使用 Lucifer Yellow 离子电泳技术可视化星形胶质细胞形态

摘要

星形胶质细胞具有复杂的形态结构，表现为具有多个突起和密集的分布区域。为了分析其精细的形态特征，本文介绍了一种可靠的在轻度固定的组织中进行细胞内 Lucifer yellow 电泳标记的实验方案。

摘要

星形胶质细胞是神经回路中的重要组成部分。它们遍布整个中枢神经系统（CNS），参与多种功能，包括神经递质的清除、离子稳态调节、突触调控、为神经元提供代谢支持以及调节血流。星形胶质细胞是结构复杂的细胞，具有细胞体、若干主要分支以及大量精细的突起，这些突起与神经组织中的多种细胞成分相接触。为了评估星形胶质细胞的形态，必须具备一种可靠且可重复的方法来可视化其结构。本文报道了一种可靠的 实验方案，可在轻度固定的成年小鼠脑组织中，通过细胞内离子电泳将荧光染料荧光黄（Lucifer yellow, LY）导入星形胶质细胞。该方法具有多项有助于表征星形胶质细胞形态的特性。它能够实现单个星形胶质细胞的三维重建，从而便于对其结构的不同方面进行形态学分析。联合使用免疫组织化学与LY离子电泳技术，还可用于研究星形胶质细胞与神经系统中不同组分之间的相互作用，并检测标记的星形胶质细胞内特定蛋白的表达情况。该方案可应用于多种中枢神经系统疾病的小鼠模型，以利用光学显微镜严格地检测星形胶质细胞的形态变化。LY离子电泳为研究星形胶质细胞结构提供了一种实验手段，尤其适用于研究这些细胞在损伤或疾病状态下可能发生显著形态改变的情况。

引言

星形胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中最丰富的胶质细胞。它们在离子稳态、血流调节、突触形成与消除以及神经递质摄取等方面发挥重要作用¹。星形胶质细胞功能的多样性体现在其复杂的形态结构中^2,3。星形胶质细胞具有多个初级和次级分支，这些分支进一步分出成千上万更细的分支小枝和叶状突起，直接与突触、树突、轴突、血管以及其他胶质细胞相互作用。星形胶质细胞的形态在不同脑区之间存在差异，这可能提示其在神经环路中功能的区域特异性⁴。此外，已知星形胶质细胞在发育过程、生理状态以及多种疾病状态下均会发生形态改变^3,5,6。

为了准确解析星形胶质细胞形态的复杂性，需要一种一致且可重复的方法。传统上，免疫组织化学被用于通过星形胶质细胞特异性或富集性蛋白标记物来可视化星形胶质细胞。然而，这些方法揭示的是蛋白表达模式，而非星形胶质细胞的结构本身。常用的标记物，如胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和S100钙结合蛋白β（S100β），并不在整个细胞体积中表达，因此无法解析完整的形态结构

方案

本研究中的动物实验均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》进行，并经加州大学洛杉矶分校校长动物研究委员会批准。所有实验均使用成年小鼠（6−8 周龄），性别混合。

1. 溶液配制

1. 人工脑脊液（ACSF）溶液
   1. 每次实验前新鲜配制 ACSF 溶液（135 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM MgCl₂、14.7 mM NaHCO₃、11 mM D-葡萄糖、1.25 mM Na₂HPO₄ 和 2 mM CaCl₂）。MgCl₂ 和 CaCl₂ 在最后一步加入。将各组分溶解于高质量去离子水中。
   2. 实验前将 ACSF 溶液置于 35 °C 水浴中孵育，并用 95% O₂/5% CO₂ 气体饱和至少 30 分钟。
   3. 加入盐酸利多卡因至 ACSF 中，使其终浓度为 0.02%（每 100 mL 溶液中加入）。
2. 固定液溶液
   1. 使用 10% 磷酸盐缓冲甲醛溶液。
3. LY 染料溶液 ....

结果

本研究中报告的数据来自每项实验中4只小鼠的7−12个细胞。平均数据在相应的图示面板中给出。

为了评估星形胶质细胞的形态，我们采用细胞内离子电渗法，使用LY染料对海马CA1区辐射层中的星形胶质细胞进行填充，该过程如图1所示。图2展示了一个典型星形胶质细胞及其复杂的形态结构。该细胞经固定后，使用共聚焦激光扫描显微镜配备60倍油镜，以488 nm激光线进行成像（步长为0.3 µm，数字放大倍数为3.0−3.5倍）。通过调节共聚焦显微镜的光电倍增管（PMT）增益、偏移和增益功能，使最终图像具有较高的信噪比。在图2A中，来自不同z轴层面的单个光学切面图像（每隔10 µm显示一次，按顺序标记为1−6）显示了细胞中央的胞体以及几条主要分支，这些分支进一步延伸为致密的突起网络。通过生成最大强度投影（投影层厚为85 µm），我们获得了星形胶质细胞结构及其功能域的详细视图（图2B

讨论

本文所述方法介绍了一种通过在轻度固定的脑切片中对星形胶质细胞进行利索黄（LY）染料的细胞内离子电渗，以可视化其形态的技术。本实验方案强调了若干对成功实施LY离子电渗及细胞形态重建至关重要的因素。其一是图像的质量与可重复性，这主要取决于小鼠的年龄以及灌注效果。在本研究中，我们使用了6至8周龄的C57/BL6N小鼠。成功的灌注（高度依赖于灌注针的正确放置，表现为脑组织呈白色且脑血管中无血液残留）对于获得最清晰、染色最完整的细胞至关重要。当电极刺入细胞后，细胞膜应在电极尖端周围保持紧密封闭，防止染料外漏。尽管操作谨慎，在电极穿入脑组织过程中仍偶尔会染色到细胞外的其他结构：此类细胞将被排除在分析之外。电极的阻抗是另一个关键因素。较高的阻抗可确保在施加电压刺激时，染料从电极尖端稳定地释放。从技术角度而言，使用电极刺入细胞胞体时，应保持轻柔、缓慢的动作。若电极穿透细胞，可能导致染料从胞体泄漏。成功的刺入并施加电压后，染料应几乎立即充满细胞本体及其突起（即数秒内）。完全填充一个星形胶质细胞所需的时间与其所占区域大小相关；然而，应等待足够时间以确保细小突起也被完全染色（至少15分钟）。

我们发现该.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10% 磷酸盐缓冲福尔马林	Fisher	SF 100-20	可使用相同替代品
带Supor膜的Acrodisc注射器滤器	Pall	4692	可使用相同替代品
Ag/AgCl接地颗粒	WPI	EP2	可使用类似替代品
Alexa Fluor 546山羊抗鸡IgG（H+L）	Thermo Scientific	A-11040	可使用类似替代品
Alexa Fluor 647山羊抗兔IgG（H+L）	Thermo Scientific	A27040	可使用类似替代品
抗水通道蛋白-4抗体	Novus Biologicals	NBP1-87679	可使用类似替代品
抗GFAP抗体	Abcam	ab4674	可使用类似替代品
带细丝的硼硅酸盐玻璃移液管	World precision instruments	1B150F-4
C57BL/6NTac小鼠	Taconic Stock	B6	可使用类似替代品
氯化钙	Sigma	21108	可使用相同替代品
共聚焦激光扫描显微镜	Olympus	FV1000MPE	可使用类似替代品
D-葡萄糖	Sigma	G7528	可使用相同替代品
磷酸氢二钠	Sigma	255793	可使用相同替代品
电极拉制仪- P-97型	Sutter	P-97	可使用类似替代品
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01	可使用相同替代品
肝素钠注射液（每毫升1,000 USP单位）	Sagent Pharmaceuticals	400-10	可使用相同替代品
Imaris软件（版本7.6.5）	Bitplane Inc.		可使用类似替代品
异氟烷	Henry Schein Animal Health	29404	可使用相同替代品
盐酸利多卡因注射液（2%）	Clipper	1050035	可使用相同替代品
荧光黄CH二锂盐	Sigma	L0259
荧光黄CH二钾盐	Sigma	L0144
氯化镁	Sigma	M8266	可使用相同替代品
显微镜盖玻片	Thermo Scientific	24X60-1	可使用相同替代品
显微镜载玻片	Fisher	12-544-2	可使用相同替代品
正常山羊血清	Vector Laboratories	S-1000	可使用相同替代品
物镜（40倍）	Olympus	LUMPLFLN 40XW	可使用类似替代品
物镜（60倍）	Olympus	PlanAPO 60X	可使用类似替代品
PBS片剂，100 mL	VWR	VWRVE404	可使用相同替代品
移液管微操作仪- ROE-200型	Sutter	MP-285 / ROE-200 / MPC-200	可使用类似替代品
氯化钾	Sigma	P3911	可使用相同替代品
碳酸氢钠	Sigma	S5761	可使用相同替代品
氯化钠	Sigma	S5886	可使用相同替代品
刺激器- Omnical 2010型	World precision instruments	Omnical 2010	可使用类似替代品
Triton X-100	Sigma	T8787	可使用相同替代品
振动切片机- 3000型	Pelco	100-S	可使用类似替代品