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方法文章

活细胞成像评估有丝分裂纺锤体扰动后中期持续时间动态变化及细胞命运

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DOI：

10.3791/60255

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2019年9月20日

 ,  , 
1Department of Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种评估纺锤体形成和有丝分裂进程动态变化的实验方案。通过应用延时成像技术，使用者能够识别处于有丝分裂不同阶段的细胞，追踪并鉴定有丝分裂缺陷，并分析在抗有丝分裂药物处理下纺锤体的动态行为及有丝分裂细胞的命运。

摘要

活细胞延时成像技术是细胞生物学中的重要工具，能够揭示那些通过固定细胞分析可能被忽略、误解或误读的细胞过程。尽管固定细胞成像与分析方法稳健且足以观察细胞的稳态，但在定义细胞事件的时间顺序方面存在局限性，难以评估包括有丝分裂进程在内的动态过程的瞬时特性。相比之下，活细胞成像是一种有效的工具，可用于在单细胞水平上随时间观察细胞过程，并能够捕捉到在固定细胞成像中难以充分呈现的动态行为。本文介绍了一种构建携带染色质和微管荧光标记物的细胞的方法，并阐述了如何利用这些细胞进行活细胞成像，以监测中期染色体排列和有丝分裂退出过程。我们描述了基于成像的技术，用于评估纺锤体形成和有丝分裂进程的动态变化，包括识别处于有丝分裂不同阶段的细胞、识别 并追踪有丝分裂缺陷、以及在使用有丝分裂抑制剂处理后对纺锤体动态和有丝分裂细胞命运的分析。

引言

基于图像的固定细胞分析常用于评估细胞群体在各种扰动下的变化。当结合细胞同步化，并随后收集和成像一系列时间点时，此类方法可用于推断细胞事件的发生顺序。然而，固定细胞成像的局限性在于，其时间关系是基于细胞群体推断得出的，而非在单个细胞水平上直接证实。因此，尽管固定细胞成像与分析足以观察显著的表型变化和稳态改变，但在检测随时间发生的瞬时变化以及仅影响部分细胞亚群的变化方面仍存在不足。相比之下，活细胞成像是一种有力的技术，可用于在时间序列上观察单个细胞或细胞群体内的细胞及亚细胞过程，且无需依赖可能本身影响细胞行为的同步化手段1,2,3,4,5,6。

双极有丝分裂纺锤体的形成对于细胞分裂过程中染色体的正确分离至关重要，从而产生两个遗传上完全相同的子细胞。有丝分裂纺锤体结构的缺陷会破坏有丝分裂进程，降低染色体分离的保真度，可能导致灾难性的细胞分裂并降低细胞存活率。因此，能够改变纺锤体形成的有丝分裂抑制剂在抑制癌细胞快速增殖方面具有良好的治疗前景7,8,9。然而，在添加有丝分裂抑制剂后，通过固定细胞分析纺锤体结构的方法在评估纺锤体形成动态过程方面存在局限性，且无法判断所观察到的纺锤体结构变化是永久性的，还是暂时性的、可被克服并最终实现成功细胞分裂的。

在本实验方案中，我们描述了一种通过活细胞成像来评估纺锤体扰动后有丝分裂动态的方法。利用经基因工程改造、可表达RFP标记的组蛋白H2B以可视化染色质，同时表达EGFP标记的α-微管蛋白以可视化微管的hTERT永生化RPE-1细胞系，通过观察染色体运动、凝缩及细胞核形态等视觉特征，评估中期染色体排列、后期起始以及最终的有丝分裂细胞命运的时间进程。

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方案

1. 生成稳定表达RFP-Histone 2B（RFP-H2B）和α-tubulin-EGFP（tub-EGFP）的hTERT-RPE-1细胞

注意：所有步骤均需遵循无菌操作技术，并在生物安全二级增强型（BSL2+）安全柜中进行。

  1. 根据脂质体转染递送系统的说明书，通过将相应的慢病毒质粒转染293T细胞，生成携带目的基因（α-微管蛋白-EGFP和RFP-H2B）的逆转录病毒。
    1. 第1天：使用一次性玻璃巴斯德吸管吸取亚融合状态293T细胞培养板中的培养基，并加入5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤残留培养基。轻轻摇晃使PBS均匀覆盖培养板底部，然后用无菌一次性玻璃巴斯德吸管吸除PBS。
    2. 加入2 mL预热至37 °C的0.05%胰蛋白酶，将培养板放回37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中孵育2至5分钟，使贴壁细胞从培养皿表面脱落。
    3. 向含有胰蛋白酶的培养板中加入8 mL补充有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的新鲜DMEM培养基。
    4. 轻轻吹打使细胞重悬，将细胞悬液转移至无菌15 mL锥形离心管中。将离心管放入平衡好的离心机，于室温下以161 x g离心5分钟，轻柔地沉淀细胞。
    5. 吸除上清液（含胰蛋白酶溶液），将细胞重悬于10 mL补充有10% FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基中。使用血细胞计数板对293T细胞悬液进行计数，并将2 × 106个293T细胞接种至6孔板的每个孔中。
    6. 在总体积为2 mL的补充有10% FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基中培养细胞，并置于37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中维持 。
    7. 第2天：取7 µL脂质体转染递送试剂和100 µL低血清培养基，加入1.5 mL微量离心管中，室温孵育5分钟（管#1）。
    8. 在另一个1.5 mL微量离心管中，加入1 µg RFP-H2B表达载体（或1 µg α-微管蛋白-EGFP表达载体）、5 µL增强剂试剂（根据制造商指南要求）、0.5 µg pMD2.G、1 µg psPAX2以及100 µL低血清培养基（管#2）。
    9. 将步骤1.1.7和步骤1.1.8的溶液混合，小心地将管#2中的液体加入管#1中，室温孵育20分钟。
      注：可根据需要按比例放大反应体系，用于更多孔板细胞的转染。
    10. 将转染反应液逐滴加入含有293T细胞和2 mL培养基的目标孔中，然后将培养皿放回37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中。
      注：若需生成同时表达RFP-H2B和α-微管蛋白-EGFP的细胞，应分别制备每种表达载体的病毒（步骤1.1.7–1.1.9）。
    11. 第3天：吸除原有培养基并更换为2 mL新鲜DMEM培养基（补充10% FBS和1%青霉素/链霉素），将培养皿放回37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中。
  2. 第4天：收集含有表达病毒颗粒的培养基，注意避免扰动或去除293T细胞。使用连接5 mL注射器的0.45 µm滤器过滤含病毒颗粒的培养基。将病毒分装后短期储存于4 °C，或长期储存于-80 °C。
    注：通过此方法获得的病毒颗粒浓度约为~1 × 107至1 × 108转导单位/mL。由于产病毒细胞和待感染细胞使用相同的培养基培养，无需浓缩病毒，过滤后的病毒颗粒可直接用于感染细胞。
  3. 将2 × 105个hTERT-RPE-1细胞接种至6孔板的每孔中，为病毒感染做准备。在2 mL补充有10% FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基中培养细胞，并维持于37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中。
  4. 第5天：向hTERT-RPE-1细胞中加入六亚甲基溴化铵（如polybrene），终浓度为8 µg/mL。用500 µL病毒与500 µL细胞培养基混合后感染细胞。
    注：六亚甲基溴化铵储备液用无菌蒸馏水配制，再经0.45 μm滤器过滤。
  5. 第6天：使用一次性玻璃巴斯德吸管吸除含病毒感染细胞孔中的培养基。更换为2 mL含有10% FBS、1%青霉素/链霉素以及适当浓度抗生素的DMEM培养基，以筛选质粒整合与表达。
    注：本实验中使用的α-微管蛋白-EGFP表达质粒携带嘌呤霉素抗性基因，RFP-H2B表达质粒携带杀稻瘟菌素抗性基因。因此，使用10 µg/mL嘌呤霉素和2 µg/mL杀稻瘟菌素筛选表达α-微管蛋白-EGFP和RFP-H2B的hTERT-RPE-1细胞。不同细胞系所用抗生素筛选浓度可能有所不同。
  6. 在抗生素筛选条件下维持细胞5–7天，每隔3天更换一次含适当筛选试剂的新鲜培养基。
    注：筛选期间细胞应保持亚融合状态，并根据需要进行扩增，扩增方法见步骤1.1.1至1.1.4。
  7. 使用免疫荧光成像确认标记融合蛋白的表达。
    注：如需要，可通过单细胞克隆获得细胞群体内表达水平均一的细胞系。一旦确认获得稳定克隆，细胞可在无抗生素筛选的常规培养条件下维持培养。

2. 有丝分裂纺锤体干扰后用于活细胞成像的细胞准备

注意：使用无菌技术，并在BSL2安全柜中进行操作。

  1. 使用无菌一次性玻璃巴斯德吸管，吸出含有表达载体（来自步骤 1.7）的细胞系培养板中的培养基。用 10 mL 无菌 PBS 轻轻冲洗细胞。轻轻摇晃使 PBS 均匀覆盖培养板底部，然后用无菌一次性玻璃巴斯德吸管吸出 PBS。
  2. 向 10 cm 培养板中加入 2 mL 0.05% 胰蛋白酶。将培养板置于 37 °C 培养箱中孵育 2–5 分钟，或直至细胞从培养板表面脱落。
  3. 向含胰蛋白酶的培养板中加入 8 mL 新鲜培养基。轻轻吹打使细胞重悬，然后将细胞悬液转移至无菌 15 mL 圆锥形离心管中。将离心管置于平衡好的离心机中，在室温下以 161 x g 离心 5 分钟，使细胞轻柔沉淀。
  4. 小心吸除上清液，用 10 mL 血清移液管轻轻吹打，加入 10 mL PBS 重悬细胞。将离心管置于平衡好的离心机中，在室温下以 161 x g 离心 5 分钟，使细胞轻柔沉淀。
  5. 小心吸除上清液，用 10 mL 血清移液管轻轻吹打，加入 10 mL 新鲜培养基重悬细胞。
  6. 计数细胞，使用血细胞计数板计算细胞数量，并用细胞培养基将细胞稀释至浓度为 1–2 × 105 个细胞/mL。将 500 µL 细胞悬液接种至无菌 12 孔成像底板的每个孔中。将培养板放入细胞培养箱中，使细胞贴附于培养板表面。
    注意：活细胞成像要求细胞充分贴壁，以确保在图像采集过程中细胞保持在成像平面上。不同细胞系贴壁所需时间可能不同，应针对所研究的细胞系进行优化。
  7. 在开始延时成像前最多 30 分钟，向接种了细胞的一个或多个孔中加入适当浓度的有丝分裂药物。为排除有机溶剂对细胞行为的潜在影响，对照组细胞应加入等体积的抑制剂溶剂。例如，在实验孔中加入 100 nM 有丝分裂激酶 Aurora A 的特异性抑制剂（如 alisertib）的同时，应在对照孔中加入等体积的该药物的溶剂 DMSO。
    注意：为比较分析有丝分裂进程中的动态变化，需准备未受干扰的细胞孔，以便与实验条件并行地成像正常有丝分裂过程。

3. 用于RFP-H2B和α-微管蛋白-GFP表达细胞延时成像的显微镜设置（图1，图2）

  1. 将表达 RFP-H2B 和 α-tubulin-GFP 的 hTERT RPE-1 细胞培养板放入倒置落射荧光显微镜的合适载物台插件中，显微镜需配备高分辨率相机（20倍下像素大小为 0.67 μm）、预热至 37 °C 的环境培养箱，以及可提供加湿 5% CO2 的供气系统。
    注意：只要能够提供加湿的 5% CO2 并实现稳定的温度控制，封闭式环境培养箱或温控载物台插件均可适用。
  2. 使用数值孔径为 0.5 的 20 倍空气物镜，并配备高对比度荧光、相差或明场成像功能。使用相差或明场观察细胞，并调节显微镜的粗调和细调焦旋钮，使细胞清晰对焦。
  3. 通过选择适用于待成像荧光团的激发和发射波长的相应滤光立方体，确定并设置明场、GFP 和 RFP 图像采集的最佳曝光时间。或者，点击自动曝光按钮以输入 预设的曝光时间。如果信号强度不足，可点击 binning 选项卡并在下拉菜单中选择 2 x 2 pixel binning，以通过像素合并实现更短的曝光时间。
    注意：光毒性可能影响有丝分裂进程和细胞活力。对照组细胞群体中分裂细胞无法完成正常有丝分裂，可能提示曝光时间或成像持续时间需要进一步优化。
  4. 使用支持多坐标、多孔同步成像的采集与分析软件，并设定图像采集参数。
    1. 根据制造商说明，将显微镜载物台校准至多孔板。使用图像采集软件，在所用培养板格式示意图中点击相应孔位，以高亮或选择需要成像的孔。
    2. 在 GeneratedPoints 控制面板（图 2）中，点击 Point Placement 选项卡，并从下拉菜单中选择 预定义 或 随机坐标放置，以定义每个孔内将要成像的坐标位置。选择 Working Area 选项卡，并从下拉菜单中选择 受限，以限制坐标选择区域，排除孔的边缘区域。点击 Count 和 Distribution 选项卡，分别设置每孔采集的坐标点数量和分布方式。
      注意：在每 5 分钟的时间点间隔内，每孔可成像的坐标数量受限于待成像孔的总数以及每个通道的曝光时间。通常情况下，每孔 5–8 个坐标点足以在 4 小时内观察到每种条件下至少 50 个细胞完成有丝分裂过程。
    3. 点击并输入 TimeSequence 控制面板中的数值，以设定图像采集的时间间隔和总时长。
      注意：每 1 至 5 分钟采集一次图像，适合监测有丝分裂进程的动力学变化。总的 成像时长应根据实验终点需求及细胞系的增殖速率确定。例如，4 小时足以观察大量细胞完成有丝分裂，而 16 小时则足以使异步群体中的大多数 RPE-1 细胞经历一次有丝分裂。

4. 通过延时成像分析确定有丝分裂纺锤体扰动后的中期持续时间及有丝分裂细胞命运

注意：使用图像采集软件（材料表）、ImageJ 或类似的图像分析软件进行图像分析。

  1. 通过选择使用RFP滤光片拍摄的图像来观察RFP-H2B标记的染色质。识别进入有丝分裂的细胞，其特征为染色质初始凝集（图2C，蓝色箭头）以及核膜破裂（当α-微管蛋白-EGFP不再被核边界排除时）。
  2. 确定单个细胞中中期染色体排列和后期起始的有丝分裂时间：在获取的延时成像视频中追踪该细胞连续的时间点，以确定从有丝分裂开始到RFP-H2B标记的染色质在中期完成于细胞赤道板排列所经历的时间点数/分钟数（图2C，黄色箭头）。
  3. 为监测有丝分裂时间、有丝分裂保真度及细胞命运，继续追踪该细胞在连续时间点的变化，以确定后期染色体分离明显出现的时间坐标（图2C，白色箭头），和/或染色质去凝集及核膜重建（表现为微管蛋白被排除于核外）已发生的时间点。
    注意：纺锤体组装或有丝分裂进程的异常可通过完成双极纺锤体形成、实现染色体完全排列所需的时间，或完成后期染色体分离所需的时间进行评估。
  4. 观察RFP-H2B信号，识别各群体中表现出有丝分裂缺陷的细胞，这些缺陷包括在后期染色体分离过程中出现的滞后染色体和染色质桥。
    注意：有丝分裂保真度受损还可能导致产生多核或微核子代细胞，可在有丝分裂结束后观察到，如图3所示。

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结果

在纺锤体受到扰动的情况下评估有丝分裂进程
纺锤体极聚焦的调控是正确形成双极纺锤体的关键步骤。通过蛋白耗竭、药物抑制或中心体数量改变而破坏该过程，会导致纺锤体结构异常，并延迟或阻滞有丝分裂进程10,11,12,13。然而，某些扰动仅会暂时性延迟纺锤体形成，细胞最终仍能进入有丝分裂并完成后期染色体分离14。在不使用可能间接影响有丝分裂过程的细胞同步化方法的情况下1,2，细胞以异步方式通过有丝分裂阶段（图2C）。利用RFP-H2...

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讨论

延时成像提供的时间分辨率使得能够可视化并评估单个细胞内连续发生的细胞事件。传统方法通常依赖于细胞同步化，随后在不同时间点收集并固定细胞，但这种方法存在局限性，因为最终的比较实际上是在细胞群体之间进行的。在细胞对扰动的响应不均一，或所观察过程具有动态特性的条件下，活细胞延时成像更适用于追踪和分析单个细胞的动态行为以及细胞群体内部的异质性。因此，延时成像在监测细胞经历有丝分裂各个动态阶段的过程，以及评估对这一进程的干扰如何最终影响有丝分裂的保真度和后续细胞命运方面尤为有用。

尽管活细胞成像具有诸多优势，但在实际操作中仍存在一些重大挑战，必须予以充分考虑并尽可能加以克服。其中一个挑战是维持适当的环境条件，以确保成像过程中细胞的存活与增殖。为此，成像系统必须配备能够调控温度和CO2浓度的环境培养箱。或者，若在密闭培养腔内进行短期成像，也可仅控制温度。在这两种情况下，均应使用防震台和/或基于硬件的轴向聚焦稳定技术（例如尼康的Perfect Focus系统），以在整个实验过程中维持培养板的聚焦稳定。活细胞成像的另一个重要问题是光损伤和荧光淬灭（photobleaching...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

DLM 获得美国国家科学基金会研究生科研奖学金（NSF GRFP）的支持。ALM 获得史密斯家族生物医学研究卓越奖资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.05% 胰蛋白酶Gibo-Life Sciences25-510一种用于从培养皿中解离贴壁细胞的丝氨酸蛋白酶
15 ml 离心管奥林巴斯塑料公司28-101
20x CFI Plan Fluor 物镜 尼康用于活细胞成像，以同时观察明场和荧光图像
293T细胞ATCCCRL-3216用于逆转录病毒转染；在步骤 1.1 中使用
α-tubulin-EGFP Addgene不同的数量表达载体，用于编码与绿色荧光蛋白标签融合的α-微管蛋白；适用于活细胞成像中微管蛋白的可视化：可通过Addgene及其他供应商商业获取
AlisertibSelleckchemS1133有丝分裂激酶Aurora A的小分子抑制剂。DMSO中储存浓度为10 mM，使用时终浓度为100 nM。
BlasticidinInvitrogenA11139-03抗生素筛选剂；用于筛选表达 a-tub-EGFP 的细胞
C02Airgas用于细胞培养和活细胞成像
Chroma ET-DS 红色（TRITC/Cy3）色度49005单波段滤光片组；激发波长545 nm，带宽25 nm，发射波长605 nm，带宽70 nm；用于H2B-RFP的可视化
Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2)色度49002单波段滤光片组；激发波长470 nm，带宽40 nm，发射波长525 nm，带宽50 nm；用于GFP-微管蛋白的观察
一次性玻璃巴斯德吸管，已灭菌 Fisher Scientific13-678-6A用于吸取细胞 
杜尔贝科’DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基）Gibo-Life sciences11965-084RPE-1 和 293T 细胞生长用细胞培养基
胎牛血清（FBS）Gibo-Life sciences10438-026细胞培养基添加剂
Lipofectamine 3000 和 p3000InvitrogenL3000-015基于脂质的转染试剂，用于质粒转染；在1.1.4中使用
多孔组织培养皿康宁各种用于细胞培养、转染/感染及活细胞成像
尼康 Ti-E 显微镜尼康用于活细胞成像的倒置落射荧光显微镜
NIS 元素 HC 尼康版本 4.51图像采集与分析软件；用于第3节 &和 4
OPTI-MEMGibo-Life sciences31985-070用于细胞转染的低血清培养基；在步骤 1.1.3 中使用
青霉素/链霉素 Gibo-Life sciences15140-122细胞培养基中使用的抗生素
磷酸盐缓冲液（PBS）Caisson 实验室PBP06-10X1LT用于细胞培养的无菌生理盐水溶液
pMD2.GAddgene12259慢病毒VSV-G包膜表达载体；用于步骤1.1.4
PolybreneSigma-AldrichH9268用于增强病毒感染效率的阳离子聚合物；在步骤 1.1.10 中使用
psPAXAddgene12260第二代慢病毒包装质粒；用于步骤 1.1.4
嘌呤霉素Invitrogenant-pr-1抗生素筛选剂；用于筛选表达 RFP-H2B 的细胞
RFP-组蛋白2B（H2B）Addgene不同的数量用于活细胞成像中染色质可视化研究的红色荧光蛋白标记组蛋白2B表达载体：可通过Addgene及其他供应商商业获取
RNAi MaxInvitrogen13778-150基于脂质的siRNA转染试剂
RPE-1 细胞ATCCCRL-4000人视网膜色素上皮细胞系
组织培养皿 100×20 mm康宁 353003用于培养贴壁细胞
Zyla sCMOS 相机 尼康连接至显微镜的相机，用于捕获细胞图像

参考文献

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