）粉末（1小瓶）中，配制2 mM fura-2 AM储备液。分装成每份6 µL。取1份fura-2 AM加入6 mL铺板培养基中，涡旋混匀。
  2. 从培养箱中取出一板六孔培养板的心肌细胞，吸除培养基。每孔加入1 mL fura-2染液混合物。用铝箔覆盖培养板，室温孵育15分钟。
  3. 吸除fura-2染液混合物，每孔加入1 mL台氏液。用铝箔覆盖，室温静置20分钟，以充分洗脱染料，随后进行成像。

5. Fluo-4 染料负载

  1. 通过将25 µL DMSO加入50 µg fluo-4乙酰氧基甲酯（fluo-4 AM）粉末（1小瓶）中，配制1.82 mM fluo-4 AM储备液。分装成每份8.333 µL。取1份fluo-4 AM储备液加入6 mL铺板培养基中，涡旋混匀。
  2. 从培养箱中取出一孔6孔板的心肌细胞，吸除培养基，每孔加入1 mL fluo-4 AM染料混合液。用铝箔包裹培养板，室温孵育15分钟。
  3. 吸除fluo-4 AM染料混合液，每孔加入1 mL Tyrode's溶液，用铝箔覆盖。室温静置20分钟，以充分洗脱染料，随后进行成像。

6. 膜电位染料加载

  1. 从膜电位检测试剂盒中取出组分A和组分B。在15 mL锥形管中，加入50 µL组分B和5 µL组分A，涡旋混匀。向含有电压染料混合物的15 mL锥形管中加入10 mL铺板培养基，涡旋混匀。
  2. 从培养箱中取出一板六孔培养板的心肌细胞，吸除培养基。向每孔加入800 µL膜电位染料混合液。用铝箔包裹培养板，室温孵育15分钟。
  3. 吸除染料混合液，向每孔加入1 mL改良Tyrode's溶液，用铝箔覆盖。

7. 光度测量与电荷耦合器件记录

  1. 按以下顺序开启设备：显微镜、弧光灯、超速开关（hyperswitch）、荧光接口系统、Myocam电源、场刺激器和计算机。
  2. 确保激发/发射滤光片组适用于成像染料。
    注：Fura-2 的激发光波长为 340 nm 和 380 nm，发射光波长为 510 nm。Fluo-4 和膜电压染料的激发光波长为 485 nm，发射光波长为 520 nm。
  3. 通过打开真空系统、完全松开软管夹，并轻轻推动多通管路中使用的每个 60 mL 注射器来预启动系统。进行钙成像记录时使用台氏液（Tyrode's solution），进行电压记录时使用改良台氏液（modified Tyrode's solution）。
  4. 打开加热器，并通过调节灌流管路上的滚轴夹来设定流速。记录时保持温度为 36 ± 1 °C。
  5. 启动采集软件，并确保参数设置与所用成像染料相匹配。
  6. 在暗环境中，从六孔板上移除铝箔，将盖玻片放入起搏腔室中。此步骤期间确保刺激器处于关闭状态。使用 10x 物镜对心肌细胞进行聚焦。
  7. 聚焦完成后，开始以 1 Hz、0.2 V 进行场刺激起搏。逐步增加电压，直至实现 1:1 起搏。随后继续增加电压，直至达到阈值电压的 1.5 倍。
    注：由于兴奋-收缩耦合具有温度依赖性，记录前应确保细胞已灌流 15 分钟，以便心肌细胞从室温恢复至 37 °C 所带来的热休克中恢复，同时使未牢固贴壁的细胞被冲走。
  8. 将物镜从 10x 切换至 40x，对一个能够稳定跟随 1:1 起搏的细胞进行精细聚焦。调节塑料遮光板，使视野中仅包含单个细胞。
  9. 使用软件在结构清晰的肌节区域放置感兴趣区域框（area of interest box），启动采集软件以开启激发光源。通过中性密度滤光片（neutral density filters）适当调节光强，以获得足够的信噪比（SNR）。

结果

图1A展示了Langendorff装置。氧合器位于KHB-HB储液罐中。胶原酶溶液位于中间的60 mL注射器储液罐中。脱气管路连接至空的60 mL注射器储液罐。成功分离后，大多数细胞应呈杆状并具有横纹。在40倍物镜下，大多数心肌细胞应能清晰观察到横纹。图1B,C展示了健康大鼠心肌细胞的示例。分离后的细胞可在维持其形态和电生理特性的条件下培养长达4天。

为了测量兴奋-收缩耦合，将细胞置于一个加热的 pacing 装置中。由于心肌细胞对温度变化敏感，在记录前需将载玻片在装置内平衡 15 分钟。进行荧光记录时，激发波长由 75 W 氙弧灯产生。氙弧灯产生的光谱模拟自然阳光。光强和波长通过中性密度/发射滤光片进行调控。激发光随后通过物镜照射到心肌细胞上。发射波长则由光电倍增管收集。使用此处描述的系统时，激发滤光片和发射滤光片均需手动更换。

另一方面，缩短程度由电荷耦合器件传感器获取。该系统以每秒高达1000次的频率进行实时测量，采集软件对感兴趣区域内的线条进行平均，从而生成清晰的条纹图样。随后计算快速傅里叶变换（FFT），功率谱中的峰值即代表平均肌节间距。起搏过程中肌节间距的变化被绘制成图并进一步量化。

图2显示了从负载钙荧光染料fura-2的C57/B6小鼠心肌细胞记录到的钙瞬变和细胞缩短轨迹。所使用的起搏程序是对先前描述的起搏方案10,11的改进。健康的小鼠心肌细胞应能够在静息心率10 Hz下稳定起搏。图3是对来自C57/B6小鼠及其转基因（TG）同窝小鼠的集合平均数据的量化结果，后者在钾通道中引入了一个点突变。注意，除在10 Hz起搏下的舒张时间外，两组之间无其他差异。

与双激发波长的荧光染料fura-2不同，电压敏感染料和fluo-4均为单波长激发染料，其激发/发射波长与标准的FITC激发和发射光谱（494/506 nm）相匹配。因此，使用该滤光片组可同时记录钙信号与肌节缩短，或电压信号与肌节缩短。

图4A 显示了在10 Hz起搏频率下记录的C57/B6小鼠心肌细胞的电压轨迹。与钙信号相比，单细胞电压轨迹的幅度较小，需要经过后期处理才能获得可用的信号。图4B 显示了由 图4A 中的动作电位（AP）生成的集成平均动作电位。图4C,D 显示了在应用低通巴特沃斯滤波器或Savitzky-Golay数字滤波器后得到的集成平均动作电位。在对信号进行滤波时必须谨慎，以避免扭曲真实数据。请注意 图4B-D 中动作电位形态上的细微差异。

图5显示了在1 Hz起搏条件下记录的大鼠心肌细胞的信号轨迹。除了电压信号低于钙信号外，收缩动力学也存在差异。这是因为钙染料会缓冲钙离子，而电压染料则不会产生此类缓冲作用。

与钙瞬变（图3）类似，心肌细胞也表现出依赖于起搏频率的光学动作电位时程（APD）变化（图6）。在对fura-2信号进行量化前，先对其进行集合平均；而电压信号则在集合平均和量化前，采用Savitzky-Golay多项式平滑滤波器（窗宽5，阶数2）进行滤波处理。

如定量所示 图6 以及 图7，除了展示起搏诱导的APD变化外，还展示了药物诱导的AP延长。在4 Hz起搏下，瞬时外向电流（I至使用4-氨基吡啶后导致动作电位时程延长。

最后，必须注意避免细胞毒性。图8 是一段20秒记录中的最后11秒。如图8中红色箭头所示，心肌细胞长时间暴露于蓝光会导致触发活动。

Langendorff 灌注示意图、心脏胶原酶提取、心肌细胞分离的显微镜结果。
图 1：恒压 Langendorff 装置。（A）Langendorff 装置，各组成部分以白色文字标注。（B）通过 10x 物镜观察分离的 Sprague-Dawley 大鼠心肌细胞。（C）通过 40x 物镜观察分离的大鼠心肌细胞。请点击此处查看此图的放大版本。

频率调制信号分析；显示波形从 0.5 Hz 到 10 Hz 变化的图表。
图 2：使用 fura-2 记录的 C57/B6 心肌细胞中钙离子和肌节缩短的代表性轨迹。 在 1、2、4、10、0.5 和 0.75 Hz 下记录的钙离子和肌节缩短轨迹。请点击此处查看此图的放大版本。

肌节动态图、舒张时间和再摄取时间、钙离子比率、频率依赖性分析。
图3：从C57/B6野生型（WT）和转基因型（TG）小鼠记录的肌节缩短、峰值钙离子浓度、舒张时间及再摄取时间的定量分析。 （A）肌节缩短。（B）峰值钙离子浓度。（C）舒张时间，定义为缩短轨迹恢复至基线水平90%所需的时间。（D）再摄取时间，定义为钙离子轨迹恢复至基线水平90%所需的时间。 请点击此处查看该图的放大版本。

使用集成平均、低通巴特沃斯和Savitzky-Golay滤波器进行信号处理分析的图表
图4：从以10 Hz起搏的C57/B6小鼠心肌细胞记录的光学动作电位。（A）1秒未滤波的原始信号。（B）集成平均后的光学动作电位。（C）应用低通巴特沃斯滤波器后的集成平均光学动作电位。（D）应用Savitzky-Golay多项式平滑滤波器后的集成平均光学动作电位。请点击此处查看该图的放大版本。

肌节缩短实验中的Fluo-4和电压敏感染料信号；荧光测量图。
图 5：以 1 Hz 频率起搏的 Sprague-Dawley 大鼠心肌细胞记录的代表性钙离子、电压及肌节缩短信号。 （A）使用 fluo-4 在 1 Hz 起搏下记录的钙离子和肌节缩短信号。（B）使用电压敏感染料在 1 Hz 起搏下记录的电压和肌节缩短信号。 请点击此处查看该图的放大版本。

电生理学结果；1-4 Hz 下的动作电位时程测量；显示动作电位及其持续时间的图表。
图 6：在 1、2 和 4 Hz 起搏频率下记录的 Sprague-Dawley 大鼠心肌细胞的光学动作电位。（A）在 1 Hz 起搏下记录的滤波轨迹。（B）在 2 Hz 起搏下记录的滤波轨迹。（C）在 4 Hz 起搏下记录的滤波轨迹。（D）动作电位时程 10（APD10），定义为恢复至基线水平 10% 的时间点。（E）动作电位时程 50（APD50），定义为恢复至基线水平 50% 的时间点。（F）动作电位时程 90（APD90），定义为恢复至基线水平 90% 的时间点。请点击此处查看该图的高清版本。

电生理实验；动作电位时程分析与比较的信号迹线（A-C）和柱状图（D-F）
图7：4-氨基吡啶对以4 Hz起搏记录的Sprague-Dawley大鼠光学动作电位的影响。（A）在无4-氨基吡啶溶液中以4 Hz起搏记录的集合平均迹线。（B）在含1 µM 4-氨基吡啶溶液中以4 Hz起搏记录的集合平均迹线。（C）在含10 µM 4-氨基吡啶溶液中以4 Hz起搏记录的集合平均迹线。（D）动作电位时程10，定义为恢复至基线水平10%的时间点。（E）动作电位时程50，定义为恢复至基线水平50%的时间点。（F）动作电位时程90，定义为恢复至基线水平90%的时间点。请点击此处查看该图的放大版本。

瞬态吸收光谱图显示峰形；光子学研究，光学激发结果。
图8：连续光照20秒后Sprague-Dawley大鼠心肌细胞中电压敏感染料诱导的光毒性。 红色箭头指示细胞毒性事件。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

能够分离心肌细胞是一种强大的方法，可用于理解心脏生理学、病理学和毒理学。在上述方案中，我们描述了一种利用恒重力压力兰格多夫装置获取单个心肌细胞的方法。随后，通过荧光光度测定系统，我们介绍了如何同时获取钙瞬变和细胞缩短，或膜电位和细胞缩短的记录。

由于不同钙离子染料的动力学特性存在差异，因此在选择染料时需格外谨慎。本实验方案中使用的fura-2和fluo-4均经过AM酯修饰，因此需要洗涤步骤，以便细胞内酯酶有足够时间切割AM基团，从而使染料滞留在细胞内。尽管fura-2和fluo-4均被视为高亲和力钙离子染料，但fura-2的解离常数（Kd）为145 nM，而fluo-4为345 nM9。此外，fura-2具有比率型特性，因此可用于定量测定细胞内钙离子浓度9,12。而fluo-4则是一种单波长钙离子探针，其优势在于可产生更强的荧光信号。无论使用何种钙离子染料，与钙离子染料相比，膜电位探针的信噪比（SNR）较低。

如图4和图5所示，与钙信号相比，电压信号的振幅较小。通过使用软件的数字信号滤波功能，可以提高信噪比（SNR）并对数据进行定量分析（图4和图7）。定量分析后可见，钙瞬变和光学动作电位时程（APD）均表现出恢复特性，即在较快起搏频率下其持续时间缩短（图2、图3、图6和图7）。在较快起搏周期中APD缩短，对于保证舒张期心室充分充盈至关重要。该现象的改变被认为提示心律失常风险增加13,14,15,16。虽然APD的改变可由疾病引起，但也可能由化学物质所致。如图7所示，当主要的小鼠复极化钾电流Ito被阻断时，光学APD会延长。

然而，如先前使用电压敏感染料时所报道的，光照强度和持续时间可能会改变动作电位时程（APD2,5,17）。这被认为是由活性氧（ROS）的产生所导致的5。先前研究表明，在记录液中添加抗氧化剂可防止电压敏感染料引起的细胞毒性5。因此，我们在Tyrode溶液中加入了抗氧化剂L-谷胱甘肽（10 mM）。图8显示了在1 Hz起搏条件下获得的20秒记录中最后11秒的结果。如红色箭头所示，APD的改变直到记录开始后15秒才出现；因此，尽管改良的Tyrode溶液未能完全防止光毒性，但显著延迟了其发生。通过使用改良的Tyrode溶液、采用较低的光照强度，并将记录时间控制在5秒以内，可以避免染料引起的APD改变。这一点非常重要，因为如果不注意避免光毒性，数据可能被误读为出现了早后除极或迟后除极。除了限制蓝光暴露外，还可采取其他预防措施以避免对数据的误判。

第一个标准是仅记录那些能够跟随一对一起搏且静息肌节长度大于或等于1.75 µm的细胞。1.75 µm这一阈值来源于Gordon等人的观察结果18，即当肌节长度低于此值时，张力会迅速下降。然而，某些病理状态可能导致静息肌节长度发生显著改变。为了确保所观察到的表型真实可靠，而非细胞分离过程中的假象，应采取以下故障排除方法。

如果心肌细胞始终无法实现1:1起搏、肌节长度低于1.75 µm、细胞膜出现严重出泡，或在分离过程中无法存活，首先应检查心脏插管所用的时间。插管时间越长，细胞得率越低。若必须进行较长时间的插管，可通过将心脏置于停搏液中以提高细胞活力19。然而，由于胶原酶是一种酶，其特定批次的活性和特异性会随时间发生变化。即使插管时间良好但总体得率持续下降，应检测新的批次。虽然本实验方案已针对5秒记录时间进行了优化，但如果需要更长的电压轨迹记录，则需额外购买中性密度滤光片。本方案中描述的系统配备有中性密度滤光片，可将透射光强度分别降低37%、50%、75%、90%和95%。

综上所述，我们描述了一种用于分离成年小鼠心室肌细胞的方法，这些细胞可用于钙离子、膜电位和肌节缩短的测量。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢Dana Morgenstern对稿件的仔细校对。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.25 升水套式储液槽Radnoti, LLC120142-025
1升容量瓶Fisher Scientific10-205F
100 ml 烧杯Fisher ScientificFB-100-100
100 ml 量筒Fisher Scientific08 562 5C
1000 ml 锥形瓶Fisher ScientificFB-500-1000
带稳定杆的双杆实验架及24" 不锈钢棒Radnoti, LLC159951-2
4-氨基吡啶Sigma-Aldrich275875
40倍奥林巴斯UApo/340无浸液物镜（数值孔径0.9，工作距离0.2 mm）IonOptixMSCP1-40 (b)
60 mL 注射器，BD Luer-Lok 接头BD309650
主动脉金属导管Harvard Apparatus73-0112
牛血清白蛋白Fisher ScientificBP9703-100
C-6 标准加热循环器ChemyxA30006
CaCl2Fisher ScientificBP510500
细胞固定适配器IonOptixCFA300
CellPr0 真空过滤系统，1 升，0.22µm,Cs/12Labratory Product Sales, IncV100022
CellPro 真空过滤系统，250 mL，0.22µm,Cs/12Labratory Product Sales, IncV25022
CellPro 真空过滤系统，500 mL，0.22µm,12/CSLabratory Product Sales, IncV50022
CMC（mTCII）带管路内加热器的温度控制模块IonOptixTEMPC2
Cole-Parmer 大口径三通带锁公接头旋塞阀Cole-ParmerEW-30600-23
Cole-Parmer 鲁尔接头，大孔径旋塞阀，带锁阳接头，4 通Cole-ParmerEW-30600-12
Cole-Parmer 带鲁尔接头的旋塞；1 通；公型滑动接头Cole-ParmerEW-30600-01
II型胶原酶沃辛顿LS004177
康宁无菌细胞筛Fisher Scientific07-201-432
戴尔 Optiplex 790 迷你塔式机，4G 内存，250G 硬盘，Windows 7 专业版IonOptixCPUD7M
DMSOFisher Scientific50980367
Dumont 镊子 5 型亚马逊B00F70ZDEQ
FHD 快速变化刺激室IonOptixFHDRCC1
Fluo-3/4 光学组件IonOptixIonOP-Fluo
荧光系统接口 – （带 PCI-I/O 卡）IonOptixFSI700
Gibco 青霉素-链霉素（10,000 U/mL）Fisher Scientific15-140-122
葡萄糖Fisher ScientificD16-1
止血钳，弯型，5-1/2"亚马逊B00GGAAPD0
HEPESFisher ScientificBP310500
HyperSwitch 双激发光源IonOptixHSW400
倒置 Motic 荧光显微镜IonOptixMSCP1-40 (a)
IonWizard Core + 分析IonOptixIONWIZ
虹膜剪，弯型亚马逊B018KRRMY6
K2HPO4Fisher ScientificP288-100
KClFisher ScientificBP3661
还原型L-谷胱甘肽Sigma-AldrichG4251
LOOK 丝线卷轴，黑色编织线，4-0，100码SouthernAnesthesiaSurgical 公司SP116-EA
M199 培养基Fisher Scientific12 340 030
MgCl2Fisher ScientificMP021914215
MgSO4Fisher ScientificBP2131
MyoCam-S 数字CCD视频系统IonOptixMCS100
MyoPacer 电场刺激器IonOptixMYP100
NaClFisher ScientificBP358212
NaH2PO4Fisher Scientific56-754-9250GM
带液体进口的0.25升氧合器鼓泡器Radnoti, LLC140143-025
光电倍增子系统IonOptixPMT400
PMT采集附加组件IonOptixPMTACQ
Radnoti 加热线圈 5 mL 带脱气阱Radnoti, LLC158830
60号环形夹 – 80 mm 直径，适用于 250 ml 储液槽Radnoti, LLC120141-025
用于气泡捕集合规腔的环形夹Radnoti, LLC120149RC
Saint-Gobain ACF000010 5/32 英寸 9/32 英寸Fisher Scientific14-171-214
Saint-Gobain ACF000013 3/16 英寸 3/8 英寸Fisher Scientific14-171-217
Saint-Gobain ACF000016 1/4 英寸 5/16 英寸Fisher Scientific14-171-219
Saint-Gobain ACF000025 5/16 英寸 5/8 英寸Fisher Scientific14-171-226
Saint-Gobain ACF00003 1/16 英寸 × 3/16 英寸Fisher Scientific14-171-209
Saint-Gobain ACF00005 1/16 英寸 3/32 英寸Fisher Scientific14-171-210
Saint-Gobain ACF00009 5/32 英寸 7/32 英寸Fisher Scientific14-171-213
肌节长度记录附加组件IonOptixSARACQ
T/C Adson 组织整形外科镊 4.75"亚马逊B00JDWRBGC
VETUS 防静电弯头镊子亚马逊B07QMZC94J
Vistek 3200 Motic 振动隔离平台IonOptixISO100

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