高通量共培养实验用于研究微生物相互作用

摘要

本方案中介绍的共培养相互作用检测方法成本低廉、通量高且操作简便。这些检测可用于观察微生物在共培养条件下的相互作用，识别相互作用模式，并表征目标微生物菌株对人类及环境病原体的抑制潜力。

摘要

微生物之间相互作用的研究已带来诸多发现，从新型抗菌物质到微生物生态学的深入认识。目前用于研究微生物相互作用的许多方法需要专用设备，且成本高、耗时长。本文介绍一种共培养相互作用检测方案，该方法成本低廉，可扩展至大量样本，并易于适配多种实验设计。将微生物共同培养，每个孔代表一种成对组合的微生物。在每个孔的一侧培养待测微生物，并先进行单培养孵育；随后，使用3D打印的接种印章将目标微生物同时接种至各孔的另一侧。共培养结束后，对完成的检测进行视觉表型评分，例如生长或抑制现象。这些检测可用于验证表型，或在感兴趣的分离株中识别模式。通过这种简单而有效的方法，使用者可快速高效地分析多种微生物组合。该共培养方法适用于抗生素发现以及基于培养的微生物组研究，并已在上述两个领域成功应用。

引言

在自然界中，微生物很少孤立存在，因此它们会持续地与其他生物相互作用。因此，研究微生物之间的相互作用对于理解多种微生物行为至关重要¹。微生物之间的相互作用可以是互利共生、共栖或拮抗性的。这些相互作用不仅影响微生物本身，还会影响它们所定植的环境和宿主^1,2。

许多科学家通过研究微生物间的相互作用来发现新的抗菌分子。首个具有临床重要意义的抗菌分子正是通过研究微生物相互作用而发现的。亚历山大·弗莱明爵士观察到一种污染性的Penicillium spp. 分离株能够抑制一株Staphylococcus的生长，从而发现了目前广泛使用的抗生素——青霉素³。对微生物用于拮抗竞争者的机制进行表征，仍然是发现抗菌分子的重要途径。例如，最近的研究表明，Streptomyces sp. 菌株Mg1可产生线性霉素类抗生素（linearmycins），该物质对Bacillus subtilis具有裂解和降解活性⁴。

此外，一种名为lugdunin的非核糖体合成肽在观察到鼻腔共生菌产生抗菌作用后 recently 被发现 Staphylococcus lugdunensis 抑制 金黄色葡萄球菌⁵. 研究还表明，微生物之间的互利互作在发现抗菌分子方面与拮抗互作具有同等强大的作用。例如，许多属于刺叶蚁族（Attini）的真菌种植蚂蚁携带一种称为 Pseudonocardia 其外骨骼上具有产生抗真菌分子的结构，可抑制其栽培真菌作物专性病原菌的生长⁶由于对微生物相互作用的研究有助于发现抗菌分子，因此采用高通量筛选可能促成新型抗菌分子的发现。

在研究微生物相互作用的方法中，根据成本和操作难易程度的不同，其技术手段从简单到复杂不等。例如，琼脂块法是一种经济且简便的方法，可用于研究多种微生物之间的拮抗作用⁷。然而，琼脂块法并非高效的实验流程，当需要检测大量成对组合时，工作量较大。为了高通量地评估微生物代谢产物对目标菌株的影响，许多实验室采用纸片扩散法⁸。该方法操作简便、成本低廉，并可扩展至处理更多样本数量⁷。但该方法需要制备微生物提取物，且在某些目标菌与抗生素组合下可能产生误导性结果，例如沙门氏菌（Salmonella）与头孢菌素类抗生素的组合⁹。

前述方法依赖于分离的组分来诱导目标生物体的反应，而非允许微生物之间相互作用。这一点值得注意，因为微生物之间的相互作用可能诱导产物的生成 "隐秘的" 在单一培养中不产生的抗菌分子。例如，最近有研究显示，抗菌性 keyicin 仅由一种 小单孢菌属 sp. 与之共培养时 红球菌属 从同一海绵微生物组中分离出的物种¹⁰更复杂的相互作用研究方法可规避这种单一培养可能带来的局限性。例如，iChip 可用于从环境样本中分离稀有且难以培养的细菌，并可通过原位培养观察微生物间的相互作用。¹¹为了详细研究相互作用，可以使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间成像质谱法（MALDI-TOF-IMS）。该方法能够以高空间分辨率提供相互作用的微生物菌落所产生的小分子和肽类的组成及其分布的详细信息。MALDI-TOF-IMS 也已用于多项细菌相互作用研究，以阐明竞争机制^12,13,14,15然而，基质辅助激光解吸电离飞行时间成像质谱（MALDI-TOF-IMS）通常需要繁琐的样品制备过程、操作仪器所需的专业技术知识，以及昂贵且专用的质谱仪。由于这些原因，该技术难以应用于高通量研究。因此，开发一种简单、可扩展且适用于高通量的共培养检测方法，用于研究微生物相互作用，并克服上述方法的诸多局限性，将具有重要意义。

本文介绍了一种高通量微生物共培养的实验方案。该方法简单，易于整合到现有的微生物相互作用研究中。与目前常用的多种微生物相互作用研究方法相比，本方法操作简便、成本低廉，且适用于大规模相互作用的分析。这些实验不仅易于操作，而且所需材料可从大多数实验室供应商或公共资源（如图书馆和创客空间）广泛获得。因此，该实验方法作为初步研究手段具有显著优势，可用于在大量微生物成对组合中识别和解析有趣的相互作用模式，对于微生物生态学研究尤其具有应用价值。

方案

已获得供体父母的知情同意，威斯康星大学麦迪逊分校人类受试者委员会批准了本研究（机构审查委员会 [IRB] 批准号 H-2013-1044）。

1. 样品培养

注意： 本实验流程在此用于研究来自人体鼻腔的细菌分离株之间的相互作用。原则上，以下方法适用于任何培养条件。使用脑心浸液肉汤（BHI）进行鼻腔细菌的常规扩增培养。所有培养基均添加1.5%琼脂固化。本研究中，样本来源于生理盐水冲洗供体鼻腔所得的鼻灌洗液，收集至微量离心管中，并于-80 °C冷冻保存。

1. 采用标准培养技术，将每份解冻后的灌洗样本各取 100 µL 接种至 BHI 培养基平板上。
2. 将平板在 37 °C 条件下有氧孵育 1 周。
3. 孵育结束后，从每块平板上选择每种不同形态类型的菌落 ≥2 个，通过划线法将菌落从原始平板转移至新的 BHI 平板上，进行有氧传代培养，并在 37 °C 下孵育。重复此过程，直至获得纯培养的细菌。
   注意：可通过菌落形态、革兰染色、16S rRNA 基因测序或其他方法对分离的细菌进行鉴定。然而，继续本实验方案时无需知晓菌株的具体种类。
4. 将 1 mL 50% 甘油与 1 mL 细菌过夜培养物（见第 3 节）混合于冻存管中，用于所有细菌分离株的 -80 °C 冻存保存。

2. 3D 打印印章

注意：选择聚碳酸酯作为冲压材料，是因为其玻璃化转变温度较高（147 °C），超过标准高压灭菌温度（121 °C），从而在多次使用后可最大限度地减少变形风险。

1. 使用聚碳酸酯丝材装载3D打印机。
2. 在打印平台上涂抹白色学生用胶水（聚醋酸乙烯酯），以增强粘附性，并在打印过程中尽量减少接种印章的翘曲。
3. 将接种印章的.STL模型文件（补充数据文件）（图1）载入3D打印机软件中。
4. 以290 °C的喷嘴温度、60 °C的平台温度和0.38 mm的层高打印接种印章。
5. 用铝箔包裹印章，并在重力循环条件下高压灭菌1.5小时，干燥15分钟。
   注意： 尽管聚碳酸酯具有吸湿性，但印章在高压灭菌后仅保留约0.5%的水分重量。

3. 过夜培养物的制备

1. 使用血清移液管将 3 mL 无菌 BHI 肉汤移入 14 mL 培养管中。
2. 使用无菌的1 µL接种环，将一个细菌菌落接种到肉汤培养基中。轻轻旋转接种环，确保菌团在肉汤中充分分散。培养前对培养管进行短暂涡旋振荡。
3. 将培养管置于摇床中，在37 °C、250 rpm条件下振荡培养过夜（约16 h）。
4. 涡旋振荡以分散细胞团块，当细菌培养物达到足够浓度时 浊度（OD₆₀₀ ≥ 1).

4. 生物测定板的制备

注意： 为保持无菌状态，应在层流罩中准备生物测定板。

1. 按照生产商说明，配制含1.5%琼脂的BHI培养基，并通过高压灭菌法进行灭菌。
2. 高压灭菌后，将BHI培养基置于控温水浴中冷却至55 °C。
3. 使用刻度移液管，将3 mL熔融BHI培养基加入12孔板的每个孔中。确保各孔中的培养基体积尽可能精确且均匀。每升培养基可制备约27块生物测定板。
4. 让琼脂在室温下静置过夜使其凝固。

5. 用测试生物接种生物测定平板

注意：测试生物是指通过共培养相互作用实验来确定其是否产生抑制活性（例如抗生素产生）的生物。在本实验中，测试生物是从鼻腔灌洗样本中分离的放线菌。

1. 用无菌的10 µL接种环蘸取过夜培养物，在培养板的孔中左侧三分之一区域划线接种测试菌株。
   注意：建议仅在孔的三分之一区域划线，因为菌体过度生长会妨碍后续目标菌株的接种。
2. 重复上述操作，直至培养板上全部12个孔均接种了测试菌株。
3. 将培养板倒置，在适当温度下孵育7天。在较高温度（≥37 °C）或较干燥的环境中，需将培养板置于湿润容器中，以防培养板干涸。

6. 目标生物的制备

注意：目标生物是指通过共培养相互作用实验来确定其抑制状态的生物。在本实验中，目标生物是从鼻腔灌洗样本中分离出的葡萄球菌属（Staphylococcus spp.）。

1. 将生物测定板孵育 6 天后，制备指定靶标生物的过夜培养物，方法同上（见第 3 节）。

7. 靶标生物接种

注意：过夜培养后，应确保培养物呈浑浊状（OD₆₀₀ ≥ 1）。某些细菌培养物可能在培养管底部发生絮凝。需涡旋振荡培养管以分散团块，并评估培养物的浑浊度。

1. 取一个空的12孔板，在每个孔中加入1.8 mL BHI培养基和200 µL过夜培养的靶标菌液，制备靶标板。
2. 打开无菌接种印章包装，将其放入靶标板中。轻轻搅动各孔中的菌液，注意避免菌液交叉污染相邻孔。
3. 提起接种印章，检查每个印章尖端是否带有稀释后的靶标菌液液滴。
4. 将接种印章放置于未接种的生物测定板上，轻轻摇动印章，使每个孔均被菌液滴接种，从而制备单菌对照板。移除接种印章后，生物测定板各孔中应可见菌液液滴。
   1. 若因培养基液面不平导致某些孔未被接种，可用移液器在对应孔的右侧点加3 µL稀释后的过夜培养菌液。
5. 按照上述方法（见步骤7.4.1）接种生物测定板，但需调整印章位置，使其尖端对准12孔板各孔的右侧。接种时确保印章不接触已存在的细菌菌落。
6. 小心取出印章，并放回靶标板中。
7. 重复上述接种操作，直至所有生物测定板均完成接种。
8. 将生物测定板倒置，在适宜温度下孵育7天。

8. 评分

1. 将测试生物与目标生物共培养1周后，根据以下视觉评估结果对相互作用进行评分：
   1. 若目标生物的生长情况与单培养对照组无明显差异，则将该孔的评分记为 "0"（无抑制）（图2A,B）。
   2. 若目标生物的生长较对照组减弱，则将该孔的评分记为 "1"（弱抑制）（图2C）。
   3. 若目标生物在该孔中未生长，则评分记为 "2"（强抑制）（图2D）。

结果

共培养相互作用实验可用于研究微生物间的相互作用，识别感兴趣的模式，并发现具有引人注目活性的微生物分离株。在该实验中，将测试生物体接种于12孔琼脂平板的一侧并进行单培养，培养7天。随后，将目标生物体点种在测试生物体附近，两种微生物共同培养7天，然后观察目标生物体的生长表型。实验结果基于对目标生物体生长或抑制情况的视觉分析进行评分。

这些共培养实验最近被用于评估放线菌（测试生物）对目标微生物的抑制活性 金黄色葡萄球菌 种（spp）. （靶向生物体）分离自人体鼻腔（图2)¹⁶共培养实验用于鉴定放线菌（n = 21）之间的特异性抑制模式 金黄色葡萄球菌 分离株（n = 39），结果显示放线菌门分离株抑制凝固酶阴性葡萄球菌（CoNS）的能力存在差异。共测试了812种两两组合。特别是， Coryn...

讨论

介导微生物相互作用的抗生素及其他次级代谢产物在多种应用中具有重要价值，包括药物发现。本文介绍了一种用于评估大量微生物相互作用的共培养实验方案。这些共培养相互作用实验是一种简单、经济、可扩展且高通量的方法，可用于同时研究多种微生物成对组合的相互作用。利用接种印迹工具，将目标微生物与测试微生物并排点种于12孔板的孔中，并通过肉眼观察目标微生物表型的变化来判断其是否受到抑制。实验所用的大部分材料均可通过常规实验室供应商或公共资源轻松获得，因此该实验方法可方便地适配于多种实验室环境。在实验室实践中，此类共培养实验已成功应用于研究来自多种环境、与不同宿主相关的微生物之间的相互作用。

尽管该技术具有诸多优势，但也存在一些局限性。第一个显著的局限性是，若无其他元数据支持，共培养实验的结果模式难以解读。在最近两篇采用此类共培养实验的研究中^16,18，只有结合其他元数据（如测试生物的分类学信息）才能识别出值得关注的抑制模式。然而，即使缺乏配套的元数据，本文所述方法仍适用于鉴定对特定病...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 μL 一次性聚苯乙烯接种环，蓝色	VWR	12000-806
10 μL 一次性聚苯乙烯接种环，黄色	VWR	12000-810
12 孔细胞培养板，带盖，无菌	Greiner bio-one	665 180
14 mL 聚苯乙烯圆底管，17 x 100 mm 2型，无热原，无菌	Falcon	352057
2.0 mL 自立式螺口管及管盖，无菌	USA scientific	1420-9710
25 mL 血清移液管	Cell Treat	229225B
细菌学琼脂	VWR	J637
脑心浸出液肉汤	Dot Scientific	DSB11000-5000
聚碳酸酯细丝，白色，直径 3 mm	Keene Village Plastics	12.1-3MM-WH-581.2-1KG-R
学校用胶水	Elmer's	EPIE304
Taz 6 3D 打印机	Lulzbot