利用常规实验室设备从小鼠睾丸中富集粗线期精母细胞和精子细胞

摘要

本文介绍了一种利用不连续的牛血清白蛋白密度梯度，结合常规实验室设备，从成年小鼠睾丸中富集粗线期精母细胞、圆形精子细胞和伸长中的精子细胞的实验方案。

摘要

为了表征精子发生过程的各个阶段，研究人员必须从睾丸中分离出不同亚群的生殖细胞。然而，分离特定细胞群体具有挑战性，因为成年睾丸包含处于精子发生各个阶段的生殖细胞混合物，同时还存在某些体细胞群体。在过去的几十年中，已成功应用多种技术进行生殖细胞的分离，例如离心淘析、荧光激活细胞分选（FACS）和STA-PUT法。但这些方法的缺点是均需要专用设备和专门培训。基于STA-PUT方法的原理，目前已建立一种简便的实验方案，用于从小鼠睾丸中分离粗线期精母细胞、圆形精子细胞以及伸长中的精子细胞。在制备睾丸细胞的单细胞悬液后，通过不连续的牛血清白蛋白（BSA）密度梯度沉降，利用重力沉降富集特定的细胞群体。随后手动收集细胞组分，并进行显微镜分析。这种用于圆形精子细胞分离的改良密度梯度（MDR）沉降方案具有广泛的适用性，因其仅需常规实验室设备即可完成。此外，该方案所需起始材料极少，从而降低了成本并减少了实验动物的使用。

引言

关于哺乳动物精子发生过程中发生的分子和生物学事件，目前仍有许多未知之处。精子发生是一个复杂的过程，其间精原干细胞会转化为高度特化的精子^1,2。精子发生发生在睾丸的曲细精管内。曲细精管中含有处于各个分化阶段的生殖细胞，包括精原干细胞、有丝分裂的精原细胞、减数分裂的精母细胞以及减数分裂后的精子细胞（这些细胞经历单倍体分化，从圆形精子细胞逐步发育为伸长的精子细胞，最终形成成熟的精子）。睾丸中的体细胞包括位于曲细精管内与生殖细胞交错分布的塞尔托利细胞、构成曲细精管壁的管周肌样细胞，以及位于曲细精管之间间质区域中可产生睾酮的莱迪格细胞。

研究精子发生过程中的分子和生化过程，通常需要从睾丸细胞的复杂混合物中分离出不同的生殖细胞群体。目前已开发出多种细胞富集策略。其中最成功的方法包括利用单位重力进行的STA-PUT速度沉降法^3,4,5,6、基于逆流离心的离心淘析法^7,8，以及根据DNA含量和/或特异性标志物对细胞进行分选的荧光激活细胞分选技术（FACS）。这些方法在精子发生研究领域被广泛使用，能够高效富集特定类型的生殖细胞。然而，这些技术的局限性在于需要使用专业且昂贵的设备，并要求操作者具备相应的专业技术知识。

本文介绍一种简单且低成本的方法，用于分离小鼠睾丸中三种最丰富的细胞群体：初级精细胞（圆型精子细胞）、粗线期精母细胞和伸长期精子细胞。该方法被称为改良密度梯度法（MDR），因其在富集初级精细胞方面效果尤为显著。MDR方法基于与STA-PUT速度沉降法相同的原理，但仅需常规实验室设备即可完成。活细胞在标准50 mL离心管中，通过人工制备的不连续牛血清白蛋白（BSA）密度梯度，在地球重力场作用下自然沉降。较大的细胞在梯度中沉降速度更快，从而实现不同生殖细胞群体的分离。沉降完成后，可手动收集三种细胞类型的富集组分。这些富集细胞群体的纯度与通过STA-PUT法和离心淘析法获得的结果相当。

除了介绍用于速度沉降的 BSA 梯度的制备和使用外，本实验方案还描述了一种消化方法，用于从曲细精管中释放睾丸细胞。该方案经 Romrell 等人⁹建立的方法修改而来，包括使用 IV 型胶原酶和胰蛋白酶进行连续消化。研究表明，连续消化结合碳酸氢盐缓冲液（即 Krebs 溶液）的使用可显著提高生殖细胞的分离效果和存活率⁹。

在MDR富集过程中，细胞在生精小管环境之外共同孵育约4小时，且未受到机械应力的影响，这使得后续分析可获得高活力的细胞组分。此外，与离心淘析法和STA-PUT法类似，MDR方案无需对细胞进行任何化学处理或标记，也有助于维持细胞活力。重要的是，仅需两只成年小鼠的睾丸即可完成MDR分离，因此一只成年小鼠提供的细胞已足够进行RNA和蛋白质分析。标准STA-PUT方案建议使用多达12只成年小鼠进行细胞分离⁶；然而，根据以往经验可知，使用3至4只成年小鼠也可成功完成分离。此前报道中用于离心淘析法的最低起始材料量为六只小鼠睾丸（三只小鼠）⁸。因此，MDR方案不仅无需昂贵的专用设备，还减少了实验动物的使用数量。

方案

实验室小鼠的饲养和所有实验均按照有关实验动物护理和使用的相关指南和规定进行。

1. 仪器与试剂准备

1. 将水浴锅温度设置为 37 °C。
2. 将细胞培养箱设置为 34 °C、5% CO₂、95% 湿度。将试管旋转仪放入培养箱内。
   注意： 培养箱调节内部温度需要较长时间。若无始终维持在 34 °C 的培养箱，需在实验前一天提前设置。
3. 准备并标记适量的显微镜玻片。用润滑笔画一个直径约 1 cm 的圆环，并让润滑剂自然干燥。
4. 配制 pH 7.8 的 1× Krebs 缓冲液（表 1）。取两支锥形管，每管加入 50 mL 1× Krebs 缓冲液，置于 34 °C 预热，用于步骤 2.5−2.8。其余 1× Krebs 缓冲液储存于 4 °C 或冰上。
5. 配制 BSA 溶液。首先在 1× Krebs 缓冲液中溶解 2.5 g BSA，定容至 25 mL，配成 25 mL 的 10% (w/v) BSA 溶液。用 1× Krebs 缓冲液稀释 10% BSA 溶液，获得不同浓度的 BSA 溶液（表 2）。所有 BSA 溶液均保存在 4 °C。
   注意： 应在实验当天配制溶液，并于 4 °C 保存至使用前。
6. 称取适量胰蛋白酶和胶原酶，分别加入 50 mL 锥形管中，以配制消化酶溶液（表 3）。

2. 动物解剖与生殖细胞悬液的制备

注意： 完成此步骤大约需要 1 小时。

1. 通过颈椎脱位或 CO₂ 窒息法处死一只成年雄性小鼠（7 周龄或以上，睾丸重量根据品系和年龄在 80−120 mg 之间）。
2. 用 70% 乙醇喷洒小鼠腹侧腹部，使用剪刀切开腹盆腔，形成 V 形开口。
3. 用镊子牵拉附着在附睾上的脂肪垫，找到睾丸并用剪刀将其取出，避免破坏白膜。将睾丸置于含有 1× Krebs 液的 6 cm 培养皿中。
4. 剥离睾丸包膜并弃去白膜。用镊子轻轻分离，使曲细精管略微散开。
5. 用镊子将曲细精管转移至含有 2 mL 新鲜配制的胶原酶溶液的 50 mL 锥形管中（表 3）。
6. 将曲细精管在 37 °C 水浴中孵育 3 分钟，轻轻摇动锥形管以混匀。
   注意：由于间质细胞被去除，曲细精管应在 3 分钟内自由悬浮。睾丸细胞的生理温度为 34 °C，因此长时间消化通常在此温度下进行。然而，本步骤中短暂的 3 分钟消化可在 37 °C 下进行（厂家推荐温度）。需注意，若使用 34 °C，消化时间应重新优化。
7. 加入至少 40 mL 温热的 1× Krebs 液，室温（RT）静置约 1 分钟使曲细精管沉降。吸除上清液，并重复洗涤一次。
8. 加入 25 mL 新鲜配制的胰蛋白酶溶液（表 3），将锥形管置于 34 °C 培养箱内的旋转仪上，孵育 15−20 分钟（约 15 rpm）。间歇性检查曲细精管的消化状态。当溶液变浑浊且仅剩少量小片段时，立即将管子置于冰上，并立即进入下一步。
   注意：为避免过度消化和细胞裂解，应迅速进行后续洗涤步骤。某些方案使用胎牛血清（FBS）灭活胰蛋白酶。本方案省略 FBS 处理，而是通过立即离心及后续用冷 1× Krebs 液洗涤来去除胰蛋白酶。
9. 将溶液通过 40 µm 细胞滤网过滤至另一置于冰上的 50 mL 锥形管中。
10. 在 4 °C 下以 600 × g 离心 5 分钟，收集细胞沉淀。
    注意：离心力过大可能损伤细胞。
11. 小心倾倒去除上清液。
12. 轻弹管底，使细胞沉淀在残留的 1× Krebs 液中重悬。
13. 向重悬的细胞中加入至少 40 mL 冷的 1× Krebs 液。
14. 重复步骤 2.10 和 2.11。
15. 轻弹含有细胞沉淀的管子使细胞重悬。加入 1 mL 含 0.5% BSA 的 1× Krebs 液，使用剪去尖端的移液器吸头反复吹打溶液使细胞充分重悬。避免产生气泡。
16. 最后加入 1−3 mL 含 0.5% BSA 的 1× Krebs 液，使终体积约为 3 mL。将生殖细胞悬液通过 40 µm 细胞滤网过滤后，立即进行 BSA 梯度加载。

3. 通过不连续 BSA 梯度分离生殖细胞

注意：本步骤大约需要 2 小时完成。在洗涤步骤（步骤 2.10−2.14）期间开始制备不连续 BSA 梯度，以便在预处理完成后立即加载细胞。

1. 将一个50 mL离心管垂直放置在冰上，使其一侧可见。或者，在4 °C的冷藏室中进行该实验步骤，此时无需使用冰。
2. 从10 mL移液管的尖端向上约5−10 mm处剪断，以获得更大的开口（图1A），然后将其安装在移液控制器上（图1C）。
   注意：这将降低移液时的流速，有助于不同BSA溶液的分层。或者，可使用带有平滑活塞的1 mL机械移液器，并将移液器吸头剪裁至直径约3 mm的开口（图1B）。
3. 首先用移液器将5 mL的5% BSA溶液加至50 mL离心管底部。
4. 缓慢地将5 mL的4% BSA溶液叠加在5%溶液之上。开始时轻轻将剪裁过的移液器尖端接触5%溶液的液面，并在保持与液面轻触的同时逐层加入，注意避免移液器尖端浸入下层溶液中。
   注意：此步骤结束后，两层溶液之间应可见一条清晰的分界线。
5. 重复步骤3.4，依次加入其他浓度的BSA溶液，形成从5%到1%的不连续梯度（图1D）。
6. 小心地将单细胞悬液加在梯度溶液上方，避免扰动。将细胞在4 °C或冰上静置沉降1.5小时。

4. 富集生殖细胞组分的收集

注意： 本部分大约需要 30 分钟完成。

1. 将1 mL移液器吸头安装到1 mL机械移液器上，并将吸头末端剪切，使孔径约为3 mm（图1B）。
2. 从BSA梯度的顶部开始，使用单独的1.5 mL离心管小心收集约1 mL的组分，并置于冰上保存。按照收集顺序对离心管进行编号。
   注意： 此时应得到一系列约28个含有细胞悬液的离心管。使用带有平滑活塞的1 mL机械移液器，并将移液器吸头剪切，以尽量减少对BSA梯度的扰动。
3. 在4 °C条件下，以600 × g 离心10分钟，对生殖细胞组分进行离心。
4. 小心操作，避免扰动沉淀，弃去大部分上清液，并通过轻弹离心管重悬细胞沉淀。向每管中加入1 mL预冷的1×Krebs缓冲液，重复离心步骤。
   注意： 若BSA干扰后续分析，请重复洗涤步骤。
5. 最后一次洗涤后，弃去大部分上清液，但保留约100 µL。小心重悬细胞沉淀。
   注意： 小心重悬细胞可确保从此溶液中取出的样品代表该组分中的全部细胞。在制备载玻片期间，始终将细胞悬液置于冰上。

5. 细胞组分分析

注意： 分析需要 2 小时完成。

1. 每次取 20 µL 的 4% 多聚甲醛（PFA），加入编号载玻片上每个油性笔画出的圆圈内。
2. 立即向对应组分的细胞悬液中加入 2 µL，并重复此步骤处理每个组分。
   注意：制备载玻片过程中，所有细胞悬液均需置于冰上保存。
3. 室温下干燥载玻片 1 小时至过夜（O/N）。
   注意：在此步骤期间，从各组分取样后，细胞可用于后续分析或储存（见第 6 节）。
4. 用 1× PBS 清洗载玻片一次，然后使用含 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂进行封片（材料表）。
5. 在荧光显微镜下观察载玻片，以评估各组分中富集的特定生殖细胞类型。
   注意：不同细胞类型可通过 DAPI 染色所显示的特征性细胞核形态进行识别。图 2A 展示了分别富集伸长精子细胞、圆形精子细胞和粗线期初级精母细胞的代表性组分。圆形精子细胞的细胞核较小（直径约 6−7 µm），呈圆形（图 2A）。小鼠圆形精子细胞的细胞核还具有一个单一、圆形的异染色质结构，称为染色中心。伸长精子细胞的细胞核具有典型的细长形状，且由于染色质浓缩，核体积减小（图 2A）。粗线期初级精母细胞的细胞核更大（直径超过 10 µm），形状更不规则，其内部散布着多个致密染色质区域（图 2A）。
6. 如有必要，可在 DAPI 染色基础上增加免疫荧光染色，以辅助识别不同细胞类型。
   1. 此时，在油性笔画出的圆圈内，将 2 µL 细胞悬液与 20 µL 固定液（含 4% PFA 和 0.1% 非离子型表面活性剂的 PBS 溶液）混合。待载玻片干燥后，在室温下用 4% PFA 再固定细胞 10 分钟。
   2. 用 PBS 清洗，然后用含 0.1% 非离子型表面活性剂的 PBS 溶液透化处理 5 分钟。再次用 PBS 清洗，并将载玻片在 100 mM NH₄Cl 溶液中孵育 5 分钟，以淬灭残留的 PFA 活性。
   3. 用 PBS 清洗后，按照标准免疫荧光流程进行操作，包括封闭、与特异性一抗孵育，以及与荧光标记的二抗孵育。使用含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂封片（材料表），并静置 24 小时使其充分固化。
      注意：可用于一抗孵育的有用标志物示例包括：花生凝集素（PNA；封闭液中稀释 1:2,000），可标记圆形和伸长精子细胞的顶体；抗 DDX4 抗体（封闭液中稀释 1:200），可标记圆形精子细胞中单个胞质颗粒；抗 γH2AX 抗体（封闭液中稀释 1:100），可识别粗线期初级精母细胞中的性染色质体。代表性结果及 图 2C,D 展示了各组分免疫荧光分析的示例。

6. 剩余样本的处理与保存

注意： 第6节大约需要20分钟完成。

1. 每个组分取样制备显微镜载玻片后，向各组分中加入 1 mL 冰冷的 1× Krebs 溶液，并在 4 °C 条件下以 600−13,000 × g 离心 10 分钟，使细胞沉淀。
   注意：低速离心会导致细胞沉淀松散，难以完全去除 1× Krebs 溶液；而高速离心可能损伤细胞。应根据下游实验方案的具体要求选择合适的离心速度。
2. 移除并弃去上清液，随后进行所需的下游分析。
   注意：此时，细胞可迅速在液氮中冷冻，并于 -70 °C 保存。熟练掌握该技术后，也可直接进行偏好的下游实验流程，但始终建议取样以确认各组分的纯度。可提取总 RNA，进行定量，并通过逆转录聚合酶链式反应（PCR）或 RNA 测序等方法进行分析。也可制备总蛋白提取物，用于免疫共沉淀或蛋白质印迹分析（图 3）。

结果

通常认为，生殖细胞类型的富集程度足够高是指超过80%⁶。MDR方案在富集圆形精子细胞方面效果尤为显著，使用该技术可常规获得高比例（>90%）的纯圆形精子细胞。粗线期初级精母细胞和伸长中精子细胞的最佳富集比例分别约为75%和80%。伸长中精子细胞倾向于停留在梯度上层，并随第一组分被收集。在所示示例中，第1组分含有约80%的伸长中精子细胞（图2B）。使用该技术获得的大多数伸长中精子细胞具有浓缩的细胞核，而未浓缩的早期伸长中精子细胞则较为稀少（图2A）。后续组分则富含圆形精子细胞。在该示例中，第2、3和4组分中圆形精子细胞的富集度均超过90%，共有七个组分（2−8）的富集度高于80%（图2B）。由于体积较大，粗线期初级精母细胞沉降速度较快，最后被收集。在该纯化示例中，第14和15组分的富集度约为75%（图2B）。

尽管通过DAPI染色观察到的细胞核形态通常足以识别细胞，但仍可进行免疫荧光分析以辅助鉴定。PNA可染色正在发育的顶体，标记出圆形和伸长的精子细胞，且可通过顶体的形态特征进一步将圆形精子细胞细分为分化过程中的第1–8步¹⁰。区分经PNA染色的伸长型与圆形精子细胞主要依据其细胞核形态的差异（图2C，左图）。抗DDX4抗体是鉴定圆形精子细胞组分的有效标记物，因其可在每个圆形精子细胞的细胞质中显示一个单一的DDX4阳性核周颗粒结构，即染色质小体（CB）。这种特异于CB的染色模式易于与初级精母细胞中更为弥散分布的细胞质染色相区分（图2C，中图）。粗线期精母细胞可通过抗-γH2AX抗体进行识别，该抗体特异性地标记第一次减数分裂粗线期出现的性染色质体（sex body）（图2C，右图）。在本项纯化实验中，PNA染色结果显示，MDR富集的圆形精子细胞组分包含处于不同分化阶段的圆形精子细胞混合物，且所有细胞均具有其特征性结构——DDX4阳性的染色质小体（CB）（图2D，RS组分）。抗-γH2AX染色进一步证实了第16组分中粗线期精母细胞的有效富集（图2D，PSpc组分）。

细胞计数结果显示，圆形精子细胞和粗线期初级精母细胞组分中的细胞数量足以满足多种下游分析的需求。圆形精子细胞组分（5−8）每份约含有 2.5 × 10⁶ 个细胞，因此通过合并这些组分，可获得超过一千万个细胞。粗线期初级精母细胞组分（14 和 15）通常所含细胞略少，在本次分离中，每份约计数到 1.5−2.0 × 10⁶ 个细胞。第一份组分含有 0.75 × 10⁶ 个伸长中的精子细胞。

如图3A所示，从大多数组分中获得的总RNA量为0.5−2.5 µg，足以用于后续RNA分析，如逆转录PCR、RNA测序或在凝胶上对RNA进行可视化检测。每个组分中获得的蛋白质量通常为20−140 µg（图3B），足以进行多次蛋白质印迹（western blot）分析。通过收集的组分制备全细胞裂解液，并使用可检测DDX4、PIWIL1和PIWIL2的抗体进行蛋白质印迹分析，这些蛋白在粗线期精母细胞和圆形精子细胞中高表达，而甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）则为普遍表达。

在本实验方案中，单个组分来源的蛋白裂解液取10%即可在标准Western印迹条件下清晰检测到所有这些蛋白（图3C）。单个组分中的蛋白量也足以使用抗PIWIL1抗体进行免疫共沉淀，并可检测到共沉淀的PIWIL2蛋白（图3D）。此外，该方案已成功用于从对照组和基因修饰小鼠中获得粗线期精母细胞和圆形精子细胞的富集组分，适用于后续定量逆转录PCR¹¹和高通量RNA测序¹²等应用。

图1：不连续BSA梯度的制备。（A）用于制备梯度的5 mL血清学移液器吸头。（B）用于制备梯度以及在沉降后收集生殖细胞组分的1 mL移液器吸头。（C）制备梯度所需的设备。（D）从5%（底部）到1%（顶部）BSA溶液的不连续BSA密度梯度的侧视图；其中2%和4%的BSA溶液呈蓝色，以便于观察。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：收集的细胞组分及富集分析的代表性图像。（A）DAPI染色的睾丸细胞。上排显示经PFA固定、石蜡包埋的睾丸组织切片中完整生精上皮内的睾丸细胞（左图）或悬浮状态下的睾丸细胞（右图）。下排显示富集的伸长精子细胞（ES）、圆形精子细胞（RS）和粗线期精母细胞（PSpc）组分。上排比例尺 = 20 µm，下排插图比例尺 = 10 µm。（B）各组分中不同生殖细胞类型的相对定量。使用ImageJ软件手动计数细胞，并将其分类为RS、ES、PSpc、支持细胞（Sertoli cells）及其他细胞。横轴显示各组分编号及梯度中相应的BSA百分比。（C）睾丸细胞的免疫荧光分析。左图：罗丹明标记的花生凝集素（PNA）染色ES（黄色箭头）和RS（白色箭头）中的顶体。中图：DDX4抗体在RS中染色单个核周颗粒，易于与精母细胞中更弥散的胞质信号（蓝色箭头）区分；在ES中未检测到DDX4信号（橙色箭头）。右图：γH2AX抗体识别仅存在于粗线期精母细胞中的特征性核性染色质结构“性染色质体”（由白色星号标记的γH2AX阴性细胞）。比例尺 = 10 µm。（D）对MDR富集的细胞组分分别用PNA（RS组分）、抗DDX4抗体（RS组分）和抗γH2AX抗体（PSpc组分）进行标记，以进一步验证各组分中的细胞富集效果。比例尺 = 10 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：MDR细胞富集后的下游分析。 （A）从一次代表性MDR细胞富集实验的各组分中提取RNA并进行定量。横轴显示组分编号及梯度中相应的BSA百分比。（B）通过在放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液中裂解细胞沉淀，从各组分中提取蛋白质，随后进行定量。（C）制备全细胞蛋白提取物，并使用抗DDX4、PIWIL1、PIWIL2和GAPDH抗体进行Western印迹分析。每个指定组分的裂解物取10%上样。（D）从指定组分中使用抗PIWIL1抗体进行免疫沉淀，随后用抗PIWIL1和抗PIWIL2抗体进行Western印迹。输入样品包含来自不同组分的蛋白裂解物混合物，同时使用兔IgG作为对照进行免疫沉淀（IP），亦从混合裂解物中进行。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：MDR方案的示意图及完成各步骤所需时间。 起始材料为一只成年小鼠的两个睾丸。图中标注了从一个组分中获得的平均细胞数量以及RNA和蛋白质的产量。请点击此处查看该图的放大版本。

缓冲液	试剂	配制方法	储存条件
Krebs缓冲液（10倍浓度）	3.26 g KH2PO4	加H2O定容至2 L，0.22 µm滤膜过滤并高压灭菌。	可在4 °C保存数月
	139.5 g NaCl
	5.89 g MgSO4•7H2O
	50 g 葡萄糖
	3.78 g CaCl2•2H2O
	7.12 g KCl
Krebs缓冲液（1倍浓度）	4.24 g NaHCO3	将NaHCO3溶于100 mL H2O中，加入200 mL 10倍浓度Krebs缓冲液，再加H2O定容至2 L。	需新鲜配制
	200 mL 10倍浓度Krebs缓冲液

表1：Krebs 缓冲液的配制。

BSA 浓度 (w/v)	10% BSA 溶液	1x Krebs 缓冲液
0.50%	0.5 mL	9.5 mL
1%	1 mL	9 mL
2%	2 mL	8 mL
3%	3 mL	7 mL
4%	4 mL	6 mL
5%	5 mL	5 mL

表2：BSA溶液的配制。

消化液	工作浓度	试剂	配制方法
胶原酶	1 mg/mL	胶原酶 IV	在消化前（步骤 2.3），称取 2 mg 胶原酶 IV 至 50 mL 锥形管中，加入 2 mL 预热的 1× Krebs 缓冲液。
胰蛋白酶	0.6 mg/mL	胰蛋白酶	在消化前（步骤 2.6），称取 15 mg 胰蛋白酶至 50 mL 锥形管中，加入 25 mL 预热的 1× KREBS 缓冲液和 40 µL DNase I。
	>3.2 ku/mL	DNase I

表3：消化酶的配制。

讨论

本文介绍了一种使用常规实验室设备分离富集圆形精子细胞、粗线期初级精母细胞和伸长精子细胞群体的简单且低成本的实验方案（方案概览见图4）。尽管该方法无需专业技术或昂贵仪器，但在组织消化、梯度构建以及将细胞悬液加样至梯度时，仍有一些关键步骤需要特别注意。

通过连续两次酶消化从曲细精管中释放生殖细胞。首先使用IV型胶原酶进行第一次消化，以去除间质细胞并分离曲细精管。消化时间过长可能会损伤曲细精管，导致精子细胞丢失，因为若在此步骤中精子细胞从曲细精管中释放出来，将在后续步骤中被弃去。第二次消化使用胰蛋白酶，以将生殖细胞从曲细精管中释放出来。此过程中可能出现少量细胞裂解，通常会因基因组DNA释放而形成一些细胞团块。不建议超过推荐的消化时间或温度，否则可能导致细胞活力下降、细胞裂解增加以及团块形成增多。若仅出现轻微团块，可忽略不计；但在团块显著或细胞大量丢失的情况下，应减少胰蛋白酶的消化时间或浓度。还需注意，胰蛋白酶的酶活性可能因批次不同或长期储存而有所变化。在胰蛋白酶消化过程中也可增加DNase I的用量以去除过多团块，但应将其视为次要解决方案。在预处理结束时获得均匀的单细胞悬液至关重要，因为团块细胞沉降速度更快，会污染各组分并破坏梯度结构。

构建梯度可能需要一些练习。如果使用5 mL移液器吸头配合移液控制器操作感到不便，建议使用带有平滑活塞的普通1 mL机械移液器，并将移液器吸头剪裁至直径约3 mm的开口（图1B）。较大的开口和平稳地加载BSA溶液可降低梯度混合的风险。当梯度制备得当时，由于各BSA溶液折射率不同，可观察到相邻溶液之间的分界线。梯度应在使用前立即制备。还需注意，任何轻微的晃动或振动都可能破坏梯度，因此应将梯度置于不受干扰的环境中。

将细胞悬液加样至梯度介质时必须非常小心。加样后，细胞悬液应停留在梯度介质的上层，并由此开始细胞缓慢穿过第一层介质沉降。若观察到大团细胞快速穿过梯度介质，则可能是细胞重悬操作不够轻柔，或存在过度聚集现象。若加样后细胞未能停留在不连续BSA梯度的顶部，而是立即沉降至1%与2% BSA层之间（步骤3.6），则表明细胞悬液可能过于浓稠。本实验方案以成年小鼠的两个睾丸（80–120 mg/睾丸）作为起始材料进行了优化；尽管如此，使用较少起始材料也已成功完成分离。若需扩大实验规模，从更多数量的睾丸中获得更丰富的生殖细胞，则应增加含有梯度介质的50 mL离心管数量。

该方案最初是为了从成年小鼠睾丸中富集单倍体的圆形精子细胞而开发和优化的，预计圆形精子细胞组分的纯度可超过90%。除高纯度的圆形精子细胞组分外，对粗线期初级精母细胞和伸长阶段精子细胞的富集也获得了满意的结果。需要注意的是，伸长阶段精子细胞组分中可能混有红细胞，如果其存在可能干扰后续分析，则应采取进一步步骤将其去除。我们尚未能够利用MDR方案从成年小鼠中富集其他类型的细胞，例如减数分裂前或早期减数分裂细胞（粗线期之前）。

此外，STA-PUT沉降法已成功用于从出生后特定时间点采集的幼鼠睾丸中富集分离精原细胞或细线前期、细线期和偶线期的初级精母细胞¹³。该方法利用了在第一次生精波过程中这些细胞类型依次出现的特性。相同的方法也可能适用于MDR的富集，但目前尚未在实践中得到验证。另一种可用于特定分化阶段的减数分裂前和减数分裂期细胞纯化的有效方法是流式细胞分选（FACS），其重要优势在于可根据特定标志物的存在情况实现特定细胞类型的分离^14,15,16,17。

总体而言，MDR 速度沉降法是一种用于生殖细胞富集的有效方法。尽管该方法在富集细胞的纯度或数量方面并不优于其他成熟 established 方法，但其明显优势在于操作简便且设备成本低廉。结合所需起始材料量较少的特点，本方案成为精子发生研究领域以及不愿投入专用硬件或大量实验动物的其他领域研究人员的理想选择。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4% 多聚甲醛	研究人员自选
AlexaFluor488 驴抗兔 IgG	赛默飞世尔科技	A-21206
AlexaFluor647 驴抗小鼠 IgG	赛默飞世尔科技	A-31571
牛血清白蛋白（BSA）	西格玛	A9647
CaCl2·2H2O	研究人员自选
胶原酶 IV	西格玛	C5138
完全蛋白酶抑制剂混合物	罗氏	11836145001
DDX4 抗体	Abcam	ab13840
葡萄糖	研究人员自选
DNase I	沃辛顿	LS006355
GAPDH	HyTest	5G4
HRP 标记的抗小鼠 IgG	GE 医疗生命科学	NA931
HRP 标记的抗兔 IgG	GE 医疗生命科学	NA934
KCl	研究人员自选
KH2PO4	研究人员自选
MgSO4·7H2O	研究人员自选
NaCl	研究人员自选
NaHCO3	研究人员自选
NH4Cl	研究人员自选
Pierce BCA 蛋白定量试剂盒	生命技术公司	23227
PIWIL1	细胞信号技术公司	G82
PIWIL2，克隆 13E-3	默克密理博	MABE363
含 DAPI 的 Prolong Diamond 抗荧光淬灭封片剂	赛默飞世尔科技	P36962	用于 Alexa Fluor 免疫荧光染色
兔 IgG	Neomarkers	NC-100-P
罗丹明标记的花生凝集素（PNA）	Vector Laboratories	RL-1072
RIPA 裂解缓冲液			50 mM Tris-HCl，pH 7.5，1% NP-40，0.5% w/v 脱氧胆酸钠，0.05% w/v SDS，1 mM EDTA，150 mM NaCl，1× 蛋白酶抑制剂混合物，0.2 mM PMSF 和 1 mM DTT
TRIsure	Bioline	BIO-38033
吐温 X-100	研究人员自选		非离子型表面活性剂
胰蛋白酶	沃辛顿	LS003703
含 DAPI 的 VECTASHIELD 抗荧光淬灭封片介质	Vector Laboratories	H-1200	用于细胞组分的标准 DAPI 分析
γH2AX 抗体	默克密理博	05-636
0.22 µm 滤膜	赛多利斯	Sartolab BT 180C6	或同等产品
1 mL 机械移液器	研究人员自选
1.5 mL 或 2 mL 离心管	研究人员自选
适用于 50 mL 管的 40 µm 细胞筛	Greiner Bio-One	542040	或同等细胞滤筛
5 mL 血清移液管	Sarstedt	86.1254.001	或同等产品
50 mL 锥形管	研究人员自选
6 cm 培养皿	研究人员自选
细胞培养箱	研究人员自选
适用于 50 mL 管的离心机	研究人员自选
显微镜载玻片记号笔	研究人员自选
HulaMixer 样品混合器	赛默飞世尔科技	15920D	或同等细胞旋转仪
显微解剖镊	研究人员自选
显微解剖剪	研究人员自选
显微镜载玻片和盖玻片	研究人员自选
Nanodrop 1000	赛默飞
Pipetboy Acu 2 移液控制器	Integra	155 000	或同等移液控制器
适用于 1.5 mL 管的冷冻离心机	研究人员自选
1 mL 机械移液器吸头	研究人员自选
水浴锅	研究人员自选
宽场荧光显微镜	研究人员自选