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方法文章

可视化与分析星形胶质细胞内细胞器及其他货物的胞内运输

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DOI：

10.3791/60230

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2019年8月28日

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种体外活体成像方法，用于可视化小鼠星形胶质细胞中细胞器的细胞内运输以及质膜蛋白的转运过程。该方案还提供了一种图像分析方法，用于确定货物运输的路径和动力学特征。

摘要

星形胶质细胞是成年大脑中最丰富的细胞类型之一，在多种生理功能中发挥关键作用。作为维持脑内环境稳态的核心参与者，星形胶质细胞为神经元提供重要的代谢物，并缓冲细胞外的水分、离子和谷氨酸。作为“三联突触”的重要组成部分，星形胶质细胞在突触的形成、修剪、维持和调节过程中也至关重要。为了实现这些高度交互的功能，星形胶质细胞通过多种特化的膜蛋白与自身、其他胶质细胞、神经元、脑血管系统以及细胞外环境进行通信，这些膜蛋白包括细胞黏附分子、水通道蛋白（aquaporins）、离子通道、神经递质转运体和缝隙连接分子。为了支持这种动态的物质运输，星形胶质细胞与神经元类似，依赖于高度协调且高效的细胞内运输系统。然而，与已被广泛研究的神经元细胞内运输不同， 基于微管的星形胶质细胞内运输研究相对较少。尽管如此，细胞膜蛋白的胞吐和胞吞运输以及细胞器的细胞内转运共同调控着星形胶质细胞的正常生物学功能，而这些过程在疾病状态或损伤响应中常常受到影响。本文介绍了一种简便的实验方案，用于培养高质量的小鼠星形胶质细胞，对感兴趣的星形胶质细胞蛋白和细胞器进行荧光标记，并利用延时共聚焦显微镜记录其细胞内运输动态。我们还展示了如何使用现有的图像分析软件（即 ImageJ/FIJI）插件从获取的视频中提取并量化相关的运输参数。

引言

星形胶质细胞是成年中枢神经系统中最丰富的细胞类型，具有独特的发育和稳态功能1。星形胶质细胞通过与突触前和突触后终末的直接接触，参与三联突触结构，调节突触发育；该结构包含神经递质受体、转运蛋白和细胞黏附分子，有助于突触形成以及神经元与星形胶质细胞之间的通讯2。此外，星形胶质细胞通过快速清除突触间隙中的兴奋性神经递质、回收神经递质以及参与突触修剪，主动调控突触传递并防止神经元兴奋性毒性3,4,5,6。为了实现这些高度交互的功能，星形胶质细胞通过特化的膜蛋白与其他星形胶质细胞、其他胶质细胞以及神经元进行通讯，这些膜蛋白包括细胞黏附分子、水通道蛋白、离子通道、神经递质转运蛋白和间隙连接分子。星形胶质细胞会根据其细胞内外环境的变化，主动调节这些蛋白在细胞表面的表达水平7。此外，线粒体、脂滴以及降解和回收细胞器的数量与分布变化，也调节着对星形胶质细胞功能和存活至关重要的能量供应、代谢物可及性以及细胞清除过程。

星形胶质细胞中膜蛋白和细胞器的运输与定位的动态变化依赖于运动蛋白及其衔接蛋白的协同作用，这些蛋白可促进货物的运动8,9。类似地，膜蛋白在细胞表面的水平通过内吞和再循环过程进行调控10。这些货物通过由肌动蛋白、微管以及可能存在的中间纤维构成的复杂网络进行运输8。基于对微管末端结合蛋白1（EB1）的免疫荧光染色研究显示，EB1富集于生长中的微管正端，提示在星形胶质细胞中，微管束从核周区域向外辐射，并将其正端延伸至细胞周边11。然而，目前仍缺乏利用活细胞成像技术对微管及其他细胞骨架元件的组织结构与极性进行系统性研究。尽管神经元及其他细胞类型中细胞器和膜蛋白动态变化的许多机制已被广泛研究，星形胶质细胞中的货物运输机制仍知之甚少。目前关于星形胶质细胞中蛋白和细胞器分布变化的大部分知识主要来源于对固定样本的传统抗体标记方法，该方法无法实现对货物动态过程的精确时空观察7,12。

本文介绍了一种用于高纯度原代小鼠星形胶质细胞培养物中活体成像的膜蛋白和细胞器标记方法。通过该实验方案，我们展示了在转染的星形胶质细胞中追踪绿色荧光蛋白（GFP）标记的膜蛋白动态定位的示例，包括缝隙连接蛋白 connexin 43（Cx43-GFP）和兴奋性氨基酸转运蛋白 1（EAAT1-GFP）。我们还描述了使用一种荧光酸性探针对酸性细胞器进行可视化，并追踪其在活体星形胶质细胞中的运输动态。最后，我们演示了如何分析延时成像数据，以提取并评估单个运输 cargo 的运输参数。

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方案

所有动物实验程序均经北卡罗来纳大学教堂山分校动物护理与使用委员会（IACUC）批准。

1. 小鼠原代星形胶质细胞的脑组织解剖与培养

注意：以下实验方案改编自已发表的方法，遵循McCarthy和deVellis最初建立的实验流程13,14,15。McCarthy/deVellis（MD）星形胶质细胞的混合细胞培养物来源于出生后第2至4天（P2−P4）小鼠大脑皮层，经抗有丝分裂因子处理后纯化，以获得最终富集的星形胶质细胞培养物。使用任一性别的新生小鼠，每四只小鼠的大脑皮层足以制备一罐T75组织培养瓶的细胞培养物。

  1. 使用多聚-D-赖氨酸（1 mg/mL 溶于 0.1 M Tris 缓冲液，pH 8.5）包被 T75 培养瓶底部（100% 倾斜颈设计，带 0.22 µm 疏水性通气滤盖），并在开始解剖前于 37 °C 孵育 24 小时。
  2. 在开始解剖操作前，将 30 mL 星形胶质细胞培养基（高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 [DMEM]，含 10% 热灭活胎牛血清，1% 青霉素/链霉素）于 37 °C 预热，并在冰上解冻一份 5 mL 的 2.5% 胰蛋白酶。准备两个盛有 6 mL 无 Ca2+ 和 Mg2+ 的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）的解剖皿（直径 60 mm），置于冰上备用。
  3. 每次解剖前及解剖之间，均需用 70% 乙醇对所有手术器械（细尖镊子、解剖剪、直头 Vannas 剪、带弯曲尖端的 Graefe 镊）进行消毒。
  4. 用 70% 乙醇喷洒 P2−P4 龄乳鼠的头部和颈部，随后使用手术剪快速断头处死。沿头皮正中线从后向前做一纵向切口以暴露颅骨，小心地从颈部向鼻部剪开颅骨。
  5. 在眼睛上方再做两个横向切口，使用细尖镊子轻轻将颅骨瓣向两侧翻起。取出脑组织并放入第一个盛有冰上预冷的无 Ca2+ 和 Mg2+ HBSS 的解剖皿中。保持解剖皿置于冰上，并继续收集其余脑组织。
    注意：后续所有解剖操作应在解剖显微镜下进行。
  6. 使用 Vannas 剪或细镊子去除嗅球（图 1Ai）。将弯曲尖端镊子置于横裂与大脑纵裂交界处，用另一对弯曲尖端镊子轻轻插入大脑皮层与间脑之间，缓慢张开镊子以分离大脑半球与其余脑组织（图 1Aii,Aiii），随后移除不需要的组织（图 1Aiv）。
  7. 对每个大脑半球，使用细尖镊子小心去除脑膜。可选择性地将海马体从皮层中分离。将解剖好的小鼠大脑皮层转移至第二个盛有冰上预冷的无 Ca2+ 和 Mg2+ HBSS 的解剖皿中，并在继续解剖其余脑组织时保持其处于冰上。
    注意：接下来的步骤应在超净台内的无菌条件下进行。
  8. 使用无菌锋利的手术剪或解剖刀将解剖所得的皮层组织切成小块（约 2−4 mm）。将组织转移至含有酶解液（22.5 mL 无 Ca2+ 和 Mg2+ HBSS，2.5 mL 2.5% 胰蛋白酶）的 50 mL 锥形管中，于 37 °C 孵育 30 分钟，每 10 分钟轻柔颠倒混匀一次。
  9. 以 300 x g 离心 5 分钟收集消化后的组织，倾去上清酶液（勿使用真空抽吸）。加入 10 mL 星形胶质细胞培养基，使用 10 mL 移液管反复吹打 20−30 次，使组织解离为单细胞悬液。
  10. 将细胞悬液通过 70 µm 细胞筛过滤，以减少细胞团块和未消化组织。将滤液收集至洁净的 50 mL 锥形管中，并用星形胶质细胞培养基调整总体积至 20 mL。此时可取 10 µL 细胞悬液与 10 µL 台盼蓝混合，使用血细胞计数板评估皮层组织解离效率。
    注意：四只 P2−P4 龄小鼠皮层组织一次制备可获得 10−15 x 106 个单细胞。
  11. 吸除 T75 培养瓶中的多聚-D-赖氨酸包被液，用无菌水洗涤两次。将 20 mL 细胞悬液接种至培养瓶中，于 37 °C、5% CO2 条件下培养。

2. 星形胶质细胞培养物的纯化与维持

注意：所有培养基更换操作均须在层流罩内无菌条件下进行，并使用经无菌过滤（0.22 µm 滤膜）且预热至 37 °C 的星形胶质细胞培养基。

  1. 铺板后 48 小时（体外培养第 2 天，DIV2）更换细胞培养基。
  2. 在 DIV5 时，将培养基更换为新鲜的星形胶质细胞培养基，并添加 10 µM 阿糖胞苷（AraC）。
    注意：此步骤有助于去除污染细胞，包括成纤维细胞和其他胶质细胞。必须注意，AraC 处理时间不得超过 48 小时，因为更长的孵育时间会降低星形胶质细胞的存活率。
  3. 在 DIV7 时，更换为不含 AraC 的星形胶质细胞培养基，并开始每日检查培养融合度。当细胞融合度达到 80% 时，使用多聚-D-赖氨酸包被两个 T75 培养瓶（每个未纯化的星形胶质细胞培养瓶对应两个），并在 37 °C 下孵育至少 8 小时至过夜。
  4. 次日，开始进行星形胶质细胞纯化：将培养瓶置于 37 °C 摇床培养箱中，以 180 rpm 振荡 30 分钟。移除培养基并更换为新鲜的星形胶质细胞培养基。随后在 37 °C 摇床培养箱中以 240 rpm 振荡 6 小时。在振荡结束前 20–30 分钟，预热 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）、星形胶质细胞培养基和 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 至 37 °C。
    注意：CO2 培养在振荡步骤中不需要。如有需要，30 分钟和 6 小时振荡后收集的培养基可分别用于培养小胶质细胞和少突胶质细胞。然而，混合培养物经 AraC 处理后，其他胶质细胞的数量将减少。
  5. 从摇床取下培养瓶，立即用每瓶 10 mL 预热的 1× PBS 更换培养基。移除 PBS 后，每瓶加入 3 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA。在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育，每 5 分钟检查一次细胞脱落情况。
  6. 待细胞从瓶壁脱落之后，加入 10 mL 星形胶质细胞培养基终止胰蛋白酶消化。将脱落的星形胶质细胞转移至 50 mL 圆底离心管中，在 300 × g 条件下离心 5 分钟以收集细胞沉淀。吸除上清液，并用 40 mL 星形胶质细胞培养基重悬细胞。
  7. 用无菌水将包被有多聚-D-赖氨酸的 T75 培养瓶清洗两次，接种 20 mL 纯化的星形胶质细胞悬液。放回 37 °C 和 5% CO2 培养箱中。此后每两天更换一次星形胶质细胞培养基，持续 10 天，直至星形胶质细胞成熟。
    注意：每个纯化的星形胶质细胞 T75 培养瓶应足以在传代时产生两个新的 T75 培养瓶，每瓶接种 3 × 105 个细胞。
  8. 如需进行后续传代或为显微镜观察接种星形胶质细胞，请重复步骤 2.5–2.7。
    注意：加入 AraC 并完成纯化后，星形胶质细胞培养物的纯度可通过明场显微镜进行定性评估，或更精确地通过荧光图像中每视野内胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性细胞所占百分比进行定量分析（图 1B,C）。

3. 转染荧光标记的质粒

  1. 转染或标记前一日，以成像所需的密度接种星形胶质细胞，使其在转染后24−48小时进行成像。建议在24孔板或14 mm玻璃底孔板上的接种密度为每孔2 × 104个细胞。
    注意：本方案针对在24孔板中铺有12 mm玻璃盖玻片或14 mm玻璃底孔板上的星形胶质细胞，采用脂质体转染法进行优化。应根据星形胶质细胞所处培养皿的尺寸相应调整试剂用量。
  2. 将脂质体转染试剂（材料表）用低血清培养基（材料表）稀释。为优化脂质体转染试剂与DNA的比例，应测试一系列合适的稀释浓度。例如，若使用本方案中所用的试剂（材料表），则将2、3、4和5 μL脂质体转染试剂分别加入50 μL低血清培养基中进行稀释。
  3. 将5 μg高纯度DNA溶于250 μL低血清培养基中，加入5 μL脂质体转染增强试剂（材料表）。将含有脂质体转染试剂的管与等体积的DNA-转染增强试剂混合液合并，通过移液混匀，并在室温（RT）下孵育15分钟。
  4. 移除星形胶质细胞的培养基，将转染混合液（步骤3.3）逐滴加入细胞中。在37 °C、5% CO2条件下孵育6小时后，更换为适量的星形胶质细胞培养基（14 mm玻璃底培养皿每孔加2 mL）。继续孵育24−72小时后再进行图像采集。应密切监控孵育时间，以在蛋白表达水平与细胞活力之间达到最佳平衡。

4. 使用荧光探针标记晚期内体/溶酶体

注意：某些货物可通过使用对货物特异性蛋白具有高亲和力的荧光染料进行标记。以下示例允许使用荧光酸性探针标记晚期内体/溶酶体。

  1. 将溶酶体标记探针（材料表）用200 µL星形胶质细胞培养基稀释至1 μM的工作浓度，并加入步骤3.1中密度为2 × 104 个细胞/孔的星形胶质细胞中。在37 °C下孵育30分钟。
  2. 用预温的星形胶质细胞培养基洗涤细胞一次，更换为成像培养基（材料表），立即进行活细胞成像。

5. 使用延时成像系统进行图像采集

注意：延时活体成像应使用配备高速相机、定焦系统、培养箱以及高数值孔径（例如 Plan-Apochromat 1.4NA）的40倍油镜物镜的荧光显微镜进行。目前有多种可用于延时成像的采集软件。显微系统和采集软件的选择应基于其可及性以及对特定研究目标的适用性。以下提供一些通用指南。

  1. 将培养皿或培养腔室放置在显微镜载物台的合适适配器上。使用落射荧光光源，选择表达荧光蛋白或探针的细胞进行记录。调节荧光样品的照明强度，通过数字相机清晰观察所选细胞。避免使用过强的照明，以防发生光漂白和光毒性。调整焦距和放大倍数。
  2. 使用变焦和定焦功能，以每2秒采集1帧的频率，获取单个Z轴层扫的时间序列图像，总时长在300秒至500秒之间。
    注意：运输动力学参数（如运动速度、运动频率等）会因目标蛋白的不同而有所差异，因此采集的时间进程可能需要相应调整。例如，线粒体的运动性低于溶酶体，且常出现暂停现象。在此情况下，更合适的采集参数为每5秒采集1帧，持续800秒。
  3. 保存时间序列图像，并将其导出为AVI或TIFF序列文件。

6. 图像分析

注意：图像分析使用 ImageJ/Fiji 的 KymoToolBox 插件进行16。详细的分步书面说明可在线获取17。以下简要步骤足以生成kymograph并提取颗粒运输参数。

  1. 在 ImageJ/Fiji 软件中打开延时图像序列。通过 文件 菜单导入 AVI 或 TIFF 堆栈文件。使用 图像 菜单中的 类型 工具，将图像转换为 8 位或 16 位。若处理 RGB 文件，使用 图像 菜单下 颜色 功能中的 拆分通道 工具分离通道。
  2. 为生成线扫图（即粒子轨迹在位置与时间上的表征），使用 分段线 工具沿粒子运动轨迹绘制每条路径。为准确指定运动方向性，对所有视频采用一致的方向设定绘制折线，确保在单个细胞内及不同细胞间极性一致。例如，从细胞中心向边缘绘制，或反之。通过双击 直线 工具调整线宽，使其与轨迹厚度匹配。
  3. 运行 KymoToolBox 插件中的 Draw Kymo 宏，设置线宽为 10。系统将提示校准图像的时间（帧数、帧率）和空间（x,y 分辨率）参数。校准完成后，生成线扫图，可保存为 TIFF 文件用于数据展示或进一步的粒子分析。
  4. 通过在 kymograph 上使用 分段线 工具手动追踪每个粒子的完整运动过程，分配粒子轨迹。使用 分析/工具 菜单中的 ROI 管理器 工具将每条粒子轨迹记录为感兴趣区域（ROI）。为每个延时视频保存所有 ROI 以供后续分析。
    注意：为获得最准确的运输参数计算结果，必须在线扫图上正确分配单个粒子的轨迹。
    1. 运行 KymoToolBox 插件的 Analyze Kymo 宏。将弹出窗口，要求从下拉菜单中定义粒子运动的"外向"方向（从左到右或反之）。该选择取决于荧光 cargo 相对于细胞核或细胞边缘的成像位置，如步骤 6.2 所确定。例如，若细胞核位于 cargo 左侧，且步骤 6.2 中的折线是远离细胞核绘制的，则应将外向运动定义为"从左到右"。
    2. 在 Analyze Kymo 窗口中定义极限速度（即认定 cargo 为运动状态的最低速度）。对于以快速胞内运输速度移动的 cargo，0.1 µm/秒是合适的选择。可根据具体 cargo 调整该值以优化软件的检测灵敏度。同时调整线宽以匹配每条粒子轨迹的厚度。
    3. 在 Analyze kymo 窗口中选择 记录所有数据 和 记录外推坐标 选项。该操作将计算多种 cargo 运输参数，包括平均速度、内向速度、外向速度、总移动距离、内向或外向移动距离、每个粒子的方向转换次数、在各方向移动或暂停的时间百分比等。单个轨迹的计算数据将按线扫图汇总，并保存为对应每幅图像的文本文件。
      注意：Analyze Kymo 宏的 显示彩色线扫图 选项会在原始线扫图上生成路径的颜色编码叠加：外向运动粒子为绿色，内向为红色，静止粒子为蓝色。Analyze Kymo 宏的 在原始堆栈上报告坐标 选项会在原始延时视频和线扫图上生成外推物体位置的颜色编码叠加。

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结果

上述建立原代小鼠MD星形胶质细胞的方案应能获得可重复且高质量的细胞培养物。尽管培养初期含有星形胶质细胞、成纤维细胞以及其他胶质细胞（包括小胶质细胞和少突胶质细胞）（图1Bi,Biv；红色箭头），但在DIV5至DIV7期间向混合培养物中添加阿糖胞苷（AraC）可最大限度地抑制这些污染细胞的增殖。结合AraC处理与基于振荡的纯化策略，相较于仅包含纯化步骤的传统方案（图1Bv；蓝色箭头），可显著提高星形胶质细胞培养物的纯度（图1Bii）13。经AraC处理或未处理的纯化星形胶质细胞培养物的预期形态和组成（通过GFAP和4',6-二脒基-2-苯基吲哚[DAPI]染色评估）如图1Biii,Bvi所示。每视野中GFAP+<...

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讨论

本文介绍了一种实验方法，用于在高纯度原代小鼠皮层髓样星形胶质细胞中，通过延时视频显微镜技术表达、观察和追踪荧光标记的细胞器及膜蛋白。我们还概述了测量颗粒动态的方法。在原代星形胶质细胞中直接观察蛋白质和细胞器的动态过程，为体外研究这些细胞中细胞内运输调控机制提供了有力工具。

上述建立小鼠MD星形胶质细胞培养物的方法结合了其他已发表方案中的步骤13,14,15，从而实现了更简便的操作流程，并获得了更高纯度和质量的细胞培养物。阿糖胞苷（AraC）15处理与基于振荡的纯化方法13,14相结合，可获得纯度高达98%的星形胶质细胞培养物（通过GFAP+细胞占总细胞的比例评估），在本示例中，相较于仅进行纯化步骤的培养物，纯度提...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

DNL 得到了北卡罗来纳大学教堂山分校（UNC）医学院 Simmons 学者项目的资助。TWR 得到了 UNC PREP 项目基金 R25 GM089569 的支持。使用北卡罗来纳大学神经科学中心显微成像核心设施的工作部分得到了美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所（NIH-NINDS）神经科学中心支持基金 P30 NS045892 和美国国立卫生研究院儿童健康与人类发育研究所（NIH-NICHD）智力与发育障碍研究中心支持基金 U54 HD079124 的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2.5% 胰蛋白酶 (10x)Gibco15090-046
台式离心机Thermo Scientific75-203-637Sorvall ST8 离心机
细胞培养级水Gen Clone25-511
细胞培养显微镜ZeissWSN-AXIOVERT A1Vert.A1 倒置显微镜，具有荧光功能的倒置组织培养显微镜
阿糖胞苷SigmaC1768-100MG(AraC) 将冻干粉末溶于无菌细胞培养级水中，配制成 10 mM 储存液，分装后冷冻长期保存
DAPISigmaD9542-5MG将冻干粉末溶于去离子水中，最高浓度为 20 mg/ml，必要时加热或超声处理。用于复染时浓度为 300 nM
解剖显微镜ZeissStemi 305
解剖剪F.S.T14558-09
杜尔贝科改良伊格尔培养基Gen Clone25-500
胎牛血清Gemini100-106经热灭活
FIJI（Fiji 即 Image J）NIHVersion 1.52i
细尖镊子F.S.T11254-20型号 #5
荧光光源Excelitas012-63000X-Cite 120Q
GFAP 抗体Cell Signaling3670SGFAP (GA5) 小鼠单克隆抗体
玻璃底培养皿Mattek corporationP35G-1.5-14-C35 mm 培养皿 | No. 1.5 盖玻片 | 14 mm 玻璃直径 | 未包被
Graefe 镊子F.S.T11054-10带弯曲尖端的 Graefe 虹膜镊
可染色酸性区室（晚期内体和溶酶体）的绿色荧光染料Life TechnologiesL7526LysoTracker Green DND 26。已溶于 DMSO 配制成 1 mM 储存液。使用时用选定的生长培养基或缓冲液稀释至终工作浓度。
汉克平衡盐溶液 (10x)Gibco14065-056不含镁和钙
成像培养基Life TechnologiesA14291DJ活细胞成像溶液
倒置共聚焦显微镜ZeissLSM 780
KymoToolBoxhttps://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox
脂质体转染增强试剂Life Technologies11514015Plus 试剂
脂质体转染试剂Life Technologies15338100Lipofectamine LTX 试剂
轨道摇床培养箱New Brunswick Scientific8261-30-1008Innova 4230，带温度和转速控制的轨道摇床培养箱
青霉素/链霉素溶液 (100x)Gen Clone25-512
磷酸盐缓冲液 (10x)Gen Clone25-507x
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐SigmaP7405溶于 pH 8.5 的 Tris 缓冲液中，浓度为 1 mg/mL。冷冻长期保存，避免反复冻融
低血清培养基Gibco31985-062OPTI-MEM
组织培养瓶Olympus Plastics25-20975 cm²，100% 倾斜颈设计，带 0.22 µm 疏水通气滤膜盖
组织培养箱Thermo Scientific51030285HERAcell VIOS 160i，带温度、湿度和 CO₂ 控制的组织培养箱
Tris-BaseSigmaT15038.402 g 溶于水中并加入 4.829 g Tris HCl 定容至 1 L，配制成 0.1 M Tris 缓冲液，pH 8.5
Tris-HClSigmaT32534.829 g 溶于水中并加入 8.402 g Tris Base 定容至 1 L，配制成 0.1 M Tris 缓冲液，pH 8.5
胰蛋白酶-EDTA (0.25%)，含酚红Gibco25200072
真空驱动过滤系统Olympus Plastics25-227500 ml，PES 膜，0.22 µm
直型 Vannas 剪RobozRS-5620

参考文献

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