人类卵母细胞的压电辅助卵胞浆内单精子注射

摘要

本文介绍了一种使用压电驱动显微注射针将精子注射入人类卵母细胞的胞质内的实验方案。

摘要

自从首次通过胞质内单精子注射（ICSI）实现成功妊娠的报道以来，ICSI已成为辅助生殖技术（ART）中不可或缺的技术。传统ICSI技术使用带有尖端的显微注射针穿透卵母细胞的透明带和细胞膜，随后通常将细胞质吸入显微注射针内以实现细胞膜破裂（即常规ICSI）。小鼠卵母细胞在常规ICSI后的存活率和受精率分别仅为16%和8%。Kimura和Yanagimachi在小鼠ICSI中应用了压电驱动装置、汞以及带有平头尖端的显微注射针，通过结合此类设备可在无需将细胞质吸入注射针的情况下实现半自动化的细胞膜破裂（即压电ICSI）。与常规ICSI相比，该方法显著提高了卵母细胞的存活率和受精率（分别为80%和78%）。因此，压电ICSI不仅可能对小鼠卵母细胞有效，也可能适用于人类卵母细胞的ICSI。然而，目前仅有五篇论文评估了压电ICSI与常规ICSI在人类卵母细胞中的效果比较，所有这五篇论文均报告压电ICSI的受精率显著高于常规ICSI。本文所述压电ICSI方案的目标是相较于常规ICSI，提高ICSI的临床治疗效果。

引言

自Palermo博士首次报道通过胞浆内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection, ICSI）成功实现妊娠以来¹，ICSI已成为辅助生殖技术（assisted reproductive technology, ART）中一项必不可少的技术。ICSI使用带有尖端的显微注射针穿透透明带和细胞膜，随后通常将细胞质吸入显微注射针内以实现膜的破裂（传统ICSI）。小鼠卵母细胞在传统ICSI后的存活率和受精率分别仅为16%和8%²。Kimura和Yanagimachi在小鼠ICSI中应用了压电驱动装置、汞以及带有平头尖端的显微注射针²，通过结合此类设备可实现膜破裂的半自动化操作（压电ICSI）。与传统ICSI相比，压电ICSI的卵母细胞存活率和受精率显著提高，分别达到80%和78%²。压电ICSI获得更优结果的原因之一可能是其膜破裂的过程：压电ICSI能够在不将细胞质吸入显微注射针的情况下稳定且半自动地完成膜的破裂。这些结果表明，在膜破裂过程中将细胞质吸入显微注射针对小鼠卵母细胞具有侵入性。因此，压电ICSI不仅可能对小鼠卵母细胞有效，也可能适用于人类卵母细胞的ICSI。

然而，目前仅有五篇已发表的论文评估了压电ICSI与传统ICSI在人类卵母细胞中的有效性。这五篇论文均报告，与传统ICSI相比，压电ICSI的受精率显著更高^3,4,5,6,7（表1）。因此，与传统ICSI相比，压电ICSI可能提高卵母细胞的存活率和受精率。本文所述压电ICSI方案的目标是相较于传统ICSI，改善ICSI的临床结果。

方案

下文所述的压电ICSI方案遵循加茂田医疗中心人类研究伦理委员会的指南。

1. 仪器与准备

1. 使用由驱动单元、操作箱、脚踏开关和控制器组成的压电ICSI系统。可使用任意类型的倒置显微镜或三轴显微操作仪。将压电驱动单元连接至微吸管持具，并将脚踏开关放置于地面。在操作箱上将INTENSITY（强度）设为2级，SPEED（速度）设为1级。
2. 使用市售的具有平头尖端的压电ICSI微吸管。用操作液（基于氟碳化合物的液体）填充微吸管至20 mm长度。避免在操作液中混入任何气泡。使用液体填充装置将微吸管后部的气泡或过量操作液吸除。
3. 将微吸管安装至注射用微吸管持具中。若注射用微吸管持具配有硅胶管，则将微吸管头部插入硅胶管约5 mm。拧紧持具帽，牢固固定微吸管。
4. 将驱动单元连接至显微操作仪，并牢固固定，以避免因其重量导致旋转。
5. 将微吸管置于显微镜视野中。操作注射仪，推动操作液至微吸管头部，以排出管头内部的空气。应肉眼确认微吸管头部内无残留空气，而非通过显微镜观察。
6. 在玻璃底培养皿上准备ICSI操作皿，如图1所示。准备两滴7%聚乙烯吡咯烷酮溶液（PVP）：较小的一滴用于微吸管预处理（5 µL），另一滴用于精子筛选（10 µL）。在玻璃底培养皿中央另准备一滴缓冲培养基液滴，用于卵母细胞的培养及精子注射（8 µL）。
7. 将微吸管头部插入7% PVP液滴中，使PVP涂布微吸管内壁。强力操作注射仪，沿操作液与PVP之间的界面边界移动微吸管。从管头起约800 µm处用PVP冲洗微吸管内部。
   1. 重复此步骤约3至4次，直至界面边界滑动顺畅。

2. 精子固定

1. 在操作盒上将INTENSITY（强度）设为2，将SPEED（速度）设为1。当脚踏开关开启时，由连接在显微注射针夹持器上的驱动装置施加压电脉冲。在操作过程中施加压电脉冲时，视频右上角会出现"压电脉冲"图标。
2. 利用密度梯度法收集活动精子，并将其置于缓冲液中。用移液器吸取约2–3 µL含有已收集活动精子的缓冲液，然后将其注入7% PVP微滴的下方。在400倍放大倍率下选择目标精子。
   1. 将显微注射针尖附着于所选精子的尾部，随后启动压电驱动装置。通常每使一个精子失活需重复驱动3次。精子失活后，先将精子吸入显微注射针的尾部。

3. 压电ICSI操作（具有高延展性膜的卵母细胞）

1. 将精子头部保持在距显微注射针头约一个精子全长的位置。在驱动压电驱动装置（每个卵母细胞约驱动5次）的同时，推进显微注射针，完成对透明带的穿刺，且不引起透明带变形。当显微注射针尖到达透明带内层，并将穿刺出的透明带小块完全吸入针内时，即完成透明带穿刺。
2. 将显微注射针内穿刺出的透明带小块移除，同时将精子移至显微注射针的前端。继续推进显微注射针，拉伸卵母细胞质膜，直至拉伸范围达到卵母细胞直径的约90%。
3. 当质膜被充分拉伸后，启动压电驱动装置一次，以击破质膜。当观察到膜发生回弹时，表明膜破裂已完成。
4. 完成膜破裂后，将精子头部注入卵母细胞内。确认精子头部已完全进入细胞质后，注意避免注入过多不必要的液体。

4. 压电-ICSI 操作（细胞膜延展能力较低的卵母细胞）

注意：我们介绍如何处理膜延展性较低的卵母细胞，此类卵母细胞在拉伸过程中可能自发破裂。

1. 对具有高延展性膜的卵母细胞执行相同操作，直至拉伸细胞质膜为止。
2. 若操作过程中膜自发破裂，应从微吸管位置注入精子头部，但不再进一步推进，以避免精子注入后卵母细胞发生退化。
3. 确认精子头部已注入细胞质后，注意不要加入多余的液体。

结果

上述常规ICSI和压电ICSI技术由4名胚胎学家在10,488个成熟卵母细胞（1,744个周期）上实施。其中，2013年1月至2016年9月期间，在上总中央医院通过常规ICSI对3,522个卵母细胞（587个周期）进行了受精；2016年10月至2020年12月期间，通过压电ICSI对6,966个卵母细胞（1,157个周期）进行了受精。表1列出了接受常规ICSI和压电ICSI治疗女性的平均年龄、受精率、存活率、退化率、第5天囊胚形成率以及每个周期平均冷冻保存的囊胚数量。尽管接受压电ICSI治疗女性的平均年龄高于常规ICSI组，但压电ICSI组的受精率、存活率、囊胚形成率以及每个周期平均冷冻保存的囊胚数量均显著高于常规ICSI组（表2）。

图1：用于压电ICSI的ICSI培养皿。 此处描述了微滴的排布方式。请点击此处查看此图的放大版本。

研究	常规-ICSI	压电-ICSI
Yanagida et al. (1999)	66%a	79%b
Takeuchi et al. (2001)	83%a	90%b
Hiraoka et al. (2015)	68%a	89%b
Furuhashi et al. (2019)	64%a	75%b
Fujii et al. (2020)	71%a	84%b
ab<0.05 同一行内

表1：传统ICSI与压电ICSI受精率的比较。 所有研究报告均显示，与传统ICSI相比，压电ICSI的受精率显著更高。

	常规ICSI	压电ICSI	P
女性平均年龄	38.6 ± 0.2	39.2 ± 0.2	<0.05
周期数	587	1,157	-
卵母细胞数	3,522	6,966	-
受精数（%）	2,352 (66.8)	5,411 (77.7)	<0.01
存活数（%）	3,303 (93.8)	6,767 (97.1)	<0.01
退化数（%）	219 (6.2)	199 (2.9)	<0.01
囊胚数（%）	915 (38.9)	2,787 (51.5)	<0.01
每周期平均冷冻保存囊胚数	3.8 ± 0.2	5.1 ± 0.2	<0.01

表2：龟田医疗中心比较疗效的临床结果 常规ICSI 和 压电ICSI. 在所有比较项目中，与传统ICSI相比，压电ICSI均观察到显著更好的结果。

讨论

结果表明，与传统ICSI相比，压电驱动的ICSI在受精率、存活率、第5天囊胚形成率以及冷冻保存囊胚的平均数量方面均显著更高。

压电ICSI方案中有两个关键步骤。第一步是必须牢固地拧紧移液管固定器的夹持帽。第二步是保持吸入显微移液管内的PVP体积小于300微米。若未充分拧紧显微移液管固定器的夹持帽，或吸入显微移液管的PVP体积超过300微米（单条精子全长约为60微米），将导致精子固定、透明带穿孔及细胞膜破裂操作困难，原因是压电功率下降。尤其在操作过程中，必须始终注意控制吸入显微移液管内的PVP体积。这是压电ICSI技术的局限性。

在微移液管内加入少量重液作为操作液以产生压电动力至关重要。在以往的报道中，曾使用汞作为操作液^2,3,4。然而，出于安全考虑，可使用基于氟碳化合物的液体替代汞^5,6,7,8,9,11。该氟碳基液体比重为1.8，无色、透明且不溶于水。操作液会直接接触盛放精子的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。PVP暴露于操作液可能对精子或卵母细胞产生某些不利影响。但在本研究中，与传统ICSI相比，压电ICSI的受精率、存活率及第5天囊胚形成率均显著更高。我们认为，操作液与PVP直接接触所带来的风险非常低。

我们此前测量了使用油注射器和空气注射器制备显微毛细管所需的时间。油注射器和空气注射器的显微毛细管制备平均时间分别为233秒和106秒（P < 0.05）⁸。空气注射器的显微毛细管制备时间更短，因其无需使用油。油的存在会因黏性而延长制备时间。若将显微毛细管插入移液管架后，空气气泡混入毛细管内的油区，则该移液管必须弃用，因为压电ICSI将无法正常工作。我们还统计了显微毛细管制备过程中废弃的移液管数量。每位患者在油注射器组和空气注射器组中平均废弃的显微毛细管数量分别为0.28 ± 0.56和0 ± 0（P < 0.05）⁸。然而，在压电ICSI后，两组在卵子存活率（99%与99%）、受精率（89%与90%）以及优质第3天胚胎率（61%与61%）方面均无显著差异⁸。在本研究中，与空气注射器组（90例患者）相比，油注射器组（90例患者）额外浪费了3.2小时和25根显微毛细管⁸。结果表明，使用空气注射器替代油注射器是对压电ICSI技术的一项良好改进。

压电ICSI技术可以在不将细胞质吸入微针管的情况下，半自动地击破细胞膜。该膜破裂操作稳定且简便。压电ICSI还有助于缩短ICSI技术的培训周期。我们此前曾评估了压电ICSI对年轻胚胎学家的卵子存活率、受精率和囊胚形成率的影响。该年轻胚胎学家在开始临床ICSI治疗前，接受了30次压电ICSI操作训练。我们比较了年轻与资深胚胎学家各自前100个卵母细胞的存活率、受精率和囊胚形成率。年轻与资深胚胎学家的存活率分别为100%和97%，受精率分别为87%和91%，囊胚形成率分别为47%和57%⁹。在所有比较项目中，年轻与资深胚胎学家之间均无显著差异。这些结果表明，压电ICSI在细胞膜破裂操作中具有重要意义，有助于缩短年轻胚胎学家的ICSI技术培训周期。

一些研究者报告了胞质内形态学筛选精子注射（IMSI）的临床有效性。Setti 等人通过一项荟萃分析研究比较了 ICSI 与 IMSI 的临床结局¹⁰。ICSI 组与 IMSI 组之间的受精率无显著差异¹⁰。然而，IMSI 组的优质胚胎率显著高于 ICSI 组¹⁰。据我们所知，目前尚无研究探讨 IMSI 联合压电-ICSI 对受精和胚胎发育的影响。我们回顾性地研究了在压电-ICSI 中精子选择放大倍数（400倍 vs. 1,200倍）对受精和胚胎发育的影响。1,200倍组的受精率（92%）显著高于400倍组（77%）（P = 0.0002）¹¹。1,200倍组的优质第3天胚胎率（64%）也显著高于400倍组（46%）（P = 0.0021）¹¹。我们尝试在1,200倍放大倍数下选择精子头部无空泡的精子。该操作可能有助于选择精子DNA碎片化程度较低的精子¹²。因此，IMSI 可能是压电-ICSI 的一种新应用。

本文介绍了一种压电驱动的胞质内单精子注射（piezo-ICSI）方案，该方法可在不遗漏可存活卵母细胞的前提下，提高人类辅助生殖技术（ART）中ICSI的治疗效果。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
空气注射器	NARISHIGE CORPORATION	IM-12
压电驱动装置	PRIME TECH Ltd.	PMM4GD
微量移液管	PRIME TECH Ltd.	PINU06-20FT
操作液	3M	3M™ Noveck™
7% 聚乙烯吡咯烷酮即用型溶液	Cooper Surgical Inc.	ART-4005-A
缓冲培养基	Vitrolife	G-MOPS PLUS
玻璃底培养皿	NIPRO	87-453
倒置显微镜	OLYMPUS CORPORATION	IX-73