大鼠中枢神经系统中反义寡核苷酸的鞘内递送

摘要

本文介绍了一种通过将导管植入大鼠脊柱腰段鞘内空间，向其中枢神经系统递送药物的方法。我们重点阐述反义寡核苷酸的递送，但该方法同样适用于其他治疗方式的给药。

摘要

血脑屏障（BBB）是防止潜在有毒或致病物质从血液进入中枢神经系统（CNS）的重要防御机制。然而，它的存在也显著降低了全身给药的治疗药物进入CNS的可及性。克服这一障碍的方法之一是将药物直接注射到脑脊液（CSF）中，从而绕过血脑屏障。这可以通过植入导管实现，既可以使用渗透压泵进行持续输注，也可用于单次推注给药。本文描述了一种外科手术方案，通过直接植入成年大鼠脊柱圆锥末端腔隙的导管，递送靶向中枢神经系统的反义寡核苷酸（ASOs）。作为代表性结果，我们展示了通过该导管系统进行单次ASO鞘内（IT）推注注射，在大鼠CNS不同区域有效降低靶标RNA的表达。该操作安全、有效，且无需昂贵的设备或外科器械。本文所述技术也可适用于其他给药方式的药物递送。

引言

中枢神经系统（CNS）的血管系统在维持稳态中起着关键调控作用，可控制分子的转运、提供营养物质并清除代谢废物。由于内皮细胞壁上紧密连接的密集分布，该系统还能作为抵御外来病原体侵袭的第一道防线。这些紧密连接构成了血脑屏障（BBB）的一个重要组成部分。血脑屏障在允许运输满足营养和能量需求所需分子（如离子、葡萄糖）的同时，还能选择性地限制病原体以及有毒化学物质的通过^1,2,3。

具有讽刺意味的是，血脑屏障（BBB）在限制病原体和有毒化学物质通过的同时，也为全身给药后治疗药物进入中枢神经系统（CNS）带来了主要障碍^2,4,5。BBB的这一作用促使了大量新型药物递送技术和方法的开发⁶。

克服这一障碍的一种方法是将药物直接注入持续灌注大脑和脊髓的脑脊液（CSF）中^7,8,

方案

所有体内实验均在百健机构动物使用与护理委员会（IACUC）批准的方案下进行，这些方案遵循美国国立卫生研究院关于实验动物护理和使用的指南。

1. 材料与仪器准备

1. 准备特制导向套管。
   1. 使用带有切割片的旋转工具（或锋利的锯子）将一根19 G针头的两端切去，制成一段长约1.5−2 cm的导向套管（图1Aiii）。使用旋转工具的磨削轮将两端打磨光滑。
      注意：也可从商业供应商处购买预先制备且无菌的导向套管（材料表）。
2. 准备导管/导丝组件。
   1. 截取一段8 cm长的PE-10管（聚乙烯管，直径0.011英寸），作为鞘内导管。用耐乙醇标记笔在一端起2 cm处做一标记。从聚四氟乙烯涂层不锈钢丝上截取一段11 cm长的导丝。将导丝（图1Aii）插入PE-10导管的管腔内（图1Ai）。
      注意：每只动物需要一套导管/导丝组件（图1Av）。也可从商业供应....

结果

根据本文所述方法，我们对两组成年雌性大鼠（250−300 g；每组 n = 10）分别注射了单次推注的磷酸盐缓冲液（PBS）或300 µg靶向长链非编码（linc）RNA Malat1的反义寡核苷酸（ASO）；在本实验室中，我们常规使用Malat1 ASO作为工具化合物，因为Malat1在所有组织（包括脑和脊髓）中均广泛且高水平表达¹⁴。Malat1 ASO通过RNaseH1介导的机制发挥作用¹⁵，可降解RNA，从而实现基因敲低（KD）。在本实验中，我们在ASO给药两周后采集了脑部不同区域（即大脑皮层、纹状体和小脑）以及脊髓腰段组织。随后提取各采集区域的RNA，并通过qPCR分析Malat1 RNA的表达水平。

当测试的试剂为反义寡核苷酸（ASO）时，我们建议：1）始终采集中枢神经系统（CNS）的多个区域，以比较ASO的作用效果；2）鉴于手术方法的技术复杂性.......

讨论

本文介绍了一种将治疗剂直接递送至大鼠中枢神经系统（CNS）的强有力方法。理论上，类似的技术也可用于小鼠，但由于小鼠体型较小，该方法实施起来更具挑战性。因此，我们课题组采用脑室内（ICV）注射的方式向小鼠中枢神经系统递送药物，通过不同的给药途径实现相同的目标。该方法已在另一项研究中有所描述¹⁶。

本方法的优点在于无需昂贵的设备或任何特殊工具。我们建议提前制备如图1A所示的导管/导丝组件。应至少为研究中每只大鼠准备一套导管/导丝组件，但我们建议额外多准备一些，以防部分组件在手术过程中损坏或需要更换。

一旦掌握该技术，每只大鼠的整个操作过程约需25分钟，因此可在一天内处理多只大鼠。若由一人对第一只大鼠进行手术操作，同时另一人对下一只大鼠进行手术准备，则可同时处理两只大鼠，从而缩短单只动物的操作时间。对于熟练的操作者而言，仍存在较小概率使针头进入硬膜外腔而非蛛网膜下腔。观察到脑脊液回流是针头位置.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3M Steri-Drape 带粘性开口的小型手术巾	3M		1020
70% 乙醇	Decon Laboratories, Inc		8416-160Z
酒精棉签棒	Dynarex		NO 1204
BD 通用注射器 1 mL 鲁尔锁头	BD	1ml TB 鲁尔锁头	BD 302830
BD Intramedic 聚乙烯导管	BD	聚乙烯导管 PE50 直径 0.023 英寸	BD 427400 (10英尺, Fischer Scientific 22-204008) 或 427401 (100英尺, Fischer Scientific 14-170-12P)
BD Intramedic 聚乙烯导管	BD	聚乙烯导管 PE10 直径 0.011 英寸	BD 427410 (10英尺, Fischer Scientific 14-170-11B) 或 4274011 (100英尺, Fischer Scientific 14-170-12B)
BD Intramedic 聚乙烯导管接头	BD	23 号规格 Intramedic 鲁尔短接头	BD 427565 或 Fisher Scientific 14-826-19E
BD PrecisionGlide 一次性针头 30G	BD		BD 305128
缓释型布托啡诺-实验室用	ZooPharm	需处方
环氧乙烷灭菌器	Andersen Sterilizer INC.	AN 74i，气体灭菌器	AN 74i
引导套管	BD	19G x 1 WT (1.1 mm x 25mm) 针头	BD 305186
Hamilton 100μl 注射器	Hamilton company	Hamilton 100μl 注射器
热珠灭菌器	Fine Science Tools		STERILIZER MODELNO FST 250
眼科软膏	Dechra veterranery product		17033-211-38
口袋式宠物修剪器	Braintree Scientific		CLP-9931 B
聚维酮碘清洗液	PDI		S48050
生理盐水	Baxter	氯化钠 0.9% 静脉输注液 BP 50ml	FE1306G
手术刀	Feather	一次性手术刀	No. 10
小型动物加热垫	K&H Manufacturing		Model # 1060
套管针芯丝	McMaster-Carr	1749T14	LH-36233780
手术巾	Dynarex		4410
手术剪和手术镊	FST 和 Fisher Scientific
缝合线	Ethicon		4-0 或 5-0
制作引导套管的工具	Grainger	旋转工具（Dremel）	14H446 (Mfr: EZ456)
		EZ 锁切断轮	1PKX5 (Mfr: 3000-1/24)
		研磨轮，氧化铝材质	38EY44 (Mfr: EZ541GR)
		EZ 锁心轴	1PKX8 (Mfr: EZ402-01)
		金刚石轮地板砖切割片	3DRN4 (Mfr: EZ545)
本实验所用预制成型且已灭菌材料的替代来源
给药导管系统	SAI Infusion Systems		RIDC-01
引导套管	SAI Infusion Systems		RIDC-GCA
内导管	SAI Infusion Systems		RIDC-INC
套管针芯丝	SAI Infusion Systems		RIDC-STY