基于光斑的实验方法用于分析 Drosophila 幼虫趋光性

摘要

本方案介绍了一种光斑检测法，用于研究黑腹果蝇（Drosophila）幼虫的趋光行为。在该检测中，通过产生一个光斑作为光刺激，利用基于红外光的成像系统记录幼虫避光过程。

摘要

Drosophila melanogaster 幼虫在觅食阶段表现出明显的避光行为。Drosophila 幼虫的趋光性可作为研究动物回避行为的模型。本实验方案介绍了一种光斑检测方法，用于研究幼虫的趋光行为。实验装置主要包括两个部分：一个产生光斑的视觉刺激系统，以及一个基于红外光的成像系统，用于记录幼虫避光过程。该检测方法可追踪幼虫进入、接触及离开光斑前后的行为，包括减速、停顿、头部摆动和转向等运动细节，均可通过此方法进行捕捉和分析。

引言

Drosophila melanogaster 的幼虫在觅食阶段表现出明显的避光行为。Drosophila 幼虫的趋光性长期以来一直是研究对象，尤其是在过去50年中^{1,2,3,4,5,6,7,8}。近年来，尽管1）已鉴定出许多介导幼虫避光行为的神经元^{4,5,9,10,11,12}，且2）幼虫视觉系统的全连接组已在突触分辨率水平上建立¹³

方案

1. 准备 黑腹果蝇 幼虫

1. 配制标准培养基，包含煮沸的玉米粉（73 g）、琼脂（5.6 g）、豆粕（10 g）、酵母（17.3 g）、糖浆（76 mL）和水（1000 mL）。
2. 将所有果蝇置于25 °C、12小时光照/12小时黑暗循环的环境中，在标准培养基上进行培养。

2. 琼脂平板的制备

1. 配制1.0%的琼脂溶液。用天平称取3 g琼脂放入500 mL烧杯中，加入300 mL蒸馏水。用铝箔纸覆盖烧杯口以防止水分蒸发。将烧杯放入微波炉中加热至沸腾。
2. 取出烧杯，用玻璃棒充分搅拌，再放入微波炉中加热至沸腾。重复此步骤，直至液体完全透明且呈流动状态。
   注意：最终的热琼脂溶液应无气泡；否则，将琼脂倒入培养皿时会导致琼脂表面不平整或凹陷，影响后续幼虫行为检测。琼脂溶液浓度不宜过高或过低。若浓度过高，琼脂板表面的光漫反射会增强，导致明暗边界模糊；若浓度过低，幼虫会在板面上留下痕迹。上述两种情况均会影响后续实验流程中的视频处理。
3. 将热的琼脂溶液缓慢倒入直径为15 cm的培养皿中，使底部均匀覆盖一层琼脂（厚度约4 mm），于室温（RT）冷却至琼脂完全凝固。
4. 琼脂板应新鲜配制后立即使用。若暂不使用，可在表面覆盖一层水后置于4 °C冰箱中保存，以备后续使用。

3.....

结果

根据实验方案，采用光斑实验检测在25 °C条件下、于标准培养基中、在12 h/12 h光暗循环环境中培养的三龄幼虫的避光行为。w¹¹¹⁸ 幼虫个体在25.5 °C下进行光斑实验测试。由460 nm LED产生的光斑平均光强为0.59 µW/cm²。幼虫进入和离开光斑的全过程通过SOS软件及自编脚本进行记录与分析^12,17。一条代表性幼虫的尾部速度、身体弯曲角度及身体弯曲角速度的时间曲线如图2和视频1所示。

为了研究章鱼胺能神经元对幼虫避光行为的影响，使用Tdc2-Gal4驱动子表达破伤风毒素（UAS-TNTG）抑制章鱼胺能神经元的三龄幼虫，通过光斑实验进行了检测。如图3所示，与亲本对照组相比，幼虫头部摆动幅度（最大身体.......

讨论

本方案介绍了光斑检测法，用于测试 果蝇 幼虫逃离光线。该实验可追踪幼虫在进入、接触及离开光斑前后的行为。幼虫运动的细节可被记录并分析。光斑实验操作简便，实用性强，整套装置成本较低。实验中采用LED光源，可根据需要更换为不同波长的光源，光强亦可通过LED驱动器调节，光斑中最低光强可达1.80 pW/mm。² （冷白光）。即使在如此低的光强度下，幼虫仍能感知光线并表现出避光行为。¹¹.

需要注意的是，琼脂平板的浓度应控制在0.8%至1.0%之间。若浓度过高，琼脂平板上的光散射会较为严重，导致视频中识别到的光斑尺寸被夸大。因此，光斑的亮度不宜过高。由于幼虫在光斑中难以观察，若使用可见光照明，则需采用红外光照射幼虫，并在相机上加装850 nm带通滤光片，以防止光斑信号进入相机。幼虫对光斑反应的视频可后续根据仅含幼虫和仅含光斑的视频合成获得。

光斑实验具有三个主要优点：1）可以详细监测和分析幼虫避光过程；2）仅对幼虫的光反应进行一次测试，从而可排除光.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
850 nm ± 3 nm 红外光源 LED	Thorlabs, USA	PM100A	兼容传感器：光电二极管和热电堆 光功率范围a：100 pW 至 200 W 可用传感器波长范围a：185 nm–25 μm 显示刷新率：20 Hz 带宽a：DC–100 kHz 光电二极管传感器范围b：50 nA–5 mA 热电堆传感器范围b：1 mV–1 V
交流转直流转换器	Thorlabs, USA	S120VC	孔径尺寸：Ø9.5 mm 波长范围：200–1100 nm 功率范围：50 nW–50 mW 探测器类型：硅光电二极管（紫外扩展型） 线性度：±0.5% 测量不确定度c：±3%（440–980 nm），±5%（280–439 nm），±7%（200–279 nm，981–1100 nm）
带通滤光片	Thorlabs, USA	DC2100	LED 电流范围：0–2 A LED 电流分辨率：1 mA LED 电流精度：±20 mA LED 正向电压：24 V 调制频率范围：0–100 kHz 正弦波 调制方式：任意
准直蓝光 LED	ELP, 中国	USBFHD01M	最大分辨率：1920×1080 F6.0 mm 传感器：1/2.7" CMOS OV2710
紧凑型功率计控制台	Ocean Optics, USA	USB2000+(RAD)	尺寸：89.1 mm × 63.3 mm × 34.4 mm 重量：190 g 探测器：Sony ILX511B（2048 元件线性硅 CCD 阵列） 波长范围：200–850 nm 积分时间：1 ms – 65 秒（典型值 20 秒） 动态范围：8.5 × 10^7（系统）；单次采集 1300:1 信噪比：250:1（满信号） 暗噪声：50 RMS 计数 光栅：2（250 – 800 nm） 狭缝：SLIT-50 探测器收集透镜：L2 级次分离滤光片：OFLV-200-850 光学分辨率：约 2.0 nm FWHM 杂散光：<0.05%（600 nm 处）；<0.10%（435 nm 处） 光纤连接器：SMA 905 至 0.22 数值孔径单股光纤
高功率 LED 驱动器	Minhongshi, 中国	MHS-48XY	工作电压：DC12V 中心波长：850 nm
高分辨率网络摄像头	Thorlabs, USA	MWWHL4	颜色：暖白 相关色温：3000 K 典型 LED 功率测试电流：1000 mA 最大电流（连续）：1000 mA 带宽（FWHM）：不适用 电功率：3000 mW 视角（全角）：120? 发光体尺寸：1 mm × 1 mm 典型寿命：>50 000 小时 工作温度（非冷凝）：0 至 40 °C 储存温度：-40 至 70 °C 风险等级a：RG1 – 低风险等级
暖白 LED	Mega-9, 中国	BP850/22K	Ø25.4(+0~-0.1) mm 带宽：22±3 nm 峰值透射率：80% 中心波长：850 nm±3 nm
光谱仪	Noel Danjou	Amcap9.22	AMCap 是一款具备高级预览和录制功能的静态图像与视频采集软件。该桌面应用程序适用于运行 Windows 7 SP1 或更高版本操作系统的计算机。大多数 Video-for-Windows 和 DirectShow 兼容设备均受支持，无论其为廉价网络摄像头还是高级视频采集卡。
标准光电二极管功率传感器	Super Dragon, 中国	YGY-122000	输入：AC 100–240V~50/60Hz 0.8A 输出：DC 12V 2A
热功率传感器	Thorlabs, USA	M470L3-C1	颜色：蓝色 标称波长a：470 nm 带宽（FWHM）：25 nm 最大电流（连续）：1000 mA 正向电压：3.2 V 电功率（最大）：3200 mW 发光体尺寸：1 mm × 1 mm 典型寿命：100 000 小时 工作温度（非冷凝）：0 至 40 °C 储存温度：-40 至 70 °C 风险等级b：RG2 – 中等风险等级
热功率传感器	Thorlabs, USA	S401C	波长范围：190 nm–20 μm 光功率范围：10 μW–1 W（3 Wb） 输入孔径尺寸：Ø10 mm 有效探测器面积：10 mm × 10 mm 最大光功率密度：500 W/cm2（平均） 线性度：±0.5%