已建立一种激光捕获显微切割（LCM）方案，用于从骨细胞中获取足量且高质量的RNA，以进行基因表达分析。本研究主要针对小鼠股骨切片。然而，此处报道的LCM方案也可用于研究任何硬组织细胞中的基因表达。
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摘要
摘要
RNA 产量和完整性对 RNA 分析至关重要。然而，在整个激光显微切割（LCM）过程中保持 RNA 完整性常常面临技术上的挑战。由于 LCM 研究所用材料量较少，RNA 产量有限的问题也需重点关注。因此，本研究建立了一种 LCM 实验方案，旨在从骨细胞中获取足量且高质量的 RNA，用于基因表达分析。本研究评估了染色方案、冷冻切片厚度、显微切割组织量、RNA 提取试剂盒以及所用 LCM 系统对显微切割骨细胞所得 RNA 产量和完整性的影响。采用带黏附膜的冷冻切片机制备 8 µm 厚的骨组织冷冻切片，并使用商业 LCM 染色剂的快速染色方案进行染色。样品被夹在聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜与黏附膜之间。利用依靠重力收集样品的 LCM 系统，结合基于离心柱的 RNA 提取方法，成功获得了产量充足且质量较高的 RNA。本研究主要聚焦于小鼠股骨切片。然而，本文报道的 LCM 实验方案也可用于研究任何硬组织细胞在生理状态及疾病过程中的原位基因表达。
引言
组织由异质且空间分布的细胞类型构成。在特定组织中，不同类型的细胞可能对同一信号产生不同的反应。因此，能够分离特定的细胞群体，对于评估不同细胞类型在生理和病理条件下的作用至关重要。激光捕获显微切割（LCM）提供了一种相对快速且精确的方法，用于从复杂组织中分离和提取特定细胞1。LCM 系统利用激光束的能量，从组织学切片中分离目标细胞，而无需进行酶处理或体外培养。这意味着细胞仍处于其天然的组织环境中，且包括不同细胞间空间关系在内的组织结构得以保留。捕获细胞及剩余组织的形态均能良好保存，并可在同一张切片上依次采集多个组织组分。分离后的细胞可用于后续对其 RNA、DNA、蛋白质或代谢物成分的分析2,3。
为了分析不同细胞群体或不同处理后的基因表达，必须获得足够质量和数量的mRNA，以用于后续分析4,5。与DNA不同，RNA对固定更为敏感，因此在以研究RNA为目的时，建议使用冷冻组织。由于mRNA极易被无处不在的核糖核酸酶（RNase）快速降解，因此在样本处理和制备过程中必须严格保持无RNase的环境，并避免样本在室温下储存。此外，为防止RNA降解，必须采用快速且不包含长时间水相步骤的技术
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方案
小鼠骨组织的使用严格遵循现行的动物护理指南，所有努力均旨在尽量减少动物的痛苦。
1. 动物与冷冻包埋
- 将动物饲养在恒定室温（RT；24 °C）条件下，保持12小时光照/12小时黑暗的循环，并自由获取食物和水。
注意：本研究中使用的骨组织来自3月龄雄性野生型C57BL/6小鼠。 - 尸检时，在全身麻醉（腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪，100/6 mg/kg）下通过腹部下腔静脉放血处死小鼠。
注意：为避免RNA降解，应使用无RNase的器械和材料，佩戴手套，并快速操作，整个实验过程中避免样本在室温下存放。 - 迅速取出完整的股骨，用手术刀和纸巾清除周围软组织。将最佳切割温度（OCT）包埋剂倒入包埋模具中，将股骨置于模具底部。将样本在液氮中速冻。OCT在室温下透明，冷冻后呈白色。
- 待样本完全冻结后，用铝箔包裹，并在干冰上转移至-80 °C保存。样本可于-80 °C长期保存，直至后续处理。
注意：本方案可在此处暂停。
2. 切片制备
- 将冷冻切片机的温度设置为 -19 °C，样品头温度设置为 -17 °C。使用 70% 乙醇擦拭冷冻切片机内部。将硬组织专用的一次性刀片、载玻片和贴附工具....
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结果
已建立一种激光显微切割（LCM）方案，用于从小鼠股骨骨细胞中获取足量的高质量RNA，以进行基因表达分析。在优化后的方案中，将8 µm厚的冷冻骨组织切片切割至粘附膜上，并采用商业化的LCM冷冻切片染色试剂盒进行快速染色。样品被夹在PET膜与粘附膜之间。使用基于重力收集样本的LCM系统对小鼠骨细胞进行显微切割。采用基于层析柱的RNA提取方法，获得产量充足且质量较高的RNA。通过微毛细管电泳检测所分离RNA的产量和完整性（图1）。
使用不同裂解方案所获得的RNA质量和数量差异可通过代表性凝胶电泳图和电泳图谱观察到。当样品在管盖中通过上下吹打裂解1分钟时，可从1 mm2显微切割的骨组织（8 µm厚切片）中分离出约8.5 ng的RNA。RIN值为8.60（图2）。
或者，可使用一种采用散焦激光脉冲的激光显微切割系统进行LCM，该系统将组织材料弹射至上方的黏附帽中。RNA的质量和数量可通过代表性凝胶.......
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讨论
在样本制备的各个阶段，如组织操作、激光显微切割（LCM）过程和RNA提取，RNA的质量和数量均可能受到不利影响。因此，已开发出一种LCM方案，以获得足量的高质量RNA，用于后续的基因表达分析。
对于激光显微切割（LCM），大多数实验室使用厚度为7−8 µm的切片2。较厚的切片可收获更多材料，但如果过厚，则可能降低显微分辨率，并导致激光无法完全切割。组织的最佳厚度可能取决于所使用的LCM系统（以及激光和载玻片类型），同时也与具体组织类型有关8,25。在本研究中，测试了不同厚度的冷冻切片（4、8或12 µm）；结果表明，8 µm厚的切片最适合LCM，而12 µm的骨组织切片激光切割更为困难，4 µm的切片则获得的RNA量较低。
不同组织之间的内源性RNase活性存在差异。因此，为RNase活性极低的组织开发的染色方案可能不适用于其他类型的组织。据建议，核快红.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Ute Zeitz 和 Nikole Ginner 提供出色的技术帮助，同时感谢 Vetcore 及动物护理团队给予的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-巯基乙醇 | Sigma | 63689-25ML-F | |
| 绝对乙醇 EMPLURA | Merck Millipore | 8,18,76,01,000 | |
| 粘附膜（LMD膜） | Section-Lab | C-FL001 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer 系统 | Agilent Technologies | ||
| Agilent RNA 6000 Pico 芯片试剂盒 | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus HistoGene 染色液 | Applied Biosystems | 12241-05 | |
| 冷冻膜安装工具 | Section-Lab | C-FT000 | |
| Leica CM 1950 冷冻切片机 | Leica Biosystems | ||
| 玻璃显微镜载玻片，切边橙色磨砂 | VWR Life Science | 631-1559 | |
| 组织学组织模具 PVC材质 | MEDITE | 48-6302-00 | |
| LMD7 激光 显微切割 系统 | Leica Microsystems | ||
| 低剖面切片刀片 Leica DB80 XL | Leica Biosystems | 14035843496 | |
| 无核酸酶水 | VWR Life Science | E476-500ML | |
| PET膜载玻片 1.4 μm | Molecular Machines & Industries GmbH | 50102 | |
| RNase Away 表面去污剂 | Molecular BioProduct | 7002 | |
| RNeasy Micro 试剂盒 | Qiagen | 74004 | |
| Tissue-Tek 最佳切割温度（OCT）包埋剂 | Sakura Finetek | 4583 | |
| 二甲苯 | VWR Life Science | 2,89,73,363 |
参考文献
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Legres, L. G., Janin, A., Masselon, C., Bertheau, P. Beyond laser microdissection technology: follow the yellow brick road for cancer research. American journal of Ca....
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