已建立一种激光捕获显微切割（LCM）方案，用于从骨细胞中获取足量且高质量的RNA，以进行基因表达分析。本研究主要针对小鼠股骨切片。然而，此处报道的LCM方案也可用于研究任何硬组织细胞中的基因表达。
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摘要
摘要
RNA 产量和完整性对 RNA 分析至关重要。然而，在整个激光显微切割（LCM）过程中保持 RNA 完整性常常面临技术上的挑战。由于 LCM 研究所用材料量较少，RNA 产量有限的问题也需重点关注。因此，本研究建立了一种 LCM 实验方案，旨在从骨细胞中获取足量且高质量的 RNA，用于基因表达分析。本研究评估了染色方案、冷冻切片厚度、显微切割组织量、RNA 提取试剂盒以及所用 LCM 系统对显微切割骨细胞所得 RNA 产量和完整性的影响。采用带黏附膜的冷冻切片机制备 8 µm 厚的骨组织冷冻切片，并使用商业 LCM 染色剂的快速染色方案进行染色。样品被夹在聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜与黏附膜之间。利用依靠重力收集样品的 LCM 系统，结合基于离心柱的 RNA 提取方法，成功获得了产量充足且质量较高的 RNA。本研究主要聚焦于小鼠股骨切片。然而，本文报道的 LCM 实验方案也可用于研究任何硬组织细胞在生理状态及疾病过程中的原位基因表达。
引言
组织由异质且空间分布的细胞类型构成。在特定组织中，不同类型的细胞可能对同一信号产生不同的反应。因此，能够分离特定的细胞群体，对于评估不同细胞类型在生理和病理条件下的作用至关重要。激光捕获显微切割（LCM）提供了一种相对快速且精确的方法，用于从复杂组织中分离和提取特定细胞1。LCM 系统利用激光束的能量，从组织学切片中分离目标细胞，而无需进行酶处理或体外培养。这意味着细胞仍处于其天然的组织环境中，且包括不同细胞间空间关系在内的组织结构得以保留。捕获细胞及剩余组织的形态均能良好保存，并可在同一张切片上依次采集多个组织组分。分离后的细胞可用于后续对其 RNA、DNA、蛋白质或代谢物成分的分析2,3。
为了分析不同细胞群体或不同处理后的基因表达，必须获得足够质量和数量的mRNA，以用于后续分析4,5。与DNA不同，RNA对固定更为敏感，因此在以研究RNA为目的时，建议使用冷冻组织。由于mRNA极易被无处不在的核糖核酸酶（RNase）快速降解，因此在样本处理和制备过程中必须严格保持无RNase的环境，并避免样本在室温下储存。此外，为防止RNA降解，必须采用快速且不包含长时间水相步骤的技术6。RNA的得率和完整性也可能受到激光显微切割（LCM）过程及所用LCM系统的影响7,8。目前已有四种基于不同工作原理的LCM系统可供使用2。RNA提取方法同样重要，因为不同RNA提取试剂盒在RNA产量和质量方面表现出显著差异7,8。
任何组织制备方法都需要在获得良好的形态学对比度与保持RNA完整性以进行后续分析之间找到平衡。为了制备骨组织的冷冻切片，已开发出一种粘附膜并持续改进9。骨组织切片可直接在该粘附膜上进行切割和染色。这种粘附膜适用于多种染色方法，并可用于通过激光显微切割技术（LCM）从骨组织冷冻切片中分离目标细胞9,10,11,12,13,14。所有步骤，包括手术切除、包埋、冷冻、切片和染色，均可在不到一小时内完成。重要的是，成骨细胞、骨衬细胞和破骨细胞等细胞类型可以被清晰识别9,10,11,12,13,14。该方法具有快速且简便的优点。另一种制备骨组织冷冻切片的方法是使用转移胶带系统15。然而，后一种技术更为耗时，且需要额外的仪器，因为切片必须通过紫外（UV）交联的方式从粘附胶带转移至预涂层膜载玻片上。尽管转移胶带系统已成功与LCM结合使用16,17,18,19，但应注意，交联涂层可能产生背景图案，从而干扰细胞类型的识别20。
通常，从显微切割的细胞中只能提取到少量RNA，且RNA的质量和数量通常通过微毛细管电泳进行评估21。计算机程序可用于为RNA提取物分配一个称为RNA完整性数（RNA integrity number, RIN）的质量指数。RIN值为1.0表示RNA完全降解，而值为10.0则表明RNA完全完整22。通常，RIN指数大于5即被认为足以用于RNA研究。据报道，RIN值在5.0−10.0范围内的样本之间的基因表达模式具有良好的相关性23。尽管该方法的灵敏度较高，最低可检测到低至50 pg/µL的总RNA，但如果样本中RNA浓度极低，则很难获得可靠的质量评估结果。因此，为了评估RNA质量，常利用激光显微切割（LCM）后载玻片上残留的组织切片，通过向切片上加样缓冲液来提取RNA24。
尽管激光显微切割技术（LCM）已广泛应用于多种冷冻组织，但提取RNA的RIN值却鲜有报道。此外，目前尚无比较性研究来明确研究小鼠骨骼中RNA的最合适方法。在本研究中，采用成年小鼠股骨的冷冻切片，优化样本制备、LCM操作流程及RNA提取方法，以获得高质量的RNA。本实验方案特别针对采用重力方式进行样本收集的LCM系统进行了优化。
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方案
小鼠骨组织的使用严格遵循现行的动物护理指南，所有努力均旨在尽量减少动物的痛苦。
1. 动物与冷冻包埋
- 将动物饲养在恒定室温（RT；24 °C）条件下，保持12小时光照/12小时黑暗的循环，并自由获取食物和水。
注意：本研究中使用的骨组织来自3月龄雄性野生型C57BL/6小鼠。 - 尸检时，在全身麻醉（腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪，100/6 mg/kg）下通过腹部下腔静脉放血处死小鼠。
注意：为避免RNA降解，应使用无RNase的器械和材料，佩戴手套，并快速操作，整个实验过程中避免样本在室温下存放。 - 迅速取出完整的股骨，用手术刀和纸巾清除周围软组织。将最佳切割温度（OCT）包埋剂倒入包埋模具中，将股骨置于模具底部。将样本在液氮中速冻。OCT在室温下透明，冷冻后呈白色。
- 待样本完全冻结后，用铝箔包裹，并在干冰上转移至-80 °C保存。样本可于-80 °C长期保存，直至后续处理。
注意：本方案可在此处暂停。
2. 切片制备
- 将冷冻切片机的温度设置为 -19 °C，样品头温度设置为 -17 °C。使用 70% 乙醇擦拭冷冻切片机内部。将硬组织专用的一次性刀片、载玻片和贴附工具放入冷冻切片机中预冷，并在切片过程中始终保持其在机内。
- 将置于干冰上的冷冻组织块转移至冷冻切片机中，使其至少平衡 10 分钟。
注意：避免将同一组织块在 -80 °C 与 -19 °C 之间反复冻融或频繁进出冷冻切片机。 - 按压包埋模具底部，将 OCT 包埋块推出模具。在样品头表面涂抹适量 OCT 包埋介质，用于固定组织块。等待 OCT 介质完全冻结。
- 将样品头安装至样品架中并拧紧固定。调整刀片位置，以 15 µm 的切片厚度进行修片，去除覆盖在样品表面的 OCT 介质。若样品先前已被切过且表面暴露于空气中，则弃去该组织块最初的 2−3 张切片。
- 调节冷冻切片机以生成 8 µm 厚的切片，先切下 2−3 张冷冻切片并弃去（最初几张切片通常会厚于 8 µm）。将粘附膜贴附于组织块表面，并使用贴附工具将膜与组织块紧密贴合。切割时应缓慢且匀速进行，通过粘附膜固定切下的切片。
- 立即将粘附膜（组织面向上）转移至预冷的载玻片上（置于冷冻切片机内的冷棒上），以防止样品解冻。使用胶带将粘附膜固定在载玻片上，便于后续染色操作。随后立即进行染色实验流程。
3. 快速染色方案
- 在50 mL离心管中配制以下40 mL溶液，并置于冰上：95%乙醇、无RNase水、100%乙醇、100%乙醇和100%二甲苯。所有操作步骤均在冰上进行（染色步骤除外）。每次实验当天，均需使用无RNase水新鲜配制所有水相试剂。
注意：应在通风橱中操作，以避免二甲苯中毒。 - 将切片在95%乙醇中孵育30秒，然后在无RNase水中浸洗30秒，以小心且彻底地去除可能干扰激光显微切割（LCM）及后续应用的OCT包埋剂。
- 将50 µL商用LCM冷冻切片染色液（材料表）滴加至切片上，在室温下孵育10秒，然后将玻片边缘置于吸水纸上以去除多余染液。再用100%乙醇冲洗30秒，以去除残留染料。
- 将骨组织切片浸入另一管100%乙醇中30秒，随后转移至100%二甲苯中30秒。
- 将粘附膜（样品面朝上）放置于干燥的载玻片上作为支撑。注意确保膜未受损伤，并尽可能平整放置。切勿让样品完全干燥。
- 将PET膜框架载玻片置于其上，用戴手套的手指短暂按压膜表面，使其与粘附膜贴合。此时样品被夹在膜与粘附膜之间。粘附膜不应折叠或起皱，膜与膜之间不得有气泡。应立即进行激光显微切割（LCM）操作。
4. 激光显微切割
- 使用表面去污剂（材料表）清洁载物台和帽夹上的RNase。将载玻片和帽分别装入载玻片架和帽夹中。
- 调节焦距，使用1.25倍物镜获取载玻片的概览图像。切换至40倍物镜并调节焦距。根据载玻片概览选择感兴趣的区域。按如下参数设置激光：孔径，7；激光功率，60；速度，5；脉冲频率，201；样本平衡，20。针对每个物镜优化这些参数。
- 如果激光无法切割样本，可提高激光功率。或者，可多次应用激光。此外，检查目标区域是否存在切割不完全的位点，并使用移动并切割选项在这些位点重新绘制切割线。保存激光设置，用于后续载玻片的显微切割。
- 根据形态学标准，在股骨远端松质骨或皮质骨中选择成骨细胞、骨细胞和骨衬细胞。绘制激光路径时，应使路径远离目标细胞，以尽量减少紫外激光对细胞的损伤。所有显微切割操作应在染色后1小时内完成。
- 将每种细胞类型分别收集至0.5 mL离心管的独立管帽中。
注意：采用干燥捕获而非液体回收方式可避免RNA降解。此外，在激光捕获显微切割（LCM）过程中，微量缓冲液可能在微量离心管帽内蒸发或结晶（取决于其成分）。 - 在适用情况下，通过观察LCM后收集管帽的状态确认捕获是否成功。随后立即进行RNA提取。
5. RNA 提取
- 将含有β-巯基乙醇的裂解缓冲液50 µL加入收集管的管盖中，通过在管盖内用移液器反复吹打1分钟来裂解样本。短暂离心收集裂解液，然后向管中加入300 µL含有β-巯基乙醇的裂解缓冲液。如果多个管盖的样本将合并处理，请确保缓冲液总体积符合RNA提取试剂盒的推荐用量（材料表）。
注意：必须添加β-巯基乙醇以防止RNA降解，但该物质具有毒性。操作时应穿戴防护服和手套，并在通风橱内进行。 - 此外，为每张切片准备一个标记好的1.5 mL微量离心管，其中加入350 µL含有β-巯基乙醇的裂解缓冲液。利用激光捕获显微切割（LCM）后剩余的组织切片提取RNA。小心地将膜上的薄膜与膜分离，并通过缓慢地将裂解缓冲液多次吹打至切片上以裂解样本。
注意：裂解缓冲液的总体积应为350 µL。不要一次性全部加入用于消化，否则缓冲液会从切片上流走。 - 将裂解后的样本置于干冰上，并在-80 °C保存。
注意：本方案可在此处暂停。 - 在室温下解冻裂解液。将激光捕获显微切割收集的细胞裂解液从收集管转移至1.5 mL微量离心管中。若使用多个管盖收集样本，可将多个裂解液合并。
- 根据试剂盒说明书提取RNA。使用DNase I处理柱以去除基因组DNA。用14 µL无RNase的水洗脱RNA，最终获得12 µL洗脱液。将RNA在-80 °C保存。
注意：本方案可在此处暂停。
6. RNA 产量与完整性的测定
- 在湿冰上解冻RNA。使用微毛细管电泳法测定分离RNA的产量和完整性。根据制造商说明书，将总RNA（每样本1 µL）上样至芯片（材料表）中。
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结果
已建立一种激光显微切割（LCM）方案，用于从小鼠股骨骨细胞中获取足量的高质量RNA，以进行基因表达分析。在优化后的方案中，将8 µm厚的冷冻骨组织切片切割至粘附膜上，并采用商业化的LCM冷冻切片染色试剂盒进行快速染色。样品被夹在PET膜与粘附膜之间。使用基于重力收集样本的LCM系统对小鼠骨细胞进行显微切割。采用基于层析柱的RNA提取方法，获得产量充足且质量较高的RNA。通过微毛细管电泳检测所分离RNA的产量和完整性（图1）。
使用不同裂解方案所获得的RNA质量和数量差异可通过代表性凝胶电泳图和电泳图谱观察到。当样品在管盖中通过上下吹打裂解1分钟时，可从1 mm2显微切割的骨组织（8 µm厚切片）中分离出约8.5 ng的RNA。RIN值为8.60（图2）。
或者，可使用一种采用散焦激光脉冲的激光显微切割系统进行LCM，该系统将组织材料弹射至上方的黏附帽中。RNA的质量和数量可通过代表性凝胶...
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讨论
在样本制备的各个阶段，如组织操作、激光显微切割（LCM）过程和RNA提取，RNA的质量和数量均可能受到不利影响。因此，已开发出一种LCM方案，以获得足量的高质量RNA，用于后续的基因表达分析。
对于激光显微切割（LCM），大多数实验室使用厚度为7−8 µm的切片2。较厚的切片可收获更多材料，但如果过厚，则可能降低显微分辨率，并导致激光无法完全切割。组织的最佳厚度可能取决于所使用的LCM系统（以及激光和载玻片类型），同时也与具体组织类型有关8,25。在本研究中，测试了不同厚度的冷冻切片（4、8或12 µm）；结果表明，8 µm厚的切片最适合LCM，而12 µm的骨组织切片激光切割更为困难，4 µm的切片则获得的RNA量较低。
不同组织之间的内源性RNase活性存在差异。因此，为RNase活性极低的组织开发的染色方案可能不适用于其他类型的组织。据建议，核快红...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Ute Zeitz 和 Nikole Ginner 提供出色的技术帮助，同时感谢 Vetcore 及动物护理团队给予的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-巯基乙醇 | Sigma | 63689-25ML-F | |
| 绝对乙醇 EMPLURA | Merck Millipore | 8,18,76,01,000 | |
| 粘附膜（LMD膜） | Section-Lab | C-FL001 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer 系统 | Agilent Technologies | ||
| Agilent RNA 6000 Pico 芯片试剂盒 | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus HistoGene 染色液 | Applied Biosystems | 12241-05 | |
| 冷冻膜安装工具 | Section-Lab | C-FT000 | |
| Leica CM 1950 冷冻切片机 | Leica Biosystems | ||
| 玻璃显微镜载玻片，切边橙色磨砂 | VWR Life Science | 631-1559 | |
| 组织学组织模具 PVC材质 | MEDITE | 48-6302-00 | |
| LMD7 激光 显微切割 系统 | Leica Microsystems | ||
| 低剖面切片刀片 Leica DB80 XL | Leica Biosystems | 14035843496 | |
| 无核酸酶水 | VWR Life Science | E476-500ML | |
| PET膜载玻片 1.4 μm | Molecular Machines & Industries GmbH | 50102 | |
| RNase Away 表面去污剂 | Molecular BioProduct | 7002 | |
| RNeasy Micro 试剂盒 | Qiagen | 74004 | |
| Tissue-Tek 最佳切割温度（OCT）包埋剂 | Sakura Finetek | 4583 | |
| 二甲苯 | VWR Life Science | 2,89,73,363 |
参考文献
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