这里介绍的是一个协议,用于使用标准实验室设备,使用不连续的牛血清白蛋白密度梯度,丰富白细胞、圆形精子和从成年小鼠睾人身上拉长精子。
为了描述精子的产生的每一个步骤,研究人员必须从睾体中分离不同的生殖细胞亚群。然而,分离离散种群具有挑战性,因为成人睾体包含来自精子生成所有步骤的生殖细胞与某些体细胞群体的复杂混合。在过去的几十年中,不同的技术,如离心电镀、荧光活性细胞分类(FACS)和STA-PUT已经成功地应用于生殖细胞的分离。缺点是它们都需要专用设备和专门培训。遵循STA-PUT方法背后的原则,开发了一个简单的方案,用于分离帕基滕特精子细胞、圆形精子和从小鼠睾体内拉长精子。在制备睾丸细胞的单细胞悬浮液后,通过不连续的牛血清白蛋白(BSA)密度梯度通过重力沉淀富集特定细胞群。然后手动收集细胞分数并进行微观分析。这种圆形精子(MDR)沉降方案的改性密度梯度可以广泛应用,因为它只需要标准的实验室设备。此外,该协议要求最少的起始材料,降低其成本和实验室动物的使用。
关于哺乳动物精子生成过程中发生的分子和生物学事件,仍有很多未知数,这是一个复杂的过程,精子干细胞在过程过程中转化为高度专业化的精子1,2。精子发生发生在睾的小管内。管状包含从分化的每一步的生殖细胞的混合物,包括精子干细胞,线粒分离精子,中度精子细胞,和后美形精细胞(从圆形进行单倍体分化精子以拉长精子,最后成熟精子。睾体的体细胞包括与分管内生殖细胞混合的Sertoli细胞,形成管状细胞壁的管状体细胞,以及小管间间空间中产生睾丸激素的Leydig细胞。
研究精子生成过程中的分子和生化过程通常需要将不同的生殖细胞群体从睾丸细胞的复杂混合物中分离出来。已经为细胞富集制定了许多不同的策略。最成功的方法是STA-PUT速度沉积单位重力3,4,5,6,离心电离电,基于反流量离心7,8,荧光激活细胞分类(FACS),根据DNA含量和/或特定标记分离细胞。这些方法常用于精子生成研究人员,并允许有效富集特定的生殖细胞类型。但是,这些技术的一个限制是它们需要需要专业知识的专用、昂贵的硬件。
这里介绍的是一个简单和廉价的协议,用于分离小鼠睾剂三个最丰富的细胞群的丰富种群:圆形精子、pachytene精子细胞和拉长精子。该协议被称为圆形精子(MDR)的修饰密度梯度,因为它特别适用于丰富圆形精子。MDR 方法基于与 STA-PUT 速度沉积相同的原理,但它只需要标准实验室设备。活细胞通过人工制备的不连续牛血清白蛋白(BSA)密度梯度在地球引力场下的标准50 mL管内沉积。较大的细胞在梯度中移动得更快,梯度分离不同的生殖细胞群体。沉淀后,手动收集三种细胞类型的丰度。这些富集细胞群的纯度与STA-PUT和离心性脱氧核糖核化获得的纯度相当。
除了涵盖BSA梯度的构造和使用速度沉积外,该协议还描述了一种从精细胞小管中释放睾丸细胞的消化方法。该协议从Romrell等人9开发的方案进行了修改,包括胶原酶IV和胰蛋白酶的连续消化。顺序消化结合使用碳酸氢盐缓冲液(即Krebs溶液)已被证明能大大提高生殖细胞的分离和生存能力9。
在MDR浓缩期间,细胞在精透管环境外一起花费约4小时,不受压力机械力的影响,从而可以收集高度可行的细胞分数进行下游分析。此外,与离心电镀和STA-PUT类似,MDR协议不需要对细胞进行任何化学处理或贴标签,这也有助于维持细胞的生存能力。重要的是,只要两个成年小鼠睾号就足以进行MDR分离,因此,一只成年小鼠为RNA和蛋白质分析提供了足够的富集细胞。标准STA-PUT协议建议使用多达12只成年小鼠进行细胞分离6;虽然,根据以往的经验,众所周知,成功的分离可以从三到四个成年小鼠。据报道,足以进行离心性电镀的起始材料量最低,为6只小鼠睾(3只小鼠)8。因此,除了消除对昂贵的专用设备的需求外,MDR 协议还减少了所需的实验室动物数量。
这里介绍的是一个简单和廉价的协议,用于使用标准实验室设备分离丰丰的圆形精子群、pachytene精子细胞和拉长精子(图4所示的协议概述)。虽然不需要专业知识或昂贵的机械,但有一些关键步骤,必须考虑在组织消化,梯度的构造,和加载细胞悬浮到梯度。
生殖细胞通过两个连续的酶消化从精嫩小管中释放。第一次消化与胶原酶 IV 通过去除间质细胞分离小管。长时间的消化时间可能会损害小管并导致精子损失,因为(如果在这一步中从小管中释放出来),它们将在以下步骤中被丢弃。胰蛋白酶的第二个消化步骤从精氨酸小管中释放生殖细胞。可能偶尔有细胞解说,通常由于释放的基因组DNA而形成一些团块。不建议超过建议的消化持续时间或温度,因为这可能导致较差的生存能力、增加的细胞解结和结块。如果确实发生轻度结块,可以忽略结块。然而,在细胞严重聚集和损失的情况下,胰蛋白酶的消化时间或浓度应减少。还应注意的是,胰蛋白酶的酶活性可能因批次和储存时间过长而异。胰蛋白酶消化期间的DNase I的量也可以增加以去除多余的团块,但这应被视为二次溶液。在预处理结束时获得同质单细胞悬浮液非常重要,因为结块细胞会更快地沉淀,污染分数并破坏梯度。
构建渐变可能需要一些练习。如果使用带移液器控制器的 5 mL 移液器尖端有不适,建议使用带光滑活塞的正常 1 mL 机械移液器,然后将移液器吸头切割到直径为 ±3 mm 的孔径(图 1B)。更大的孔径和平滑的BSA溶液负载将降低混合梯度的风险。如果准备得当,可以看到相邻 BSA 解决方案之间的边界,因为它们具有不同的折射率。渐变应在使用前直接生成。还应注意的是,任何小的震动或振动都可能干扰梯度,因此梯度应设置在不受干扰的环境中。
必须非常小心地将电池悬架加载到梯度上。加载后,细胞悬浮液应停留在梯度的顶部,从梯度中,细胞将缓慢地开始通过第一层沉淀。如果看到大群细胞在梯度中快速移动,细胞可能不会被小心地重新悬浮,或者有多余的聚集。如果细胞在加载时不停留在不连续的 BSA 梯度的顶部,但会立即在 1% 和 2% BSA 层之间下沉(步骤 3.6),则细胞悬浮液可能过于密集。该协议已使用两个成人小鼠的睾号(80-120毫克/睾号)作为起始材料进行优化;但是,使用减少起始材料量的成功隔离已经执行。为了扩大协议,从更多的睾体内获得更丰富的生殖细胞,应引入具有梯度的50 mL管。
该协议初步开发并优化,以丰富成年小鼠睾体内的单倍体圆形精子,预计圆形精子分馏的纯度为90%以上。除了高度纯的圆形精子分馏分外,还获得了富集乳酸盐精细胞和拉长精子的满意结果。应当指出,红细胞可能会污染细长的精子分数,如果红细胞的存在预计会干扰下游分析,则应采取进一步措施消除它们。我们未能利用MDR协议从成年小鼠中丰富其他细胞类型,如前介细胞或早期介体细胞(在pachytene阶段之前)。
此外,STA-PUT沉淀已经成功地用于利用在出生13后的给定时间点收集的幼鱼睾细胞获得精原体或前乳酸酯、瘦素和酶氨酸精子细胞的丰富部分。这种方法利用了这些细胞类型在第一波精子生成期间的外观。同样的方法可能也适用于MDR浓缩,但尚未在实践中得到测试。另一种在分化特定阶段纯化前细胞和中微细胞的良选是FACS,它的重要优点是允许基于存在特定标记物分离特定细胞类型14 ,15,16,17.
总体而言,MDR速度沉淀是生殖细胞富集的有用方法。虽然这种方法在富集细胞的纯度或数量方面并不优于其他成熟的方法,但其明显的优点是简单,设置成本低。再加上所需的起始材料量少,使该协议成为精子产生领域的研究人员和可能不希望投资于专用硬件或大型动物群的其他领域的研究人员的绝佳选择。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢所有Kotaja实验室成员在协议开发过程中的贡献,以及在其研究项目中积极使用和测试该协议。我们尤其感谢扬·林德斯特伦在优化协议方面的贡献。这项研究得到了芬兰科学院、西格丽德·尤塞柳斯基金会和图尔库分子医学博士项目的支持。
4% Paraformaldehyde | Preference of researcher | ||
AlexaFluor488 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
AlexaFluor647 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A-31571 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9647 | |
CaCl2·2H2O | Preference of researcher | ||
Collagenase IV | Sigma | C5138 | |
Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836145001 | |
DDX4 antibody | Abcam | ab13840 | |
Dextrose | Preference of researcher | ||
DNase I | Worthington | LS006355 | |
GAPDH | HyTest | 5G4 | |
HRP-linked anti-mouse IgG | GE Healthcare Life Sciences | NA931 | |
HRP-linked anti-rabbit IgG | GE Healthcare Life Sciences | NA934 | |
KCl | Preference of researcher | ||
KH2PO4 | Preference of researcher | ||
MgSO4·7H2O | Preference of researcher | ||
NaCl | Preference of researcher | ||
NaHCO3 | Preference of researcher | ||
NH4Cl | Preference of researcher | ||
Pierce BCA protein assay kit | Life Technologies | 23227 | |
PIWIL1 | Cell Signaling Technology | G82 | |
PIWIL2, clone 13E-3 | Millipore | MABE363 | |
Prolong Diamond Antidafe Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36962 | for Alexa Fluor immunostainings |
rabbit IgG | Neomarkers | NC-100-P | |
Rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA) | Vector Laboratories | RL-1072 | |
RIPA buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1% NP-40, 0.5% w/v sodium deoxycholate, 0.05% w/v SDS, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1x protease inhibitor cocktail, 0.2 mM PMSF and 1 mM DTT | ||
TRIsure | Bioline | BIO-38033 | |
Triton X-100 | Preference of researcher | nonionic surfactant | |
Trypsin | Worthington | LS003703 | |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | for standard DAPI analysis of cell fractions |
γH2AX antibody | Millipore | 05-636 | |
0.22 µm filter | Sartorius | Sartolab BT 180C6 | or equivalent |
1 ml mechanical pipette | Preference of researcher | ||
1.5 mL or 2 ml tubes | Preference of researcher | ||
40 µm cell sieves for 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 542040 | or equivalent cell strainer |
5 mL serological pipettes | Sarstedt | 86.1254.001 | or equivalent |
50 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
6 cm Petri dishes | Preference of researcher | ||
cell culture incubator | Preference of researcher | ||
centrifuge for 50 mL tubes | Preference of researcher | ||
grease pen for microscopy glass slides | Preference of researcher | ||
HulaMixer Sample Mixer | Thermo Fisher Scientific | 15920D | or equivalent cell rotator |
microdissection forcepts | Preference of researcher | ||
microdissection scissors | Preference of researcher | ||
microscopy glass slides and coverslips | Preference of researcher | ||
Nanodrop 1000 | Thermo Scientific | ||
Pipetboy Acu 2 | Integra | 155 000 | or equivalent pipette controller |
refrigerated centrifuge for 1.5 mL tubes | Preference of researcher | ||
tips for 1 ml mechanical pipette | Preference of researcher | ||
water bath | Preference of researcher | ||
widefield fluorescence microscope | Preference of researcher |