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使用 Lucifer Yellow 离子电泳技术可视化星形胶质细胞形态

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DOI：

10.3791/60225

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2019年9月14日

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles, 2Department of Neurobiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles

本文内容

摘要

星形胶质细胞具有复杂的形态结构，表现为具有多个突起和密集的分布区域。为了分析其精细的形态特征，本文介绍了一种可靠的在轻度固定的组织中进行细胞内 Lucifer yellow 电泳标记的实验方案。

摘要

星形胶质细胞是神经回路中的重要组成部分。它们遍布整个中枢神经系统（CNS），参与多种功能，包括神经递质的清除、离子稳态调节、突触调控、为神经元提供代谢支持以及调节血流。星形胶质细胞是结构复杂的细胞，具有细胞体、若干主要分支以及大量精细的突起，这些突起与神经组织中的多种细胞成分相接触。为了评估星形胶质细胞的形态，必须具备一种可靠且可重复的方法来可视化其结构。本文报道了一种可靠的 实验方案，可在轻度固定的成年小鼠脑组织中，通过细胞内离子电泳将荧光染料荧光黄（Lucifer yellow, LY）导入星形胶质细胞。该方法具有多项有助于表征星形胶质细胞形态的特性。它能够实现单个星形胶质细胞的三维重建，从而便于对其结构的不同方面进行形态学分析。联合使用免疫组织化学与LY离子电泳技术，还可用于研究星形胶质细胞与神经系统中不同组分之间的相互作用，并检测标记的星形胶质细胞内特定蛋白的表达情况。该方案可应用于多种中枢神经系统疾病的小鼠模型，以利用光学显微镜严格地检测星形胶质细胞的形态变化。LY离子电泳为研究星形胶质细胞结构提供了一种实验手段，尤其适用于研究这些细胞在损伤或疾病状态下可能发生显著形态改变的情况。

引言

星形胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中最丰富的胶质细胞。它们在离子稳态、血流调节、突触形成与消除以及神经递质摄取等方面发挥重要作用1。星形胶质细胞功能的多样性体现在其复杂的形态结构中2,3。星形胶质细胞具有多个初级和次级分支，这些分支进一步分出成千上万更细的分支小枝和叶状突起，直接与突触、树突、轴突、血管以及其他胶质细胞相互作用。星形胶质细胞的形态在不同脑区之间存在差异，这可能提示其在神经环路中功能的区域特异性4。此外，已知星形胶质细胞在发育过程、生理状态以及多种疾病状态下均会发生形态改变3,5,6。

为了准确解析星形胶质细胞形态的复杂性，需要一种一致且可重复的方法。传统上，免疫组织化学被用于通过星形胶质细胞特异性或富集性蛋白标记物来可视化星形胶质细胞。然而，这些方法揭示的是蛋白表达模式，而非星形胶质细胞的结构本身。常用的标记物，如胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和S100钙结合蛋白β（S100β），并不在整个细胞体积中表达，因此无法解析完整的形态结构7。通过遗传学方法在星形胶质细胞中广泛表达荧光蛋白（如病毒注射或转基因小鼠报告基因品系），可以识别出更细微的分支结构和整体占据区域。然而，区分单个星形胶质细胞较为困难，且分析结果可能因特定启动子所靶向的星形胶质细胞亚群而产生偏差8。连续切片电子显微镜已被用于揭示星形胶质细胞突起与突触之间相互作用的详细图像。由于有成千上万的星形胶质细胞突起与突触接触，目前尚无法利用该技术重建完整的单个细胞9，尽管随着机器学习方法在数据分析中的应用，这一状况有望得到改变。

本报告中，我们重点介绍一种利用 Lucifer yellow（LY）染料进行细胞内离子电泳来表征小鼠星形胶质细胞的方法，并以 CA1 区辐射层为例进行说明。该方法基于 Eric Bushong 和 Mark Ellisman 早前的开创性工作10,11。通过轻度固定的脑切片识别星形胶质细胞，依据其独特的胞体形态，并将其填充 LY 染料。随后使用共聚焦显微镜对细胞成像。我们展示了如何利用 LY 离子电泳技术重建单个星形胶质细胞，并对其突起结构和支配区域进行详细的形态学分析。此外，该方法还可与免疫组织化学联合应用，以鉴定星形胶质细胞与神经元、其他胶质细胞以及脑血管系统之间的空间关系和相互作用。我们认为，LY 离子电泳是一种非常适合用于分析不同脑区以及健康或疾病状态下小鼠模型中细胞形态的工具7,12,13。 

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方案

本研究中的动物实验均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》进行，并经加州大学洛杉矶分校校长动物研究委员会批准。所有实验均使用成年小鼠（6−8 周龄），性别混合。

1. 溶液配制

  1. 人工脑脊液（ACSF）溶液
    1. 每次实验前新鲜配制 ACSF 溶液（135 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM MgCl2、14.7 mM NaHCO3、11 mM D-葡萄糖、1.25 mM Na2HPO4 和 2 mM CaCl2）。MgCl2 和 CaCl2 在最后一步加入。将各组分溶解于高质量去离子水中。
    2. 实验前将 ACSF 溶液置于 35 °C 水浴中孵育，并用 95% O2/5% CO2 气体饱和至少 30 分钟。
    3. 加入盐酸利多卡因至 ACSF 中，使其终浓度为 0.02%（每 100 mL 溶液中加入）。
  2. 固定液溶液
    1. 使用 10% 磷酸盐缓冲甲醛溶液。
  3. LY 染料溶液
    1. 将 LY CH 二锂盐或 LY CH 二钾盐溶解于 5 mM KCl 溶液中，配制成 1.5% 的 LY 染料溶液。充分涡旋混匀。1 mL 体积足以用于多次实验。
    2. 在 16,800 x g 条件下离心 10 分钟，然后用 0.2 µm 注射器滤器将上清液过滤至新离心管中。分装后可在 4 °C 保存长达 3 个月。
      注意：必须对染料溶液进行离心和过滤，以防止染料颗粒聚集，否则可能堵塞电极。

2. 小鼠经心灌注和脑组织分离

  1. 心脏灌注实验的设备与小鼠准备
    注意：    可使用任一性别的 C57/BL6 小鼠。经验表明，为确保方法的可靠性，小鼠年龄不应超过 3 个月（6−8 周龄最为理想）。以下描述了灌注方案。更多细节可参考额外提供的文献14。
    1. 用 ACSF 溶液冲洗灌注管路，以清除管路中的任何气泡。按使用顺序摆放手术器械（镊子、弯头钝头剪刀、虹膜剪刀）。
    2. 将异氟烷 2−3 mL 加入诱导室中，然后将小鼠放入异氟烷诱导室进行深度麻醉。等待 1−2 分钟使麻醉起效，并确保呼吸未停止。
    3. 检测趾夹反射。当小鼠对疼痛刺激无反应且反射消失时，即可继续操作。将动物仰卧位固定，头部置于供氧中含 5% 异氟烷的呼吸面罩下，四肢和尾巴用胶带固定于化学通风橱内。
  2. 经心脏灌注
    1. 用镊子提起肋骨下方的皮肤。使用弯头钝头剪刀在皮肤上做一条 5−6 cm 的切口，以暴露腹腔。向上剪开腹壁，直至可见肝脏和膈肌。
    2. 轻柔地将肝脏从膈肌处移开。使用虹膜剪刀在膈肌上做一条 3−4 cm 的侧向切口。
    3. 沿身体两侧剪开肋骨，以暴露胸腔。注意不要损伤心脏，避免触碰肺部。抬起胸骨以暴露心脏。
    4. 一旦心脏可见，立即向左心室注射 0.05 mL 肝素钠溶液（1,000 USP/mL）作为抗凝剂。随后，小心将灌注针插入左心室。确保针头停留在心室内，未穿透至其他心腔。用虹膜剪刀在右心房处做一个小切口。
    5. 以约 10 mL/min 的速度用 ACSF 溶液灌注，直至流出液中无血液（1−2 分钟）。
    6. 在不引入任何气泡的情况下，从 ACSF 溶液切换至固定液。以 10−20 mL/min 的速度继续用固定液灌注 10 分钟。
      注意：注意观察是否有固定液从鼻腔流出。若出现此现象，表明针头已进入右心室，导致固定液进入肺部，而非通过体循环输送到全身。
  3. 脑组织解剖
    1. 用剪刀取下小鼠头部，并小心地从颅骨中分离出小鼠脑组织。将脑组织置于固定液中，在室温下进行 1.5 小时的短期后固定。
      注意：良好的灌注是成功进行 LY 电泳的关键。脑组织应呈白色，脑血管中无残留血液。动物身体和四肢应呈现僵硬状态。

3. 切片制备

  1. 海马脑片的制备
    1. 用 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PBS）在室温下洗涤脑组织 5 分钟。然后用滤纸吸干脑组织，并用锋利的剃刀片切除嗅球和小脑。
    2. 使用氰基丙烯酸酯胶将脑组织固定在振动切片机载物盘上，并向载物盘中加入室温的 PBS。切割厚度为 110 µm 的海马冠状切片。
      注意：调整振动切片机的参数，以确保切片厚度一致且表面平整。本实验中使用的速度设置为 4.5，频率设置为 8，这些是仪器上的任意单位（材料表）。其他设备的使用者可能需要自行优化参数设置。
    3. 从载物盘中收集切片，并置于盛有冰上 PBS 的培养皿中。

4. 电极制备

  1. 准备一支具有合适电阻的尖锐电极。
    1. 使用带细丝的硼硅酸盐玻璃单管电极（外径 1.0 mm，内径 0.58 mm）。在微电极拉制仪上拉制电极（材料表）。当电极充满含 1.5% LY 的 5 mM KCl 溶液并置于 PBS 浴液中时，理想电极的电阻应为 200 MΩ。
      注意：拉制仪的参数设置因设备而异（所用仪器类型及拉制丝种类不同）。较高的加热设定通常会产生更长且更细的尖端。本实验所用微电极拉制仪的设置为：加热值：317，拉力：90，速度：70，延迟：70。使用槽型拉制丝。
    2. 将电极存放于密闭容器中，以防止灰尘进入尖端。存放时应使电极尖端悬空，避免接触盒底而导致破损。
  2. 用电极填充液（LY 染料溶液）填充电极。
    1. 将电极垂直放置，尖端朝下。用移液器向电极后端加入 1−2 µL LY 溶液，静置 5−10 分钟，使溶液通过毛细作用移至尖端。
    2. 将已填充的电极轻轻固定在与操纵器相连的电极夹持器中。
      注意：电极夹持器中的银丝必须与电极内部的 LY 溶液接触。根据银丝长度，必要时可调整 LY 溶液的填充量。

5. 通过离子电渗法填充星形胶质细胞

  1. 测试电极。
    1. 将脑片轻轻放入盛有0.1 M PBS的玻璃底培养皿中，室温下保存。用带有尼龙丝的铂金网格固定脑片位置。
    2. 确保电极已连接至电压源，并将接地电极置入盛有脑片的浴液中。
    3. 移动物镜至目标脑区。
    4. 将电极缓慢下放至溶液中。在明场下将其移至视野中央，并使用40倍水浸物镜仔细观察，确保电极清晰、无杂质或气泡。若电极尖端有堵塞，应更换为新电极。
      注意：200 MΩ电极易发生堵塞问题。每次实验前对染料溶液进行离心和过滤可有效减少该问题的发生频率。然而，由于电极尖端非常细小，组织碎片有时仍可能卡在开口处。目前尚未发现有效预防方法，但可通过更换新电极轻松解决。
    5. 在共聚焦激光扫描显微镜下使用488 nm激光观察电极尖端。随后开启刺激器（12 V）测试染料喷出情况。当刺激器开启时，应可见电极尖端周围出现明显的荧光染料云。若施加电压后无染料或仅有少量染料喷出，则需更换电极。
    6. 在明场下缓慢将电极向脑片方向下放，至刚好接触脑片表面之上方时停止。
  2. 通过离子电渗法填充星形胶质细胞。
    1. 使用红外差分干涉对比 (IR-DIC) 技术识别位于脑片表面下40−50 µm处的星形胶质细胞。寻找胞体呈细长椭圆形、直径约10 µm的细胞。选定一个星形胶质细胞后，将其移至视野中央。
      注意：适合进行离子电渗的细胞应具有清晰、明确的边界。避免选择过于靠近脑片表面的细胞，因其无法被完全填充。准确识别星形胶质细胞以进行染料填充需要数日练习。根据实验所用脑区的不同，星形胶质细胞的数量可能有所差异，这可能影响填充前识别细胞所需的时间。
    2. 缓慢将电极尖端插入脑片，穿过组织，直至与细胞胞体处于同一焦平面。
      注意：移动电极时应缓慢，以避免损伤组织。
    3. 当星形胶质细胞的胞体清晰可见且轮廓分明时，缓慢而轻柔地推进电极，直至电极尖端刺入细胞胞体。缓慢上下调节物镜焦距，确认电极是否已进入胞体内。
      注意：电极尖端必须进入细胞内部，并可在胞体上观察到轻微凹陷。切勿继续推进电极，以防尖端穿透细胞。
    4. 一旦电极尖端进入细胞内，开启刺激器（约0.5−1 V），持续向细胞内注入电流。利用共聚焦显微镜观察细胞填充过程。增加数字放大倍数以观察细胞细节，并确保电极尖端在细胞内清晰可见。
      注意：若观察到染料从细胞中泄漏，或邻近细胞也被填充，应降低电压。若染料仍持续外泄，应缓慢撤出电极并选择另一细胞。为获得最终图像中较高的信噪比，必须防止染料泄漏。
    5. 等待约15分钟，直至细胞的细小分支和突起结构清晰显现，关闭电压，轻柔地将电极尖端从细胞中撤出。
  3. 成像已填充的细胞。
    注意：    可在填充后立即进行成像，或在免疫组织化学染色后进行。使用数值孔径（NA）更高的物镜可获得更佳分辨率。
    1. 使用40倍物镜，在细胞恢复原始形态后（15−20分钟）开始成像。调整共聚焦显微镜设置，确保细胞的细小分支和突起结构清晰可辨。
    2. 设置z轴堆栈，步长为0.3 µm。成像过程中，移动物镜直至细胞信号消失，设为顶部；然后向下移动物镜（穿过细胞焦面），直至信号再次消失，设为底部。
    3. 完成成像后，检查电极的染料喷出情况。若出现明显的染料云，则可继续用于下一片脑片；否则应更换新电极。
      注意：单个星形胶质细胞的染料填充及成像过程约需45分钟至1小时。在本实验中，每只小鼠可获得约3−6个细胞。如有需要，可在同一脑片上标记多个细胞。但为区分单个星形胶质细胞，应确保细胞间距离约为200 µm。

6. 免疫组织化学染色（可选）

  1. 成像完成后，立即将脑片置于冰上的10%福尔马林中固定，以用于免疫组织化学实验。将脑片避光保存，并在4 °C下过夜。
  2. 用含0.5%非离子型表面活性剂（如Triton X-100）的0.1 M PBS缓冲液清洗脑片3次，每次5分钟。随后在室温下，以含0.5%非离子型表面活性剂和10%正常山羊血清（NGS）的0.1 M PBS缓冲液中封闭1小时，并轻轻振荡。
  3. 将脑片置于含0.5%非离子型表面活性剂和5% NGS的0.1 M PBS缓冲液中，加入一抗并轻轻振荡，于4 °C孵育2天。
    注意：由于脑片较厚，需延长一抗孵育时间以提高抗体渗透性，必要时可适当提高抗体浓度。本实验中，抗GFAP抗体和抗水通道蛋白-4（aquaporin-4）抗体均按1:500稀释使用。
  4. 用含0.5%非离子型表面活性剂的0.1 M PBS缓冲液清洗脑片3次，每次10分钟，随后加入二抗（溶于含0.5%非离子型表面活性剂和10% NGS的0.1 M PBS缓冲液中），室温孵育6小时。
    注意：应避免选择激发波长为488 nm的二抗，以免与LY染料的荧光信号重叠。本实验中，Alexa Fluor 546山羊抗鸡IgG（H+L）和Alexa Fluor 647山羊抗兔IgG（H+L）均按1:1,000稀释使用。
  5. 用0.1 M PBS缓冲液清洗脑片3次，每次10分钟。随后将脑片置于适合荧光成像的封片剂中，贴附于玻璃载玻片上，封片。以0.3 µm的步进厚度进行细胞成像。 

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结果

本研究中报告的数据来自每项实验中4只小鼠的7−12个细胞。平均数据在相应的图示面板中给出。

为评估星形胶质细胞的形态，我们采用 Lucifer Yellow（LY）染料进行细胞内离子电泳，以标记海马CA1区辐射层中的星形胶质细胞，该过程如图1所示。图2展示了一个典型星形胶质细胞及其复杂的形态结构。该细胞经固定后，使用共聚焦激光扫描显微镜配备60倍油镜，以488 nm激光激发（步长0.3 µm，数字放大倍数3.0−3.5倍）成像。通过调节共聚焦显微镜的光电倍增管（PMT）增益、偏移和增益功能，使最终图像具有较高的信噪比。在图2A中，不同z轴层面的单个光学切片图像（每隔10 µm显示一次，按1−6顺序标注）显示了细胞中央的胞体以及数条主要分支，这些分支进一步延伸为致密的突起网络。通过生成最大强度投影图像（叠加厚度85 µm），我们获得了星形胶质细胞结构及其功能域的详细视图（图2...

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讨论

本文所述方法介绍了一种通过在轻度固定的脑切片中对星形胶质细胞进行利索黄（LY）染料的细胞内离子电渗，以可视化其形态的技术。本实验方案强调了若干对成功实施LY离子电渗及细胞形态重建至关重要的因素。其一是图像的质量与可重复性，这主要取决于小鼠的年龄以及灌注效果。在本研究中，我们使用了6至8周龄的C57/BL6N小鼠。成功的灌注（高度依赖于灌注针的正确放置，表现为脑组织呈白色且脑血管中无血液残留）对于获得最清晰、染色最完整的细胞至关重要。当电极刺入细胞后，细胞膜应在电极尖端周围保持紧密封闭，防止染料外漏。尽管操作谨慎，在电极穿入脑组织过程中仍偶尔会染色到细胞外的其他结构：此类细胞将被排除在分析之外。电极的阻抗是另一个关键因素。较高的阻抗可确保在施加电压刺激时，染料从电极尖端稳定地释放。从技术角度而言，使用电极刺入细胞胞体时，应保持轻柔、缓慢的动作。若电极穿透细胞，可能导致染料从胞体泄漏。成功的刺入并施加电压后，染料应几乎立即充满细胞本体及其突起（即数秒内）。完全填充一个星形胶质细胞所需的时间与其所占区域大小相关；然而，应等待足够时间以确保细小突起也被完全染色（至少15分钟）。

我们发现该...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Soto 女士、Yu 博士和 Octeau 博士在实验指导以及文稿审阅方面提供的意见。本研究由 NS060677 项目资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10% 磷酸盐缓冲福尔马林FisherSF 100-20可使用相同替代品
带Supor膜的Acrodisc注射器滤器Pall4692可使用相同替代品
Ag/AgCl接地颗粒WPIEP2可使用类似替代品
Alexa Fluor 546山羊抗鸡IgG（H+L）Thermo ScientificA-11040可使用类似替代品
Alexa Fluor 647山羊抗兔IgG（H+L）Thermo ScientificA27040可使用类似替代品
抗水通道蛋白-4抗体Novus BiologicalsNBP1-87679可使用类似替代品
抗GFAP抗体Abcamab4674可使用类似替代品
带细丝的硼硅酸盐玻璃移液管World precision instruments1B150F-4
C57BL/6NTac小鼠Taconic StockB6可使用类似替代品
氯化钙Sigma21108可使用相同替代品
共聚焦激光扫描显微镜OlympusFV1000MPE可使用类似替代品
D-葡萄糖SigmaG7528可使用相同替代品
磷酸氢二钠Sigma255793可使用相同替代品
电极拉制仪- P-97型SutterP-97可使用类似替代品
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01可使用相同替代品
肝素钠注射液（每毫升1,000 USP单位）Sagent Pharmaceuticals400-10可使用相同替代品
Imaris软件（版本7.6.5）Bitplane Inc.可使用类似替代品
异氟烷Henry Schein Animal Health29404可使用相同替代品
盐酸利多卡因注射液（2%）Clipper1050035可使用相同替代品
荧光黄CH二锂盐SigmaL0259
荧光黄CH二钾盐SigmaL0144
氯化镁SigmaM8266可使用相同替代品
显微镜盖玻片Thermo Scientific24X60-1可使用相同替代品
显微镜载玻片Fisher12-544-2可使用相同替代品
正常山羊血清Vector LaboratoriesS-1000可使用相同替代品
物镜（40倍）OlympusLUMPLFLN 40XW可使用类似替代品
物镜（60倍）OlympusPlanAPO 60X可使用类似替代品
PBS片剂，100 mLVWRVWRVE404可使用相同替代品
移液管微操作仪- ROE-200型SutterMP-285 / ROE-200 / MPC-200可使用类似替代品
氯化钾SigmaP3911可使用相同替代品
碳酸氢钠SigmaS5761可使用相同替代品
氯化钠SigmaS5886可使用相同替代品
刺激器- Omnical 2010型World precision instrumentsOmnical 2010可使用类似替代品
Triton X-100SigmaT8787可使用相同替代品
振动切片机- 3000型Pelco100-S可使用类似替代品

参考文献

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