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方法文章

动态光散射粒度分析中电压的应用

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DOI：

10.3791/60257

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2020年1月24日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of New Hampshire, 2Department of Chemical Engineering, University of New Hampshire, 3Department of Chemistry and Physics, University of New England

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种在动态光散射粒径测量过程中对溶液施加电压的实验方案，旨在研究电压和温度变化对聚合物聚集行为的影响。

摘要

动态光散射（DLS）是一种常用于表征聚合物、蛋白质及其他纳米和微米级颗粒粒径分布的方法。现代仪器可实现粒径随时间及/或温度变化的测量，但目前尚无简单方法可在施加电压条件下进行DLS粒径分布测量。能够在施加电压条件下开展此类测量，对于开发用于传感、软体机器人和能量存储等应用的电活性、刺激响应型聚合物具有重要意义。本文介绍了一种结合外加电压、DLS及温度梯度的技术，用于观察热响应型聚合物在有或无电活性单体时其聚集行为和粒径的变化。实验中观察到的聚集行为变化，只有通过电压与温度控制的联合作用才能实现。为获得这些结果，将恒电位仪连接至经改造的比色皿，以对溶液施加电压，并在恒定电压条件下利用DLS监测聚合物颗粒的尺寸变化。同时获取电流数据，可与粒径数据进行比对，以理解电流与颗粒行为之间的关系。聚（N-异丙基丙烯酰胺）（pNIPAM）作为该技术的测试聚合物，因其对温度的响应行为已有充分研究。本文观察了在施加电压条件下，pNIPAM以及电化学活性嵌段共聚物聚（N-异丙基丙烯酰胺）-嵌段-聚（二茂铁甲基甲基丙烯酸酯）的低临界溶解温度（LCST）聚集行为的变化。理解这些变化背后的机制，对于在施加电压条件下实现可逆聚合物结构具有重要意义。

引言

动态光散射（DLS）是一种通过检测溶液中散射光强度的随机变化来测定颗粒尺寸的技术1。DLS 能够通过测定颗粒尺寸来检测聚合物的聚集行为。在本实验中，DLS 与可控的温度变化相结合，用于观察聚合物发生聚集的时刻，从而指示其已超过低临界溶解温度（LCST）2,3。在 LCST 以下，体系中存在单一的均相液相；而在 LCST 以上，聚合物溶解度降低，发生聚集并从溶液中析出。在散射区域施加电压（即施加电势或电场），以观察电场对聚集行为和 LCST 的影响。在颗粒尺寸测量中引入电压，有助于深入理解颗粒行为，并为传感器、储能装置、药物递送系统、软体机器人等领域带来新的应用前景。

在本实验方案中，使用了两种示例聚合物。聚(N-异丙基丙烯酰胺)（pNIPAM）是一种热敏性聚合物，其大分子链上同时含有亲水性的酰胺基团和疏水性的异丙基基团4,5。近年来，pNIPAM等热响应性聚合物材料已被广泛应用于可控药物释放、生化分离以及化学传感器等领域3,4。文献报道的pNIPAM的低临界溶解温度（LCST）约为30–35 °C4。pNIPAM通常不具备电化学活性。因此，作为第二种样品聚合物，向其结构中引入了一个具有电化学活性的嵌段。具体而言，采用甲基丙烯酸二茂铁甲酯（ferrocenylmethyl methacrylate）制备了一种聚(N-异丙基丙烯酰胺)-嵌段-聚(甲基丙烯酸二茂铁甲酯)共聚物，即p(NIPAM-b-FMMA)6,7。这两种示例聚合物均通过可逆加成-断裂链转移聚合方法合成，以实现对聚合物链长度的精确控制8,9,10。非电化学活性聚合物pNIPAM为100聚体的纯pNIPAM。电化学活性聚合物p(NIPAM-b-FMMA)同样具有100聚体的链长，其中包含4%的甲基丙烯酸二茂铁甲酯（FMMA）和96%的NIPAM。

本文展示了一种研究外加电压对聚合物聚集影响的实验方案与方法。该方法也可拓展应用于动态光散射（DLS）的其他领域，例如蛋白质折叠/去折叠、蛋白质-蛋白质相互作用以及带静电颗粒的聚集等。通过将样品从 20 °C 加热至 40 °C，以确定在无外加电场和有 1 V 外加电场条件下低临界溶解温度（LCST）的变化。随后，在保持外加电场不中断的情况下，将样品从 40 °C 冷却至 20 °C，以研究可能存在的滞后效应或平衡效应。

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方案

1. 聚合物制备示例

  1. pNIPAM 聚合物合成
    注意：本制备方法可得到 10 mL 浓度为 1 g/L 的溶液，足够进行 3–4 次实验。
    1. 准备施兰克线装置。确保冷阱杜瓦瓶中装有干冰与丙酮的混合物；若使用机械制冷阱，则需确保冷阱已达到适当温度。
    2. 在 50 mL 圆底烧瓶中加入 0.566 g N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）单体、0.016 g 可逆加成-断裂链转移聚合（RAFT）试剂（邻苯二甲酰亚氨基甲基丁基三硫代碳酸酯）、0.0008 g 2,2-偶氮双(2-甲基丙腈)（AIBN）以及 10 mL 1,4-二氧六环。将搅拌子放入烧瓶中，用橡胶隔膜密封烧瓶，外裹乙烯基胶带，搅拌使单体溶解于 1,4-二氧六环中。
    3. 进行冷冻-抽气-解冻除气操作：将圆底烧瓶浸入装有干冰与甲醇混合物的杜瓦瓶中，使溶液冻结。待全部物料冻结后，使用施兰克线的真空歧管将烧瓶抽真空至内部压力低于 100 kPa。隔离烧瓶，在静态真空条件下用温水解冻。再通过施兰克线的氮气歧管将烧瓶恢复至常压。
    4. 重复步骤 1.1.3 三次，以最大限度降低体系内氧气浓度。
    5. 向溶液中通入氮气，使体系压力与大气压平衡。将混合物置于油浴中加热至 85 °C，并在 200 rpm 条件下搅拌 36 小时。
    6. 在 50 mL 烧杯中加入 40 mL 正己烷。然后将聚合物混合物逐滴加入正己烷中。pNIPAM 应以白色絮状物形式析出。
      注意：NIPAM 单体可溶于正己烷，但 pNIPAM 在正己烷中溶解性较差。
    7. 将浑浊混合物倒入布氏漏斗中，收集白色 pNIPAM 粉末。将粉末转移至 20 mL 小瓶中，放入真空烘箱过夜，以除去残留溶剂。之后将粉末储存在密封容器中，室温保存，待用。
  2. pNIPAM-嵌段-聚（二茂铁甲基甲基丙烯酸酯）嵌段共聚物（p(NIPAM-b-FMMA)）合成
    注意：本制备方法可得到 10 mL 浓度为 1 g/L 的溶液，足够进行 3–4 次实验。
    1. 准备施兰克线装置。确保冷阱杜瓦瓶中装有干冰与丙酮的混合物；若使用机械制冷阱，则需确保冷阱已达到适当温度。
    2. 在 50 mL 圆底烧瓶中加入 0.057 g 二茂铁甲基甲基丙烯酸酯（FMMA）单体、0.016 g RAFT 试剂、0.0008 g AIBN 以及 10 mL 1,4-二氧六环。将搅拌子放入烧瓶中，用橡胶隔膜密封烧瓶，外裹乙烯基胶带，搅拌使单体溶解于 1,4-二氧六环中。
    3. 进行冷冻-抽气-解冻除气操作：将圆底烧瓶浸入装有干冰与甲醇混合物的杜瓦瓶中，使溶液冻结。待全部物料冻结后，使用施兰克线的真空歧管将烧瓶抽真空至内部压力低于 100 kPa。隔离烧瓶，在静态真空条件下用温水解冻。再通过施兰克线的氮气歧管将烧瓶恢复至常压。
    4. 重复步骤 1.2.3 三次，以最大限度降低体系内氧气浓度。
    5. 向溶液中通入氮气，使体系压力与大气压平衡。将混合物置于油浴中加热至 85 °C，并搅拌 10 小时。
    6. 将 0.543 g NIPAM 和 0.0002 g AIBN 溶解于 3 mL 1,4-二氧六环中。在氮气氛围下将该溶液加入烧瓶中，并通氮气 30 分钟。将混合物置于油浴中加热至 85 °C，并在 200 rpm 条件下继续搅拌 36 小时。
    7. 在 50 mL 烧杯中加入 40 mL 正己烷。然后将聚合物混合物逐滴加入正己烷中。由于 FMMA 单体呈深黄色，p(NIPAM-b-FMMA) 应以棕色粉末形式析出。
      注意：NIPAM 和 FMMA 单体均可溶于正己烷，但 p(NIPAM-b-FMMA) 在正己烷中溶解性较差。
    8. 将黄色浑浊混合物倒入布氏漏斗中，收集棕色 p(NIPAM-b-FMMA) 粉末。将粉末转移至 20 mL 小瓶中，放入真空烘箱过夜，以除去残留溶剂。之后将粉末储存在密封容器中，室温保存，待用。

2. DLS 样品和比色皿的制备

注意：本步骤用于为比色皿施加电压以及为动态光散射（DLS）测量准备样品。

  1. 称取10 mg聚合物粉末，溶于10 mL过滤后的去离子（DI）水中。将混合物置于冰箱中过夜。实验开始前，将样品置于冰上保存。
    注意：本实验中使用的聚合物浓度为1 g/L，但每种样品的最佳浓度范围各不相同。此外，最佳操作是将聚合物保存在其低临界溶解温度（LCST）以下，直至准备进行测试。
  2. 剪取两段6.3 mm × 7 cm的单面铜胶带（图1）。使用镊子将每段胶带粘贴在DLS样品比色皿内壁相对的两侧，且垂直于光路方向。胶带底部应接近比色皿底部。将铜胶带的边缘折叠至比色皿顶部。确保铜胶带靠近或包裹在比色皿顶部，以保证良好的电接触。同时确保铜胶带不会与用于Zeta电位测量的DLS设备的金属接触点发生连接。
  3. 用去离子水清洗比色皿三次，然后用无尘纸轻轻吸去多余的水分。

3. DLS 仪器控制与设置

注意：每次进行DLS实验前，建议完成三个对照实验：（1）空白水溶液；（2）尺寸标准品；（3）在开始温度梯度或施加电压前对聚合物进行测量。操作前请参考仪器说明书，了解样品制备、参数设置以及样品和数据质量评估的指导建议。

  1. 将 1.5 mL 过滤后的溶剂转移至比色皿中。使用去离子水。
  2. 将比色皿插入比色皿架中，确保比色皿顶部的小箭头与比色皿架对齐。关闭盖子。
  3. 在 Zetasizer 软件中，点击工具栏上的测量。对照组的手动测量已设置好。将温度设定为实验起始点。本实验选择 20 °C。
  4. 当窗口底部的文字显示为插入样品池并准备就绪后点击开始时，点击屏幕顶部的绿色三角形开始按钮。实验随即开始，此后不得再打开比色皿架。
  5. 点击多视图标签页以观察实时结果。通过监测计数率和相关函数，持续监控样品和数据质量。由于该样品仅为溶剂，不应观察到对应于颗粒存在的明显信号。
  6. 向比色皿中加入两滴标准溶液，或直接使用水对照，然后重复步骤 3.2–3.6。本实验使用可溯源至 NIST 的 20 nm 聚苯乙烯粒径标准物质。
    注意：如果水或标准溶液对照的运行结果与预期不符，应排查错误并重复实验，直至对照结果符合预期。
  7. 冲洗比色皿后加入过滤后的聚合物/测试溶液。重复步骤 3.2–3.5。应能观察到初始测试溶液的清晰测量结果。建议在进行任何温度梯度或施加电压前，先完成此步骤以获得基线测量值。

4. DLS 标准操作程序设置

注意：本节内容特指马尔文Zetasizer NanoZS DLS仪器的温度梯度操作。在开始实验前，强烈建议详细查阅仪器说明书，以获取有关选择样品池、制备样品、设定测量参数以及评估样品和数据质量的指导。

  1. 在 Zetasizer 软件（版本 7.11）中，选择 文件，然后单击 新建 以设置新的标准操作程序（图 2）。
  2. 单击 测量类型，选择 趋势 > 温度 > 粒径。
  3. 在 材料 中，选择合适的材料及其折射率。本实验选择 蛋白质 及折射率（RI）为 1.450。若需更精确地计算体积分布，建议实验者通过实验测定样品的实际折射率。
  4. 在 分散剂 中，选择合适的溶剂。本实验选择 水 作为溶剂。
  5. 在 样品池 中，选择所使用的比色皿。本实验使用一次性比色皿（DTS0012）。
  6. 在 序列 中，设置 起始温度 和 终止温度。对于加热实验，将 起始温度 设为 20 °C，终止温度 设为 40 °C；对于冷却实验，则相反。取消勾选 返回起始温度 选项。
  7. 设置每个温度步长的变化间隔。本实验中选择 1.5 °C。
  8. 在 粒径 测量中，设置 平衡时间。本实验中设为 120 秒。选择测量次数：进行 3 次测量，并将测量时长设为 自动。
  9. 保存标准操作程序，然后关闭文件。
  10. 若需施加电压，在继续操作前请先设置电化学工作站（第 5 节）。
  11. 电化学工作站设置完成后，或无需施加电压时，返回 Zetasizer 软件，单击工具栏上的 测量，然后单击 启动标准操作程序。
  12. 当标准操作程序窗口底部显示 插入样品池并准备就绪后按开始 时，单击屏幕顶部的绿色三角形启动按钮。实验随即开始，此后不得打开比色皿 holder。
  13. 单击 多视图 选项卡以观察实时结果。通过监测计数率和相关函数，持续监控样品状态和数据质量。代表性实验结果见 图 3-5。

5. 电化学工作站设置

注意：建议使用同一台计算机进行粒径和施加电压的操作，以实现数据的时间同步，从而便于后续评估。有关线路设置、软件操作及参数选择的指导，请参考施加电压仪器的使用手册。本实验中使用了Gamry电化学工作站。

  1. 准备两根足够细的导线，使其能够穿过DLS比色皿支架区域右上边缘的小缝隙（图6）。在导线的一端剥去绝缘层，以便与恒电位仪连接；在另一端焊接一个短鳄鱼夹，并将其连接到比色皿上。确保DLS样品盖已关闭。
  2. 将白色参比电极导线和红色对电极导线夹在一起，并连接至其中一根准备好的导线上；将绿色工作电极导线和蓝色工作传感电极导线夹在一起，并连接至另一根导线上。本实验中不使用橙色对电极传感导线和黑色接地导线，使其悬空。为防止电路短路，这些导线不得接触其他导线或导电表面。
    注意：各导线连接至哪一侧并无影响。
  3. 在软件工具栏中，点击 实验，然后选择选项 E 物理电化学，并选择 计时安培法。本实验采用简单的施加电压方式，即施加单一电压并测量随时间变化的电流响应（即计时安培法）。无论具体采用何种电化学方法，均建议监测系统随时间的响应情况。
    1. 设置 预步、步骤1 和 步骤2 电压（相对于参比电极），该电压将施加在整个电场/比色皿上。将三个步骤的 电压 均设为相对于参比电极为 1 V。
    2. 设置 预步延迟时间。本实验中设为 0.5 s，以确保在记录信号前系统已在目标电压下达到稳定状态。
    3. 设置 步骤1时间 和 步骤2时间，以控制电压施加的持续时间。将两者均设为 14,400 s，以确保在整个DLS实验过程中持续施加电压。
    4. 设置 采样周期，即图表读取和记录电流与电压值的频率。本实验中使用 10.0 s。
      注意：其他设置对本文所展示的数据无显著影响，采用系统默认值即可。
  4. 点击 确定。顶部工具栏将显示 运行中 标志，表示正在施加电压。此时电流应产生适度响应（µA级别），且不应使恒电位仪过载。若未观察到信号或信号过大，可能是系统连接错误，需排查故障并重复操作，直至观察到预期的电流响应。
  5. 返回步骤 4.10，启动DLS标准操作程序（SOP）。

6. 数据分析

注意：本节详细说明了用于理解所获得数据的初步分析。

  1. 将数据导入首选的数据分析和绘图软件。
  2. 针对在给定温度下的一组测量中的每次运行，确定体积百分比最大的峰所对应的粒子体积尺寸。
  3. 计算在给定温度下三次记录测量值的体积尺寸的平均值和标准偏差。
  4. 对于每个实验，以平均尺寸 ± 标准偏差为纵坐标（对数尺度），温度为横坐标（线性尺度）作图。
  5. 导入Gamry电流数据进行分析。以时间为横坐标，电流（单位：微安）为纵坐标绘制电流数据曲线。
  6. 为了将电流数据与粒子尺寸数据关联，需比较Zetasizer数据的时间戳与Gamry电流数据的时间戳。若两类数据由同一台计算机采集，则可实现精确比对；否则，应尽可能匹配记录的时间。

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结果

在温度梯度过程中，每次运行的实时文件输出以表格形式呈现，如图3所示。每条记录均可独立选择，以查看粒径分布（图4）和相关系数（图5）。体积粒径分布（PSD）是解释整体分布和LCST最准确的数据，但应通过相关性图谱（图5）评估数据质量，以确定是否需排除某些数据点。具有总体平滑曲线的相关性图谱（图5）被视为高质量数据；而非平滑曲线或低质量数据则应考虑在分析中予以排除。24.5 °C时的曲线存在一些波动和微小峰，但这可归因于聚合物聚集的快速变化，因此这些数据仍被保留。这证实了在施加电压条件下，我们改进系统所采集的DLS数据质量与常规DLS数据相当。

如

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讨论

对 pNIPAM 或 p(NIPAM-b-FMMA) 溶液施加电压后，聚合物的聚集行为随温度发生变化。对于这两种材料，在施加电压的情况下，即使将溶液冷却至其低临界溶解温度（LCST）以下，聚合物的体积仍保持较大。这一结果出乎意料，因为在未施加电压的实验中，聚合物会恢复至原始尺寸。这些实验使我们得出结论：在本研究的温度范围内，只要施加电压，无论是否在 pNIPAM 中添加电活性单体，聚合物的聚集过程均不能完全可逆。

进一步观察图9以及p(NIPAM-b-FMMA)的LCST变化，还可发现另一个有趣的结果。在无电压条件下，聚集体的最大体积尺寸约为1000 nm，且聚集过程可逆；然而，在施加电压的情况下，稳定的聚集体尺寸约为100 nm，且不可逆。这表明，与未施加电压的情况相比，施加电压后形成了一个新的稳定聚集体状态。

恒定电压下测得的电流响应也可能为聚集行为提供线索。由于文件带有时间戳，因此可以将电流与温度的相对变化进行匹配，尽管由于D...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢美国国家科学基金会（NSF，项目号 CBET 1638893、CBET 1638896）、美国国立卫生研究院（NIH，项目号 P20 GM113131）以及新罕布什尔大学哈梅尔本科研究中心提供的经费支持。此外，作者感谢 Darcy Fournier 在布线方面提供的帮助，以及 Scott Greenwood 提供的动态光散射（DLS）仪器使用权限。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
N-异丙基丙烯酰胺东京化成工业株式会社I0401-500G
1,4-二氧六环Alfa Aesar39118
2,2"-偶氮双(2-甲基丙腈)SIGMA-ALDRICH441090-100G
比色皿MalvernDTS0012
动态光散射仪MalvernZetasizer NanoZS
甲基丙烯酸羟基二茂铁甲酯ASTATECHFD13136-1G
邻苯二甲酰亚胺甲基丁基三硫代碳酸酯SIGMA-ALDRICH777072-1G
电化学工作站GamryReference 600

参考文献

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