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方法文章

大鼠中枢神经系统中反义寡核苷酸的鞘内递送

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DOI：

10.3791/60274

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2019年10月29日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biogen, Inc., 2Ionis Pharmaceuticals

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种通过将导管植入大鼠脊柱腰段鞘内空间，向其中枢神经系统递送药物的方法。我们重点阐述反义寡核苷酸的递送，但该方法同样适用于其他治疗方式的给药。

摘要

血脑屏障（BBB）是防止潜在有毒或致病物质从血液进入中枢神经系统（CNS）的重要防御机制。然而，它的存在也显著降低了全身给药的治疗药物进入CNS的可及性。克服这一障碍的方法之一是将药物直接注射到脑脊液（CSF）中，从而绕过血脑屏障。这可以通过植入导管实现，既可以使用渗透压泵进行持续输注，也可用于单次推注给药。本文描述了一种外科手术方案，通过直接植入成年大鼠脊柱圆锥末端腔隙的导管，递送靶向中枢神经系统的反义寡核苷酸（ASOs）。作为代表性结果，我们展示了通过该导管系统进行单次ASO鞘内（IT）推注注射，在大鼠CNS不同区域有效降低靶标RNA的表达。该操作安全、有效，且无需昂贵的设备或外科器械。本文所述技术也可适用于其他给药方式的药物递送。

引言

中枢神经系统（CNS）的血管系统在维持稳态中起着关键调控作用，可控制分子的转运、提供营养物质并清除代谢废物。由于内皮细胞壁上紧密连接的密集分布，该系统还能作为抵御外来病原体侵袭的第一道防线。这些紧密连接构成了血脑屏障（BBB）的一个重要组成部分。血脑屏障在允许运输满足营养和能量需求所需分子（如离子、葡萄糖）的同时，还能选择性地限制病原体以及有毒化学物质的通过1,2,3。

具有讽刺意味的是，血脑屏障（BBB）在限制病原体和有毒化学物质通过的同时，也为全身给药后治疗药物进入中枢神经系统（CNS）带来了主要障碍2,4,5。BBB的这一作用促使了大量新型药物递送技术和方法的开发6。

克服这一障碍的一种方法是将药物直接注入持续灌注大脑和脊髓的脑脊液（CSF）中7,8,9,10。本文介绍了一种成功将药物递送至腰椎鞘内腔的方法，即将导管的内端完全置于大鼠脊柱的马尾神经腔内。Mazur 等人此前已在其他文献中发表过该操作的详细描述11。

该方案非常有效，通过定量聚合酶链式反应（qPCR）分析目标基因敲低效果评估，反义寡核苷酸（ASO）递送至中枢神经系统（CNS）的成功率超过90%8。该操作对动物造成的不适极小，所有大鼠均能存活手术，手术切口周围仅有轻微肿胀，术后观察期间未出现痛苦迹象（例如过度活跃、脱水、转圈、失去平衡、进食减少等）。本方法的另一优势在于无需昂贵设备或特殊工具。

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方案

所有体内实验均在百健机构动物使用与护理委员会（IACUC）批准的方案下进行，这些方案遵循美国国立卫生研究院关于实验动物护理和使用的指南。

1. 材料与仪器准备

  1. 准备特制导向套管。
    1. 使用带有切割片的旋转工具（或锋利的锯子）将一根19 G针头的两端切去，制成一段长约1.5−2 cm的导向套管（图1Aiii）。使用旋转工具的磨削轮将两端打磨光滑。
      注意：也可从商业供应商处购买预先制备且无菌的导向套管（材料表）。
  2. 准备导管/导丝组件。
    1. 截取一段8 cm长的PE-10管（聚乙烯管，直径0.011英寸），作为鞘内导管。用耐乙醇标记笔在一端起2 cm处做一标记。从聚四氟乙烯涂层不锈钢丝上截取一段11 cm长的导丝。将导丝（图1Aii）插入PE-10导管的管腔内（图1Ai）。
      注意：每只动物需要一套导管/导丝组件（图1Av）。也可从商业供应商处购买导管和导丝（材料表）。
  3. 准备给药导管组件。
    1. 截取一段PE-50导管（5−10 cm，聚乙烯管，直径0.023英寸）（图1Bi）。在PE-50导管的一端插入一个23 G接头（图1Biv），该端在手术过程中将连接至100 µL注射器（材料表）。将一个去除了针座的改良30 G针头（图1Biii）插入一段长约0.5 cm的PE-10管（图1Bii），并将该PE-10管连接至导管的另一端。
    2. 给药导管组件的30 G针头端（图1Bv）将在手术过程中连接至大鼠体内已植入的PE-10导管的远端。
      注意：也可从商业供应商处购买给药导管组件（图1Bv）（材料表）。
  4. 通过将导向套管（图1Aiii）套在23 G针头末端，制备导向套管-针头组件（图1Avi）。
  5. 使用环氧乙烷灭菌器对所有手术器械（包括导向套管和导丝/导管组件）进行12小时灭菌处理。
    注意：除导管外，所有手术器械均可高压灭菌；导管在高温下会熔化。

2. 手术准备

注意：该实验常规使用体重在 200 g 至 400 g 之间的雄性和雌性 Sprague Dawley 大鼠进行。每笼饲养两只大鼠，维持 12 小时光照/12 小时黑暗的循环环境，并可自由获取食物和水。

  1. 称取大鼠体重，并将其放入异氟烷麻醉舱中诱导麻醉（1−5% 异氟烷与 O2 混合，根据效果调整剂量）。
    注意：在整个手术过程中，通过鼻罩持续给予异氟烷以维持深度麻醉状态。经 IACUC 批准后，也可采用其他麻醉方法（例如，给予氯胺酮 100 mg/kg 和赛拉嗪 10 mg/kg）。
  2. 当大鼠对脚趾夹捏无反应时，剃除其从尾部至尾侧胸椎区域的背部毛发，并将已剃毛的大鼠置于加热垫上的无菌敷单上。
  3. 将一个 50 ml 圆锥形离心管置于大鼠腹部下方，使腰椎区域脊柱弯曲（图 2A），并涂抹眼用软膏保护眼睛。
  4. 皮下注射缓释型丁丙诺啡（1.0 mg/kg；材料表）。使用聚维酮碘和酒精交替擦拭清洁暴露的皮肤区域，重复三次。
    注意：经 IACUC 协议批准后，可使用其他镇痛方案。
  5. 使用已在手术区域开窗的无菌透明手术巾覆盖动物体表。

3. 手术

  1. 将大鼠置于50 mL锥形管上进行支撑，辨认骨盆上方肌肉之间的两个天然凹陷处（图2A中的箭头所示）。用一只手固定这两个凹陷，另一只手从尾侧向头侧方向轻压并触摸脊柱，找到椎骨之间的第一个明显凹陷，即S1与L6椎骨之间的椎间隙（图2B）。
  2. 稍向头侧移动，识别下一个凹陷，即L5与L6椎骨之间的椎间隙，此即为注射位点（图2A中的*所示）。使用手术刀沿中线从头侧向尾侧方向做一长度不超过2 cm的皮肤切口，使注射位点位于切口中央（图2A中的虚线所示）。
  3. 使用解剖剪分离结缔组织，以暴露肌层。随后在L6腰椎棘突背侧旁的肌膜上做约1 cm的切口。
    注：此时应可观察到L6腰椎的骨骼。
  4. 将导管针组件置于第6腰椎前侧附近，沿第6椎骨前侧推入椎间隙，使针尖进入椎管。沿针芯推进导管并移除23 G针头，仅保留导管在原位。
    注：在插入针头前，使用钝头镊子定位L6腰椎棘突有助于操作。通常可观察到脑脊液（CSF）流入针座（液体可能略带血色，但这并不表示造成损伤或针头位置不正确）。作者在本操作过程中未观察到大量出血或严重出血。若出现上述情况，应联系兽医以确定适当的治疗措施，并评估是否需要对动物实施安乐死。
  5. 将导管-导丝组件插入导管中。将导管-导丝组件以约45°角向下倾斜进入椎管，并将末端推进椎管约0.3 cm。
  6. 移除导管，保留带有导丝的导管在原位。将导丝从导管鞘内退出约2.5 cm，然后继续推进导管进入椎管，直至导管上的2 cm刻度线到达椎管入口处（刚好可见于肌肉下方），如图1Bvi所示。
    注：插入的导管应向头侧延伸至蛛网膜下腔。成功置管后，导管应在该腔隙内可自由移动。
  7. 完全撤出导丝，此时可能观察到脑脊液进入植入的导管。
  8. 通过30 G针端将给药导管组件连接至植入导管的远端（图1Bv,vi）。
  9. 将60 µL无菌生理盐水装入100 µL注射器（冲洗注射器）。另取一支注射器装入30 µL测试化合物（例如ASO溶液）作为推注剂量（注射用注射器）。
  10. 将装有生理盐水的冲洗注射器连接至给药导管组件的管路接头端（图1Bv）。向鞘内腔注入20 µL无菌生理盐水（注射前冲洗）。
  11. 将装有测试化合物的注射器连接至给药导管组件的管路接头端（图1Bv）。在30秒内向鞘内腔注入30 µL测试化合物。
    注：常规ASO注射体积为30 µL，以在脊髓和皮层中实现良好的基因沉默效果。已有报道指出注射体积可能影响化合物分布12，但不同注射体积尚未经过系统测试。若使用其他化合物或体积，其安全性和有效性需通过实验确定。
  12. 重复步骤3.10，再用40 µL无菌生理盐水冲洗导管（注射后冲洗）。随后将给药导管组件从植入导管上分离。
    注：注射前后冲洗被认为可减少化合物在局部的滞留，并促进其向头侧结构的分布12。
  13. 无菌条件下剪断并热封植入导管：将一对无菌解剖镊放入玻璃珠灭菌器中加热至高温，然后用镊子热端夹紧导管。
    注：该操作可使导管熔化，管腔塌陷且管壁相互粘连，从而实现无菌密封，之后将其置入皮下空间。
  14. 使用可吸收单丝缝线将剩余的热封导管固定于结缔组织上。随后使用不可吸收单丝缝线缝合皮肤，覆盖已固定的热封导管。
    注：根据IACUC规程批准，也可使用伤口夹。该技术适用于重复给药，但在本研究中仅用于单次注射。重复注射的可行性需在IACUC批准下通过实验评估。
  15. 使用纱布和生理盐水清洗皮肤表面血液，将动物置于加热培养箱中恢复麻醉，直至其恢复活动能力，随后将其放回饲养笼（每笼两只大鼠）。
    注：若同日对多只大鼠进行手术，应在每只动物之间用水清洗器械以去除血液，并使用加热干珠灭菌器重新灭菌（至少20秒，并留出冷却时间）。每处理5只动物后应更换一套新器械。
  16. 术后至少每日监测动物3天，并根据IACUC规程在术后恢复期持续每周监测。
    注：若出现任何并发症（如尿潴留、切口感染、癫痫或瘫痪等神经系统障碍），应联系兽医以确定适当治疗方案，并评估是否需要实施安乐死。若未使用缓释型布托啡诺，应根据IACUC规程在术后每日给予镇痛处理。

4. 鞘内注射后组织特异性敲低效果的评估

  1. 鞘内注射ASOs两周后，采集脑部不同区域（即大脑皮层、纹状体和小脑）以及脊髓的不同节段（即颈段、胸段和腰段）。使用 commercial RNA 提取试剂盒提取组织总RNA，并按照之前描述的方法进行cDNA合成反应13。
    注：qPCR使用标准试剂，检测项目包括大鼠 Malat1 和大鼠 GAPDH。相对转录本水平采用 2-ΔΔCT 法计算（CT = 阈值循环）。

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结果

根据本文所述方法，我们对两组成年雌性大鼠（250−300 g；每组 n = 10）分别注射了单次推注的磷酸盐缓冲液（PBS）或300 µg靶向长链非编码（linc）RNA Malat1的反义寡核苷酸（ASO）；在本实验室中，我们常规使用Malat1 ASO作为工具化合物，因为Malat1在所有组织（包括脑和脊髓）中均广泛且高水平表达14。Malat1 ASO通过RNaseH1介导的机制发挥作用15，可降解RNA，从而实现基因敲低（KD）。在本实验中，我们在ASO给药两周后采集了脑部不同区域（即大脑皮层、纹状体和小脑）以及脊髓腰段组织。随后提取各采集区域的RNA，并通过qPCR分析Malat1 RNA的表达水平。

当测试的试剂为反义寡核苷酸（ASO）时，我们建议：1）始终采集中枢神经系统（CNS）的多个区域，以比较ASO的作用效果；2）鉴于手术方法的技术复杂性...

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讨论

本文介绍了一种将治疗剂直接递送至大鼠中枢神经系统（CNS）的强有力方法。理论上，类似的技术也可用于小鼠，但由于小鼠体型较小，该方法实施起来更具挑战性。因此，我们课题组采用脑室内（ICV）注射的方式向小鼠中枢神经系统递送药物，通过不同的给药途径实现相同的目标。该方法已在另一项研究中有所描述16。

本方法的优点在于无需昂贵的设备或任何特殊工具。我们建议提前制备如图1A所示的导管/导丝组件。应至少为研究中每只大鼠准备一套导管/导丝组件，但我们建议额外多准备一些，以防部分组件在手术过程中损坏或需要更换。

一旦掌握该技术，每只大鼠的整个操作过程约需25分钟，因此可在一天内处理多只大鼠。若由一人对第一只大鼠进行手术操作，同时另一人对下一只大鼠进行手术准备，则可同时处理两只大鼠，从而缩短单只动物的操作时间。对于熟练的操作者而言，仍存在较小概率使针头进入硬膜外腔而非蛛网膜下腔。观察到脑脊液回流是针头位置...

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披露

所有作者均为渤健公司（Biogen, Inc.）或伊奥尼斯制药公司（Ionis Pharmaceuticals）的员工。作者从伊奥尼斯制药公司获得本文所述的反义寡核苷酸。

致谢

我们感谢 Ionis Pharmaceuticals 提供本文所述的反义寡核苷酸（ASOs）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3M Steri-Drape 带粘性开口的小型手术巾3M1020
70% 乙醇Decon Laboratories, Inc8416-160Z
酒精棉签棒DynarexNO 1204
BD 通用注射器 1 mL 鲁尔锁头BD1ml TB 鲁尔锁头BD 302830
BD Intramedic 聚乙烯导管BD聚乙烯导管 PE50 直径 0.023 英寸BD 427400 (10英尺, Fischer Scientific 22-204008) 或 427401 (100英尺, Fischer Scientific 14-170-12P)
BD Intramedic 聚乙烯导管BD聚乙烯导管 PE10 直径 0.011 英寸BD 427410 (10英尺, Fischer Scientific 14-170-11B) 或 4274011 (100英尺, Fischer Scientific 14-170-12B)
BD Intramedic 聚乙烯导管接头BD23 号规格 Intramedic 鲁尔短接头BD 427565 或 Fisher Scientific 14-826-19E
BD PrecisionGlide 一次性针头 30GBDBD 305128
缓释型布托啡诺-实验室用ZooPharm需处方
环氧乙烷灭菌器Andersen Sterilizer INC.AN 74i，气体灭菌器AN 74i
引导套管BD19G x 1 WT (1.1 mm x 25mm) 针头BD 305186
Hamilton 100μl 注射器Hamilton companyHamilton 100μl 注射器
热珠灭菌器Fine Science ToolsSTERILIZER MODELNO FST 250
眼科软膏Dechra veterranery product17033-211-38
口袋式宠物修剪器Braintree ScientificCLP-9931 B
聚维酮碘清洗液PDIS48050
生理盐水Baxter氯化钠 0.9% 静脉输注液 BP 50mlFE1306G
手术刀Feather一次性手术刀No. 10
小型动物加热垫K&H ManufacturingModel # 1060
套管针芯丝McMaster-Carr1749T14LH-36233780
手术巾Dynarex4410
手术剪和手术镊FST 和 Fisher Scientific
缝合线Ethicon4-0 或 5-0
制作引导套管的工具Grainger旋转工具（Dremel）14H446 (Mfr: EZ456)
EZ 锁切断轮1PKX5 (Mfr: 3000-1/24)
研磨轮，氧化铝材质38EY44 (Mfr: EZ541GR)
EZ 锁心轴1PKX8 (Mfr: EZ402-01)
金刚石轮地板砖切割片3DRN4 (Mfr: EZ545)
本实验所用预制成型且已灭菌材料的替代来源
给药导管系统SAI Infusion SystemsRIDC-01
引导套管SAI Infusion SystemsRIDC-GCA
内导管SAI Infusion SystemsRIDC-INC
套管针芯丝SAI Infusion SystemsRIDC-STY

参考文献

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