本方案介绍了一种光斑检测法，用于研究黑腹果蝇（Drosophila）幼虫的趋光行为。在该检测中，通过产生一个光斑作为光刺激，利用基于红外光的成像系统记录幼虫避光过程。
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摘要
摘要
Drosophila melanogaster 幼虫在觅食阶段表现出明显的避光行为。Drosophila 幼虫的趋光性可作为研究动物回避行为的模型。本实验方案介绍了一种光斑检测方法，用于研究幼虫的趋光行为。实验装置主要包括两个部分：一个产生光斑的视觉刺激系统，以及一个基于红外光的成像系统，用于记录幼虫避光过程。该检测方法可追踪幼虫进入、接触及离开光斑前后的行为，包括减速、停顿、头部摆动和转向等运动细节，均可通过此方法进行捕捉和分析。
引言
Drosophila melanogaster 的幼虫在觅食阶段表现出明显的避光行为。Drosophila 幼虫的趋光性长期以来一直是研究对象，尤其是在过去50年中1,2,3,4,5,6,7,8。近年来，尽管1）已鉴定出许多介导幼虫避光行为的神经元4,5,9,10,11,12，且2）幼虫视觉系统的全连接组已在突触分辨率水平上建立13，但幼虫趋光性的神经机制仍远未明确。
已有多种行为学实验方法用于研究幼虫的趋光性。这些方法大致可分为两类：一类涉及空间光梯度，另一类涉及时间光梯度。在空间光梯度实验中，实验区域被均分为光照区和黑暗区。实验区域可被分为明暗两半2,4，或明暗四象限14,15，甚至可分割成类似棋盘格的交替明暗方格7。通常使用琼脂平板进行空间光梯度实验，但也可使用被分割为交替明暗区段的试管10,14。
在早期版本的实验中，光照通常来自幼虫的下方。然而，在较新版本的实验中，光照主要来自上方，因为幼虫的眼睛（例如对低或中等光强敏感的博尔维格器官16）位于不透明的头咽骨架内，其开口朝向前上方。这使得幼虫对来自前上方的光线比来自后下方的光线更为敏感7。在时间光梯度实验中，实验区域内的光强在空间上是均匀的，但光强随时间变化。除了使用时间上的方波光照（即闪烁的开/关或强/弱光照3,7）外，还采用光强呈线性斜坡变化的时变光照8，以测量幼虫对随时间变化的光刺激的敏感性。
第三种趋光性检测方法是定向光梯度导航实验，该方法采用与垂直方向成45°角的上方光源进行照射7。在Kane等人7的研究之前，幼虫趋光性实验中仅能计算一些粗略的参数，例如处于明区和暗区的幼虫数量、转向频率以及运动轨迹长度。自该研究团队利用高时间分辨率视频记录分析幼虫趋光行为以来，现已能够对幼虫在趋光过程中的运动细节进行分析（例如幼虫身体不同部位的瞬时速度、运动方向、转向角度及其相应的角速度）7。因此，研究人员得以揭示幼虫趋光行为的更多细节。在这些实验中，幼虫以群体形式进行测试，因而未排除群体效应的影响。
本方案介绍了一种用于研究幼虫对单个光刺激行为反应的光斑检测方法。主要实验装置包括视觉刺激系统和基于红外光的成像系统。在视觉刺激系统中，一个LED光源在放置幼虫的琼脂平板上产生一个直径为2 cm的圆形光斑。通过LED驱动器可调节光强度。成像系统包含一个红外相机，用于记录幼虫的行为，以及三个波长为850 nm的红外LED，为相机提供照明。相机镜头覆盖有850 nm带通滤光片，以阻止来自视觉刺激系统的光进入相机，同时允许红外光通过。因此，可避免视觉刺激对成像的干扰。在本检测中，记录并分析单个幼虫在进入光斑前、期间及之后一段时间内的快速反应行为细节。
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方案
1. 准备 黑腹果蝇 幼虫
- 配制标准培养基，包含煮沸的玉米粉（73 g）、琼脂（5.6 g）、豆粕（10 g）、酵母（17.3 g）、糖浆（76 mL）和水（1000 mL）。
- 将所有果蝇置于25 °C、12小时光照/12小时黑暗循环的环境中，在标准培养基上进行培养。
2. 琼脂平板的制备
- 配制1.0%的琼脂溶液。用天平称取3 g琼脂放入500 mL烧杯中，加入300 mL蒸馏水。用铝箔纸覆盖烧杯口以防止水分蒸发。将烧杯放入微波炉中加热至沸腾。
- 取出烧杯，用玻璃棒充分搅拌，再放入微波炉中加热至沸腾。重复此步骤，直至液体完全透明且呈流动状态。
注意：最终的热琼脂溶液应无气泡；否则，将琼脂倒入培养皿时会导致琼脂表面不平整或凹陷，影响后续幼虫行为检测。琼脂溶液浓度不宜过高或过低。若浓度过高，琼脂板表面的光漫反射会增强，导致明暗边界模糊；若浓度过低，幼虫会在板面上留下痕迹。上述两种情况均会影响后续实验流程中的视频处理。 - 将热的琼脂溶液缓慢倒入直径为15 cm的培养皿中，使底部均匀覆盖一层琼脂（厚度约4 mm），于室温（RT）冷却至琼脂完全凝固。
- 琼脂板应新鲜配制后立即使用。若暂不使用，可在表面覆盖一层水后置于4 °C冰箱中保存，以备后续使用。
3. 视觉刺激系统的设置
- 选择LED光源：470 nm的准直蓝光LED或暖白光。
注意：光源可替换为其他任意波长的LED光源。本实验以蓝光LED为例。 - 将一块较厚的铝箔或黑色卡纸（确保不透光）卷成一个长度为12 cm、直径约3 cm的开口圆筒，其直径应与蓝光LED的直径相近。将圆筒的顶端覆盖在蓝光LED的前端，底端用一张中心带有直径为0.5 cm圆形小孔的黑色卡纸封住。此即构成光源系统装置。
- 用夹具将制备好的光源固定在铁架台上，确保LED灯光垂直向下照射至桌面。将圆筒略微倾斜，使其平面与垂直面之间的夹角约为10°（见图1）。将470 nm蓝光LED连接至高功率LED驱动器的"LED1"插口。打开驱动器电源，旋转驱动器右上角的旋钮，选择470 nm通道，然后点击LED。当屏幕显示“√”时，桌面上将出现一个蓝光光斑。
注意：若圆筒除中心小孔外存在漏光，建议使用黑色胶带密封漏光部位，确保仅有小孔可透光。 - 点击OK，旋转旋钮调节光强。将旋钮调至50 mA的较高光强。使用光谱仪测量并记录光的光谱。
- 上下移动光源位置，调节光斑直径至2 cm。建议使用黑色桌面以获得更好的对比效果。
- 根据实验需求旋转旋钮选择合适的光强。使用配备标准光电二极管功率传感器的小型功率计主机测量光斑内的最大和最小光功率，记录数据，重复测量三次并取平均值。
注意：建议使用光电二极管功率传感器测量特定波长光的光强，使用热电式功率传感器测量白光的光强。 - 通过将测得的光功率除以传感器面积，计算光斑内的光强。
注意：例如，若步骤2.6中测得的光功率为20 pW，传感器面积为0.81 mm2，则光强为24.69 pW/mm2（20 pW除以0.81 mm2）。
4. 成像系统的设置
- 使用铁夹将一个高分辨率网络摄像头固定在桌面光斑上方约 10 cm 处（图 1）。
- 调整摄像头镜头的方向，使其对准桌面。通过 USB 接口将摄像头连接到计算机。
- 将一个琼脂平板放置在摄像头正下方的桌面上。
- 在运行 Windows 7 系统的计算机上打开 "Amcap9.22" 软件，AMcap 窗口中将自动显示光斑。轻微左右移动摄像头，确保光斑位于窗口中央附近。确保摄像头不会遮挡光路。光斑应完整且呈圆形。
注意：该软件可从 http://amcap.en.softonic.com/ 下载。 - 使用夹子在摄像头正下方 5–7 mm 处固定一个 850 nm ± 3 nm 的带通滤光片。
注意：滤光片直径约为 2.5 cm，而摄像头镜头直径小于 1 cm，因此滤光片可完全覆盖摄像头的视野。安装滤光片后，AMcap 窗口中不应再看到光斑。 - 将三个红外发光 LED（中心波长 = 850 nm）均匀地放置在琼脂平板周围。每个 LED 距琼脂平板边缘约 5 cm，LED 镜头面应向下倾斜 70° 对准琼脂平板。通过交流转直流电源适配器为 LED 供电。
注意：建议固定红外 LED 的位置和角度，以确保多次实验中视野亮度的一致性，并便于后续视频处理。 - 在计算机与装置之间放置一块黑板。调低计算机屏幕亮度，防止屏幕光线干扰实验。
注意：在测量光的波长或强度时，应保持环境黑暗。
5. 设置成像参数
- 在 AMcap 软件菜单中，选择 选项 | 视频设备 | 捕获格式，并将捕获视频的像素尺寸设置为 800 x 600，帧率为 60 fps。
- 取下摄像头下方的滤光片，在摄像头下方放置一把直尺，调节摄像头焦距，使刻度线清晰且与视频视野的宽度方向平行。
- 点击 捕获 | 设置 | 视频捕获 以选择保存路径，点击 开始录制，记录对应于 600 像素的实际距离，并计算每个像素对应的实际距离比例。
6. 光回避行为的视频记录
- 所有实验过程中保持温度为 25.5 °C。如有需要，使用空调控制室温。使用加湿器将湿度恒定维持在 60%。
- 拍摄一段名为 "lightarea1" 的光斑位置短视频。然后，将 850 nm ± 3 nm 滤光片移回以遮盖相机镜头。
注意：记录幼虫行为时，相机镜头被 850 nm ± 3 nm 滤光片覆盖，以确保光斑不会出现在视频中。后续可通过 Matlab 在包含幼虫的视频中重建光斑位置。请勿移动相机位置，并避免改变第 4.3 步中测得的每个像素与实际距离的比例关系。 - 打开远离实验装置的光源（例如房间照明灯），将灯光调至尽可能低的亮度，只要能用肉眼清晰观察到幼虫即可。用勺子从培养基中取出幼虫，轻轻挑选一只三龄幼虫，并用蒸馏水将其清洗干净。注意每次只清洗一只幼虫，以避免饥饿状态的干扰。单次实验至少需要 20 只幼虫。
- 将幼虫转移至第 3.3 步中放置于相机正下方的琼脂平板中心。用毛刷轻轻吸去幼虫表面多余的水分，或使用吸水纸去除水分，以防止镜头下产生光线反射。关闭房间照明灯，让幼虫在黑暗环境中适应 2 分钟。
- 打开 LED 光源以产生红外光，并用毛刷轻轻将幼虫引导至平板中心。当幼虫开始直线爬行时，旋转平板使其头部朝向光斑方向。确保其起始即为直线爬行，否则可能无法成功接近光斑。
- 点击 采集 | 设置 | 视频采集 以选择保存路径，然后点击 开始录制 进行记录。让幼虫向光斑爬行，进入光斑区域，再离开光斑直至几乎移出视野范围，随后点击 停止录制。若幼虫在接近光斑前即转向远离，则直接点击 停止录制。
- 将滤光片从相机前移开。拍摄一段名为 "lightarea2" 的光斑位置短视频，并与 "lightarea1" 进行比对，确认光斑位置未发生改变。若发现明显的位置偏移，则应舍弃该组数据。
7. 数据分析
- 使用 SOS17 通过图像处理方法从视频中提取动物体轮廓和运动参数，具体方法如前所述17。
注意：包括 headSpeed（幼虫头部速度）、tailSpeed（幼虫尾部速度）、midSpeed（幼虫骨架线中点速度）和 cmSpeed（幼虫质心速度）在内的参数用于测量幼虫运动速度。包括 headTheta（头部-中点连线与中点-尾部连线之间的夹角）和 headOmega（headTheta 的变化速率）在内的参数用于测量幼虫身体弯曲程度及弯曲的角速度。
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结果
根据实验方案，采用光斑实验检测在25 °C条件下、于标准培养基中、在12 h/12 h光暗循环环境中培养的三龄幼虫的避光行为。w1118 幼虫个体在25.5 °C下进行光斑实验测试。由460 nm LED产生的光斑平均光强为0.59 µW/cm2。幼虫进入和离开光斑的全过程通过SOS软件及自编脚本进行记录与分析12,17。一条代表性幼虫的尾部速度、身体弯曲角度及身体弯曲角速度的时间曲线如图2和视频1所示。
为了研究章鱼胺能神经元对幼虫避光行为的影响，使用Tdc2-Gal4驱动子表达破伤风毒素（UAS-TNTG）抑制章鱼胺能神经元的三龄幼虫，通过光斑实验进行了检测。如图3所示，与亲本对照组相比，幼虫头部摆动幅度（最大身体...
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讨论
本方案介绍了光斑检测法，用于测试 果蝇 幼虫逃离光线。该实验可追踪幼虫在进入、接触及离开光斑前后的行为。幼虫运动的细节可被记录并分析。光斑实验操作简便，实用性强，整套装置成本较低。实验中采用LED光源，可根据需要更换为不同波长的光源，光强亦可通过LED驱动器调节，光斑中最低光强可达1.80 pW/mm。2 （冷白光）。即使在如此低的光强度下，幼虫仍能感知光线并表现出避光行为。11.
需要注意的是，琼脂平板的浓度应控制在0.8%至1.0%之间。若浓度过高，琼脂平板上的光散射会较为严重，导致视频中识别到的光斑尺寸被夸大。因此，光斑的亮度不宜过高。由于幼虫在光斑中难以观察，若使用可见光照明，则需采用红外光照射幼虫，并在相机上加装850 nm带通滤光片，以防止光斑信号进入相机。幼虫对光斑反应的视频可后续根据仅含幼虫和仅含光斑的视频合成获得。
光斑实验具有三个主要优点：1）可以详细监测和分析幼虫避光过程；2）仅对幼虫的光反应进行一次测试，从而可排除光...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作受到中国国家自然科学基金（31671074）和浙江省高校基本科研业务费专项资金（2019XZZX003-12）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 850 nm ± 3 nm 红外光源 LED | Thorlabs, USA | PM100A | 兼容传感器：光电二极管和热电堆 光功率范围a：100 pW 至 200 W 可用传感器波长范围a：185 nm–25 μm 显示刷新率：20 Hz 带宽a：DC–100 kHz 光电二极管传感器范围b：50 nA–5 mA 热电堆传感器范围b：1 mV–1 V |
| 交流转直流转换器 | Thorlabs, USA | S120VC | 孔径尺寸：Ø9.5 mm 波长范围：200–1100 nm 功率范围：50 nW–50 mW 探测器类型：硅光电二极管（紫外扩展型） 线性度：±0.5% 测量不确定度c：±3%（440–980 nm），±5%（280–439 nm），±7%（200–279 nm，981–1100 nm） |
| 带通滤光片 | Thorlabs, USA | DC2100 | LED 电流范围：0–2 A LED 电流分辨率：1 mA LED 电流精度：±20 mA LED 正向电压：24 V 调制频率范围：0–100 kHz 正弦波 调制方式：任意 |
| 准直蓝光 LED | ELP, 中国 | USBFHD01M | 最大分辨率：1920×1080 F6.0 mm 传感器：1/2.7" CMOS OV2710 |
| 紧凑型功率计控制台 | Ocean Optics, USA | USB2000+(RAD) | 尺寸：89.1 mm × 63.3 mm × 34.4 mm 重量：190 g 探测器：Sony ILX511B（2048 元件线性硅 CCD 阵列） 波长范围：200–850 nm 积分时间：1 ms – 65 秒（典型值 20 秒） 动态范围：8.5 × 10^7（系统）；单次采集 1300:1 信噪比：250:1（满信号） 暗噪声：50 RMS 计数 光栅：2（250 – 800 nm） 狭缝：SLIT-50 探测器收集透镜：L2 级次分离滤光片：OFLV-200-850 光学分辨率：约 2.0 nm FWHM 杂散光：<0.05%（600 nm 处）；<0.10%（435 nm 处） 光纤连接器：SMA 905 至 0.22 数值孔径单股光纤 |
| 高功率 LED 驱动器 | Minhongshi, 中国 | MHS-48XY | 工作电压：DC12V 中心波长：850 nm |
| 高分辨率网络摄像头 | Thorlabs, USA | MWWHL4 | 颜色：暖白 相关色温：3000 K 典型 LED 功率测试电流：1000 mA 最大电流（连续）：1000 mA 带宽（FWHM）：不适用 电功率：3000 mW 视角（全角）：120? 发光体尺寸：1 mm × 1 mm 典型寿命：>50 000 小时 工作温度（非冷凝）：0 至 40 °C 储存温度：-40 至 70 °C 风险等级a：RG1 – 低风险等级 |
| 暖白 LED | Mega-9, 中国 | BP850/22K | Ø25.4(+0~-0.1) mm 带宽：22±3 nm 峰值透射率：80% 中心波长：850 nm±3 nm |
| 光谱仪 | Noel Danjou | Amcap9.22 | AMCap 是一款具备高级预览和录制功能的静态图像与视频采集软件。该桌面应用程序适用于运行 Windows 7 SP1 或更高版本操作系统的计算机。大多数 Video-for-Windows 和 DirectShow 兼容设备均受支持，无论其为廉价网络摄像头还是高级视频采集卡。 |
| 标准光电二极管功率传感器 | Super Dragon, 中国 | YGY-122000 | 输入：AC 100–240V~50/60Hz 0.8A 输出：DC 12V 2A |
| 热功率传感器 | Thorlabs, USA | M470L3-C1 | 颜色：蓝色 标称波长a：470 nm 带宽（FWHM）：25 nm 最大电流（连续）：1000 mA 正向电压：3.2 V 电功率（最大）：3200 mW 发光体尺寸：1 mm × 1 mm 典型寿命：100 000 小时 工作温度（非冷凝）：0 至 40 °C 储存温度：-40 至 70 °C 风险等级b：RG2 – 中等风险等级 |
| 热功率传感器 | Thorlabs, USA | S401C | 波长范围：190 nm–20 μm 光功率范围：10 μW–1 W（3 Wb） 输入孔径尺寸：Ø10 mm 有效探测器面积：10 mm × 10 mm 最大光功率密度：500 W/cm2（平均） 线性度：±0.5% |
参考文献
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