高通量共培养实验用于研究微生物相互作用

摘要

本方案中介绍的共培养相互作用检测方法成本低廉、通量高且操作简便。这些检测可用于观察微生物在共培养条件下的相互作用，识别相互作用模式，并表征目标微生物菌株对人类及环境病原体的抑制潜力。

摘要

微生物之间相互作用的研究已带来诸多发现，从新型抗菌物质到微生物生态学的深入认识。目前用于研究微生物相互作用的许多方法需要专用设备，且成本高、耗时长。本文介绍一种共培养相互作用检测方案，该方法成本低廉，可扩展至大量样本，并易于适配多种实验设计。将微生物共同培养，每个孔代表一种成对组合的微生物。在每个孔的一侧培养待测微生物，并先进行单培养孵育；随后，使用3D打印的接种印章将目标微生物同时接种至各孔的另一侧。共培养结束后，对完成的检测进行视觉表型评分，例如生长或抑制现象。这些检测可用于验证表型，或在感兴趣的分离株中识别模式。通过这种简单而有效的方法，使用者可快速高效地分析多种微生物组合。该共培养方法适用于抗生素发现以及基于培养的微生物组研究，并已在上述两个领域成功应用。

引言

在自然界中，微生物很少孤立存在，因此它们会持续地与其他生物相互作用。因此，研究微生物之间的相互作用对于理解多种微生物行为至关重要¹。微生物之间的相互作用可以是互利共生、共栖或拮抗性的。这些相互作用不仅影响微生物本身，还会影响它们所定植的环境和宿主^1,2。

许多科学家通过研究微生物间的相互作用来发现新的抗菌分子。首个具有临床重要意义的抗菌分子正是通过研究微生物相互作用而发现的。亚历山大·弗莱明爵士观察到一种污染性的Penicillium spp. 分离株能够抑制一株Staphylococcus的生长，从而发现了目前广泛使用的抗生素——青霉素³。对微生物用于拮抗竞争者的机制进行表征，仍然是发现抗菌分子的重要途径。例如，最近的研究表明，Streptomyces sp. 菌株Mg1可产生线性霉素类抗生素（linearmycins），该物质对Bacillus subtilis具有裂解和降解活性⁴。

此外，一种名为lugdunin的非核糖体合成肽在观察到鼻腔共生菌产生抗菌作用后 recently 被发现 ....

方案

已获得供体父母的知情同意，威斯康星大学麦迪逊分校人类受试者委员会批准了本研究（机构审查委员会 [IRB] 批准号 H-2013-1044）。

1. 样品培养

注意： 本实验流程在此用于研究来自人体鼻腔的细菌分离株之间的相互作用。原则上，以下方法适用于任何培养条件。使用脑心浸液肉汤（BHI）进行鼻腔细菌的常规扩增培养。所有培养基均添加1.5%琼脂固化。本研究中，样本来源于生理盐水冲洗供体鼻腔所得的鼻灌洗液，收集至微量离心管中，并于-80 °C冷冻保存。

1. 采用标准培养技术，将每份解冻后的灌洗样本各取 100 µL 接种至 BHI 培养基平板上。
2. 将平板在 37 °C 条件下有氧孵育 1 周。
3. 孵育结束后，从每块平板上选择每种不同形态类型的菌落 ≥2 个，通过划线法将菌落从原始平板转移至新的 BHI 平板上，进行有氧传代培养，并在 37 °C 下孵育。重复此过程，直至获得纯培养的细菌。
   注意：可通过菌落形态、革兰染色、16S rRNA 基因测序或其他方法对分离的细菌进行鉴定。然而，继续本实验方案时无需知晓菌株的具体种类。
4. 将 1 mL 50% 甘油与 1 mL 细菌过夜培养物（见第 3 节）混合于冻存管中，用于所有细菌分离株的 -80 °C 冻存保存。
....

结果

共培养相互作用实验可用于研究微生物间的相互作用，识别感兴趣的模式，并发现具有引人注目活性的微生物分离株。在该实验中，将测试生物体接种于12孔琼脂平板的一侧并进行单培养，培养7天。随后，将目标生物体点种在测试生物体附近，两种微生物共同培养7天，然后观察目标生物体的生长表型。实验结果基于对目标生物体生长或抑制情况的视觉分析进行评分。

这些共培养实验最近被用于评估放线菌（测试生物）对目标微生物的抑制活性 金黄色葡萄球菌 种（spp）. （靶向生物体）分离自人体鼻腔（图2)¹⁶共培养实验用于鉴定放线菌（n = 21）之间的特异性抑制模式 金黄色葡萄球菌 分离株（n = 39），结果显示放线菌门分离株抑制凝固酶阴性葡萄球菌（CoNS）的能力存在差异。共测试了812种两两组合。特别是， Coryn.......

讨论

介导微生物相互作用的抗生素及其他次级代谢产物在多种应用中具有重要价值，包括药物发现。本文介绍了一种用于评估大量微生物相互作用的共培养实验方案。这些共培养相互作用实验是一种简单、经济、可扩展且高通量的方法，可用于同时研究多种微生物成对组合的相互作用。利用接种印迹工具，将目标微生物与测试微生物并排点种于12孔板的孔中，并通过肉眼观察目标微生物表型的变化来判断其是否受到抑制。实验所用的大部分材料均可通过常规实验室供应商或公共资源轻松获得，因此该实验方法可方便地适配于多种实验室环境。在实验室实践中，此类共培养实验已成功应用于研究来自多种环境、与不同宿主相关的微生物之间的相互作用。

尽管该技术具有诸多优势，但也存在一些局限性。第一个显著的局限性是，若无其他元数据支持，共培养实验的结果模式难以解读。在最近两篇采用此类共培养实验的研究中^16,18，只有结合其他元数据（如测试生物的分类学信息）才能识别出值得关注的抑制模式。然而，即使缺乏配套的元数据，本文所述方法仍适用于鉴定对特定病.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 μL 一次性聚苯乙烯接种环，蓝色	VWR	12000-806
10 μL 一次性聚苯乙烯接种环，黄色	VWR	12000-810
12 孔细胞培养板，带盖，无菌	Greiner bio-one	665 180
14 mL 聚苯乙烯圆底管，17 x 100 mm 2型，无热原，无菌	Falcon	352057
2.0 mL 自立式螺口管及管盖，无菌	USA scientific	1420-9710
25 mL 血清移液管	Cell Treat	229225B
细菌学琼脂	VWR	J637
脑心浸出液肉汤	Dot Scientific	DSB11000-5000
聚碳酸酯细丝，白色，直径 3 mm	Keene Village Plastics	12.1-3MM-WH-581.2-1KG-R
学校用胶水	Elmer's	EPIE304
Taz 6 3D 打印机	Lulzbot