可视化与分析星形胶质细胞内细胞器及其他货物的胞内运输

摘要

本文介绍了一种体外活体成像方法，用于可视化小鼠星形胶质细胞中细胞器的细胞内运输以及质膜蛋白的转运过程。该方案还提供了一种图像分析方法，用于确定货物运输的路径和动力学特征。

摘要

星形胶质细胞是成年大脑中最丰富的细胞类型之一，在多种生理功能中发挥关键作用。作为维持脑内环境稳态的核心参与者，星形胶质细胞为神经元提供重要的代谢物，并缓冲细胞外的水分、离子和谷氨酸。作为“三联突触”的重要组成部分，星形胶质细胞在突触的形成、修剪、维持和调节过程中也至关重要。为了实现这些高度交互的功能，星形胶质细胞通过多种特化的膜蛋白与自身、其他胶质细胞、神经元、脑血管系统以及细胞外环境进行通信，这些膜蛋白包括细胞黏附分子、水通道蛋白（aquaporins）、离子通道、神经递质转运体和缝隙连接分子。为了支持这种动态的物质运输，星形胶质细胞与神经元类似，依赖于高度协调且高效的细胞内运输系统。然而，与已被广泛研究的神经元细胞内运输不同， 基于微管的星形胶质细胞内运输研究相对较少。尽管如此，细胞膜蛋白的胞吐和胞吞运输以及细胞器的细胞内转运共同调控着星形胶质细胞的正常生物学功能，而这些过程在疾病状态或损伤响应中常常受到影响。本文介绍了一种简便的实验方案，用于培养高质量的小鼠星形胶质细胞，对感兴趣的星形胶质细胞蛋白和细胞器进行荧光标记，并利用延时共聚焦显微镜记录其细胞内运输动态。我们还展示了如何使用现有的图像分析软件（即 ImageJ/FIJI）插件从获取的视频中提取并量化相关的运输参数。

引言

星形胶质细胞是成年中枢神经系统中最丰富的细胞类型，具有独特的发育和稳态功能¹。星形胶质细胞通过与突触前和突触后终末的直接接触，参与三联突触结构，调节突触发育；该结构包含神经递质受体、转运蛋白和细胞黏附分子，有助于突触形成以及神经元与星形胶质细胞之间的通讯²。此外，星形胶质细胞通过快速清除突触间隙中的兴奋性神经递质、回收神经递质以及参与突触修剪，主动调控突触传递并防止神经元兴奋性毒性^3,4,5,6。为了实现这些高度交互的功能，星形胶质细胞通过特化的膜蛋白与其他星形胶质细胞、其他胶质细胞以及神经元进行通讯，这些膜蛋白包括细胞黏附分子、水通道蛋白、离子通道、神经递质转运蛋白和间隙连接分子。星形胶质细胞会根据其细胞内外环境的变化，主动调节这些蛋白在细胞表面的表达水平⁷。此外，线粒体、脂滴以及降解和回收细胞器的数量与分布变化，也调节着对星形胶质细胞功能和存活至关重要的能量供应、代谢物可及性以及细胞清除过程。

星形胶质细胞中膜蛋白和细胞器的运输与定位的动态变化依赖于运动蛋白及其衔接蛋白的协同作....

方案

所有动物实验程序均经北卡罗来纳大学教堂山分校动物护理与使用委员会（IACUC）批准。

1. 小鼠原代星形胶质细胞的脑组织解剖与培养

注意：以下实验方案改编自已发表的方法，遵循McCarthy和deVellis最初建立的实验流程^13,14,15。McCarthy/deVellis（MD）星形胶质细胞的混合细胞培养物来源于出生后第2至4天（P2−P4）小鼠大脑皮层，经抗有丝分裂因子处理后纯化，以获得最终富集的星形胶质细胞培养物。使用任一性别的新生小鼠，每四只小鼠的大脑皮层足以制备一罐T75组织培养瓶的细胞培养物。

1. 使用多聚-D-赖氨酸（1 mg/mL 溶于 0.1 M Tris 缓冲液，pH 8.5）包被 T75 培养瓶底部（100% 倾斜颈设计，带 0.22 µm 疏水性通气滤盖），并在开始解剖前于 37 °C 孵育 24 小时。
2. 在开始解剖操作前，将 30 mL 星形胶质细胞培养基（高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 [DMEM]，含 10% 热灭活胎牛血清，1% 青霉素/链霉素）于 37 °C 预热，并在冰上解冻一份 5 mL 的 2.5% 胰蛋白酶。准备两个盛有 6 mL 无....

结果

上述建立原代小鼠MD星形胶质细胞的方案应能获得可重复且高质量的细胞培养物。尽管培养初期含有星形胶质细胞、成纤维细胞以及其他胶质细胞（包括小胶质细胞和少突胶质细胞）（图1Bi,Biv；红色箭头），但在DIV5至DIV7期间向混合培养物中添加阿糖胞苷（AraC）可最大限度地抑制这些污染细胞的增殖。结合AraC处理与基于振荡的纯化策略，相较于仅包含纯化步骤的传统方案（图1Bv；蓝色箭头），可显著提高星形胶质细胞培养物的纯度（图1Bii）¹³。经AraC处理或未处理的纯化星形胶质细胞培养物的预期形态和组成（通过GFAP和4',6-二脒基-2-苯基吲哚[DAPI]染色评估）如图1Biii,Bvi所示。每视野中GFAP^+<.......

讨论

本文介绍了一种实验方法，用于在高纯度原代小鼠皮层髓样星形胶质细胞中，通过延时视频显微镜技术表达、观察和追踪荧光标记的细胞器及膜蛋白。我们还概述了测量颗粒动态的方法。在原代星形胶质细胞中直接观察蛋白质和细胞器的动态过程，为体外研究这些细胞中细胞内运输调控机制提供了有力工具。

上述建立小鼠MD星形胶质细胞培养物的方法结合了其他已发表方案中的步骤^13,14,15，从而实现了更简便的操作流程，并获得了更高纯度和质量的细胞培养物。阿糖胞苷（AraC）¹⁵处理与基于振荡的纯化方法^13,14相结合，可获得纯度高达98%的星形胶质细胞培养物（通过GFAP⁺细胞占总细胞的比例评估），在本示例中，相较于仅进行纯化步骤的培养物，纯度提.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2.5% 胰蛋白酶 (10x)	Gibco	15090-046
台式离心机	Thermo Scientific	75-203-637	Sorvall ST8 离心机
细胞培养级水	Gen Clone	25-511
细胞培养显微镜	Zeiss	WSN-AXIOVERT A1	Vert.A1 倒置显微镜，具有荧光功能的倒置组织培养显微镜
阿糖胞苷	Sigma	C1768-100MG	(AraC) 将冻干粉末溶于无菌细胞培养级水中，配制成 10 mM 储存液，分装后冷冻长期保存
DAPI	Sigma	D9542-5MG	将冻干粉末溶于去离子水中，最高浓度为 20 mg/ml，必要时加热或超声处理。用于复染时浓度为 300 nM
解剖显微镜	Zeiss		Stemi 305
解剖剪	F.S.T	14558-09
杜尔贝科改良伊格尔培养基	Gen Clone	25-500
胎牛血清	Gemini	100-106	经热灭活
FIJI（Fiji 即 Image J）	NIH	Version 1.52i
细尖镊子	F.S.T	11254-20	型号 #5
荧光光源	Excelitas	012-63000	X-Cite 120Q
GFAP 抗体	Cell Signaling	3670S	GFAP (GA5) 小鼠单克隆抗体
玻璃底培养皿	Mattek corporation	P35G-1.5-14-C	35 mm 培养皿 | No. 1.5 盖玻片 | 14 mm 玻璃直径 | 未包被
Graefe 镊子	F.S.T	11054-10	带弯曲尖端的 Graefe 虹膜镊
可染色酸性区室（晚期内体和溶酶体）的绿色荧光染料	Life Technologies	L7526	LysoTracker Green DND 26。已溶于 DMSO 配制成 1 mM 储存液。使用时用选定的生长培养基或缓冲液稀释至终工作浓度。
汉克平衡盐溶液 (10x)	Gibco	14065-056	不含镁和钙
成像培养基	Life Technologies	A14291DJ	活细胞成像溶液
倒置共聚焦显微镜	Zeiss		LSM 780
KymoToolBox			https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox
脂质体转染增强试剂	Life Technologies	11514015	Plus 试剂
脂质体转染试剂	Life Technologies	15338100	Lipofectamine LTX 试剂
轨道摇床培养箱	New Brunswick Scientific	8261-30-1008	Innova 4230，带温度和转速控制的轨道摇床培养箱
青霉素/链霉素溶液 (100x)	Gen Clone	25-512
磷酸盐缓冲液 (10x)	Gen Clone	25-507x
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐	Sigma	P7405	溶于 pH 8.5 的 Tris 缓冲液中，浓度为 1 mg/mL。冷冻长期保存，避免反复冻融
低血清培养基	Gibco	31985-062	OPTI-MEM
组织培养瓶	Olympus Plastics	25-209	75 cm²，100% 倾斜颈设计，带 0.22 µm 疏水通气滤膜盖
组织培养箱	Thermo Scientific	51030285	HERAcell VIOS 160i，带温度、湿度和 CO₂ 控制的组织培养箱
Tris-Base	Sigma	T1503	8.402 g 溶于水中并加入 4.829 g Tris HCl 定容至 1 L，配制成 0.1 M Tris 缓冲液，pH 8.5
Tris-HCl	Sigma	T3253	4.829 g 溶于水中并加入 8.402 g Tris Base 定容至 1 L，配制成 0.1 M Tris 缓冲液，pH 8.5
胰蛋白酶-EDTA (0.25%)，含酚红	Gibco	25200072
真空驱动过滤系统	Olympus Plastics	25-227	500 ml，PES 膜，0.22 µm
直型 Vannas 剪	Roboz	RS-5620