本文介绍了一种用于研究重建显微外科中缺血-再灌注损伤病理生理学的临床前动物模型。该模型基于大鼠浅表尾侧腹壁血管的游离皮瓣，还可用于评估不同疗法和化合物对缺血-再灌注损伤相关损害的拮抗作用。
本文内容
摘要
摘要
缺血-再灌注损伤是重建显微外科手术中皮瓣失败的主要原因。由于成本效益高且与人类具有较好的可转化性，大鼠在生物医学研究的许多领域中是首选的临床前动物模型。本方案描述了一种在大鼠中建立伴有缺血-再灌注损伤的临床前游离皮瓣模型的方法。所述的大鼠游离皮瓣模型尺寸为3 cm × 6 cm，通过结扎数条血管并切断血管蒂后即可轻松获得。在经历缺血损伤8小时并完成显微外科吻合后，游离皮瓣即出现组织损伤。该模型可用于研究与缺血-再灌注损伤相关的各类损伤，因而适用于评估针对此病理生理过程的治疗药物。此外，本方案还介绍了两种用于评估该动物模型的主要监测技术：超声渡越时间技术与激光散斑对比分析。
引言
显微外科已成为一种常见的重建外科技术，可用于实施各种手术干预（例如游离组织移植），以修复复杂的组织缺损、再植断肢，甚至进行复合组织异体移植。
显微外科重建手术适用于由创伤、烧伤或肿瘤切除所导致的多种组织缺损。然而，游离皮瓣失败的发生率虽低，其中缺血-再灌注（I/R）损伤是主要原因之一。所有经显微外科移植的组织均需经历一段强制性的缺血期，随后进入再灌注阶段。这一初始缺血期通常耐受良好，因此显微外科手术的成功率超过90%1,2。然而，需要手术翻修的皮瓣中，仅有63.7%能够完全挽救3。此外，在手指撕脱伤再植病例中，手术成功率为66%4；而在经历I/R损伤的复合组织异体移植中，由于I/R损伤可激活固有免疫，排斥反应的发生率随之升高5,6。
因此，研究这一病理生理现象具有重要意义。在将新疗法应用于人类之前，动物模型对于研究生理机制和评估新疗法至关重要7。由于大鼠的血管解剖结构及生理特征与人类具有相似性，使其成为研究缺血/再灌注损伤等生物学过程的理想模型。
本文介绍了一种建立伴有缺血-再灌注（I/R）损伤的大鼠游离皮瓣模型的详细方案，以及术中和术后评估的多种方法。该方法的总体目标是描述一种可用于研究I/R损伤及其潜在治疗措施的实用临床前模型。
方案
所有操作均遵循赫苏斯·乌松微创外科中心伦理委员会的规定以及地区政府制定的动物福利指南，这些指南基于欧洲立法。
1. 术前与手术准备
- 将体重为290–350 g的Wistar大鼠饲养在22–25 °C的笼具中，自由摄取食物和饮水。术前适应环境1周，以避免应激相关问题。
- 将大鼠放入麻醉诱导室，以0.5–1 L/min流速输送氧气5分钟，并使用蒸发器输送5%七氟烷以诱导麻醉。
- 将大鼠从麻醉舱中取出。将吸入式面罩罩住大鼠，以2%七氟烷气流维持麻醉状态。通过夹捏足趾检查是否无反应。
- 使用眼用保护软膏以防止角膜干燥和损伤。
- 在全身麻醉下监测动物，步骤如下：插入直肠温度计（35.9–37.5 °C），检查黏膜颜色，并放置啮齿类动物脉搏血氧仪以监测氧饱和度2 饱和度（>95%）和心率（250–450 次/分钟）。
- 使用加热支撑装置（如电热垫或循环水毯）以防止低体温，并促进术后麻醉恢复。
- 注射5 mL温热的皮下生理盐水溶液以维持适当的水合状态。
- 术前及术后5天内，皮下注射镇痛和抗炎药物（美洛昔康 1 mg/kg/天）以及预防性抗生素（恩诺沙星 7.5 mg/kg/天）。
- 剃除动物腹部和腹股沟区域的毛发。
- 局部涂抹聚维酮碘，随后使用70%乙醇。用无菌手术巾覆盖动物。
2. 游离皮瓣模型手术
- 使用手术标记笔，在腹部中线处绘制一个 3 cm × 6 cm 的皮瓣，使其一侧 6 cm 边缘与腹部中线对齐。接着，在腹部正中线处做一条 6 cm 的皮肤切口，并在该 6 cm 切口的上端和下端各做一条垂直的 3 cm 切口。
- 开始解剖所设计的 3 cm × 6 cm 皮瓣时，应使用剪刀和 Adson 镊子抬起皮瓣（而非手术刀），因为皮肤具有一定的活动性。
- 轻柔地从头侧向尾侧牵拉皮瓣，以协助解剖，并识别被大量疏松结缔组织包绕的腹上皮血管蒂。
- 解剖皮瓣血管蒂时，应避免直接接触血管，或尽可能少地钳夹外膜，以防损伤血管壁。
- 使用 8/0 尼龙缝线结扎近端尾侧股动静脉、外侧旋股动静脉和隐动静脉，从而由股动脉供血，并通过浅尾侧腹上皮动脉直接延续灌注；静脉回流则通过浅尾侧腹上皮静脉汇入股静脉完成。
- 夹闭血管蒂，随后切断，开始 8 小时缺血期。 术中使用电热毯维持体温。 皮下注射两次 5 ml 温热（25°C）的 0.9% 氯化钠溶液，第一次在手术开始后 2 小时进行，第二次在手术结束时进行，以确保动物顺利恢复。
- 使用肝素化生理盐水（100 U/mL）灌注皮瓣，清除微循环中的滞留血液。
- 使用 10/0 尼龙缝线完成显微吻合术。
- 经过 8 小时缺血后，移除微血管夹以恢复灌注，并按以下所述检查血管通畅性。
3. 术中评估
- 对静脉和动脉进行手动通畅性测试（排空并重新充盈测试）。操作时使用两把显微外科镊子，将其置于吻合口远端，进行挤血操作。首先松开靠近吻合口位置的镊子。若血管段排空后血流仍能持续，则表明吻合口通畅。
- 使用 Transit-Time 超声血流仪和显微外科探头评估血流。
- 测量蒂部血管的直径，以选择合适尺寸的血流探头。
注意：0.7 mm 血流探头可测量直径 0.4 mm 至 0.7 mm 的血管；1.0 mm 血流探头可测量直径 0.7 mm 至 1.0 mm 的血管；1.5 mm 血流探头可测量直径 1.0 mm 至 1.5 mm 的血管。 - 将目标血管置于血流探头的超声感应窗内（反射器与换能器之间），以定量血流量。
注意：保持探头与血管平面垂直，避免施加张力或牵拉。 - 通过观察显示屏上所有指示条是否变为绿色，检查声学耦合质量。
注意：若难以获得良好的声学耦合，可在局部使用超声耦合凝胶或生理盐水溶液。 - 当实现良好耦合且血管无张力地置于声学感应窗内时，点击显示屏上的 记录 按钮以存储数据。
注意：为获得可靠且准确的测量结果，请确保波形模式具有持续可重复性。
- 测量蒂部血管的直径，以选择合适尺寸的血流探头。
- 操作完成后，使用聚乙醇酸（PGA）4-0 可吸收编织缝线（16 mm 3/8 三角针）缝合皮肤。采用单纯间断缝合方式，以防术后大鼠咬断部分缝线时影响组织强度和位置。
- 使用激光散斑对比分析（LASCA）评估皮瓣的微循环。
- 对每只动物及每次随访均建立新的记录。点击 文件/新建记录，新窗口将打开并显示 设置面板。随后编辑项目名称、受试对象、操作者及记录名称等信息。
- 为最大程度提高可重复性，需标准化以下参数：工作距离、测量区域、点密度、帧率及环境光照条件。
- 通过调整激光器与组织之间的相对位置来调节 工作距离。将激光头向目标组织靠近或远离以进行缩放。点击 图像设置 可查看测量值，此处设定为 12.0 cm。
- 在 图像设置 中输入所需的 宽度 和 高度 以标准化 测量区域。设计的皮瓣尺寸为 3 cm × 6 cm。本次测量选择 4.0 cm 宽度和 7.0 cm 高度，以预留额外空间。
- 在 图像设置 中将 点密度 设为最高。可选项包括高、中、低三种。
- 在 图像采集设置 中，选择记录的 帧率（10 帧/秒）和 持续时间（1 分钟）。
注意：在手术或评估过程中，应保持手术室环境光照条件一致。 - 点击 记录 按钮开始采集。此时 设置面板 将被 记录面板 取代，数据将自动保存。在过程中拍摄快照，以便后续比较。
注意：可调整灌注标尺以改善可视化效果（点击 工具 | 滤镜与颜色标尺 | 罐注标尺 | 手动 0 - 150），但实际测得的灌注值不会改变。在记录前后，可创建不同感兴趣区域（ROIs）以测量其内部的灌注情况。本研究仅评估已操作皮瓣区域（3 cm × 6 cm）。
- 使用 ImageJ 软件测量存活面积与坏死面积。
- 在皮瓣旁放置一把标尺，拍摄用于宏观测量皮瓣存活面积的对照图像。
- 为分析图像，打开 ImageJ 用户界面。点击 文件 并 打开 待测图像。
- 在工具箱中选择 直线工具，在标尺的 1 cm 长度上绘制一条直线。点击 分析 | 设定标尺，在已知距离文本框中输入 1 cm。
- 点击 多边形选区工具，沿皮瓣轮廓绘制多边形以计算存活区域。最后点击 分析 | 测量，获取面积数值。
- 将动物安置前，在其身上放置术后敷料，以防止其自残手术区域。 操作结束后，动物 应单独饲养于温度可控（22°C 至 25°C）的房间内的笼具中。
4. 术后评估与组织取样
- 术后第7天，按照本方案中先前描述的相同步骤（步骤1.2和1.3）对大鼠进行麻醉，以进行皮瓣评估和组织取样。通过脚趾夹捏无反应来确认麻醉深度。
- 拍摄手术区域照片，以便对皮瓣存活和坏死面积进行宏观测量。按照本方案中此前已说明的术中评估相同步骤（步骤3.5）进行术后宏观测量。
注意：使用多边形选区工具时需仔细操作，沿皮瓣边界绘制存活区域的轮廓（以cm2为单位测量）。存活区域百分比可通过以下公式计算：（存活区域面积/cm2 ÷ 皮瓣总面积/cm2）× 100。 - 采用LASCA技术评估皮瓣微循环（步骤3.4），以可视化并量化灌注差异。
- 完成宏观分析后，拆除4/0缝线，掀起皮瓣，并利用渡越时间超声技术重新评估血管蒂的血流情况。
- 通过将皮瓣纵向分为两个1.5 cm × 6 cm的部分进行组织取样。
- 将其中一部分浸入含有4%多聚甲醛的活检容器中，在室温下保存，用于后续组织学分析。
- 将另一部分组织放入冷冻保存管中，先浸入液氮，随后在-80 °C条件下长期保存，用于未来的分子分析。
- 根据伦理委员会建议，在吸入性全身麻醉下，通过快速心内注射2 M KCl/kg对大鼠实施安乐死。
结果
显微外科吻合术完成后，我们立即获得了高于文献推荐最低值的血流量8；因此，所有显微外科吻合口在术后1周均保持通畅（图1）。
图 1：基于渡越时间的超声血流评估。 (A) 微外科血流探头用于评估血流的位置。(B) 皮瓣蒂部吻合血管所获得的血流模式与定量结果。请点击此处查看该图的放大版本。
通过LASCA技术，可观察到缺血损伤期间微循环血流的中断，包括皮瓣再灌注时的即刻高灌注，以及术中灌注较低、术后皮瓣坏死风险较高的不同区域，这些区域在研究结束7天后确实发生了坏死（图2）。
图2：激光散斑对比度分析技术 (A生理条件下微循环组织血流灌注的可视化。B缺血期间微循环组织血流灌注的可视化. (C再灌注后立即观察微循环组织血流灌注情况。 请点击此处以查看此图的放大版本。
在经历8小时缺血及其随后再灌注后，皮瓣存活面积约为40%。此前发表的结果9显示，与未施加缺血损伤的皮瓣相比，该模型具有统计学上的显著差异。
讨论
显微外科游离组织移植已成为修复大面积缺损的首选方法。在游离组织移植过程中会发生一段时间的缺血。当这一时间超过组织的耐受限度时，缺血-再灌注（I/R）损伤可导致游离皮瓣手术失败9。建立一种经济高效且具有临床转化价值的缺血-再灌注损伤前临床研究模型的方法学描述，可能有助于推动针对这一病理生理过程的不同化合物的研究。
在所述的动物模型中，血管结扎完成且游离皮瓣抬起后，未观察到后肢血流受限，也无疼痛或跛行现象。正如Kochi等10所述，本模型同样保留了通过肌内网络的三条侧支循环通路。
游离皮瓣的监测至关重要11，因为抢救成功率与缺血发生至临床发现之间的时间呈负相关。因此，应在术中和术后对游离皮瓣进行观察和评估。
术中，常用的排空再充盈试验或声学多普勒技术能够识别吻合口是否存在血流，但无法对血流进行定量分析12。因此，我们采用了渡越时间超声技术，这是一种新型方法，可使外科医生对显微外科吻合口的血流量进行量化13。在本研究中，所有显微外科吻合口在经历8小时缺血损伤后以及研究结束时均保持通畅。显微外科吻合完成后即刻，我们观察到血流量高于文献中推荐的最低值8。这一结果预示研究结束时蒂部灌注良好，表明实验结果未受显微外科技术本身的影响，而是由缺血-再灌注（I/R）损伤级联反应所决定。然而，该技术也存在一定的局限性。为获得可靠结果，显微超声探头必须保持与血管平面垂直，避免牵拉或造成任何张力。良好的声学耦合对于获取准确信号至关重要，可通过使用超声耦合凝胶或生理盐水实现。设备提供的高质量耦合信号是测量过程中需要重点考虑的重要参数。
我们已在术后使用了LASCA，也称为激光散斑对比成像或激光散斑成像14。该技术在此已得到验证，是一种用于游离皮瓣内血流半定量实时成像的有价值方法。其局限性之一在于结果以任意单位表示，无法直接对应实际的血流量值。因此，尚需进一步研究以验证这种相关性。激光多普勒血流仪虽更常使用，但其局限在于仅能测量皮瓣中单一点位的灌注情况，而LASCA则可检测皮瓣内皮肤灌注的区域性变化15。此外，最近一项研究16表明，LASCA可能在围手术期预测术后皮瓣坏死的高风险区域。我们的结果提示，LASCA是一种具有前景的游离皮瓣围手术期及术后监测技术。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究项目在隶属于ICTS Nanbiosis的赫苏斯·乌松微创外科中心（CCMIJU）完成。研究过程中得到了Nanbiosis以下单位的协助：U21，实验手术室；U22，动物饲养单元；以及U14，细胞治疗单元。本工作由ISCIII项目PI16/02164及欧洲区域发展基金（FEDER）“建设欧洲之路”资助。资助方未参与研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写。特别感谢María Pérez在图表绘制方面的贡献，以及Fernanda Carrizosa提供的持续鼓励和对科学文献的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AureFlo 单元 | Transonic (Ithaca, USA) | N/A | 透射时间超声血流测量设备 |
| 基础手部与重建外科综合器械套装（圆柄） | S&T AG (Neuhausen, Switzerland) | RHR-SET. Art.No.00795 | 显微外科器械套装 |
| FLOW-i | Maquet Critical Care AB (Solna, Sweeden) | N/A | 麻醉输送系统 |
| 微型钳 ABB-1 | S&T AG (Neuhausen, Switzerland) | 00408V | 带支架的双联微血管钳 |
| 微型钳 ABB-11 | S&T AG (Neuhausen, Switzerland) | 00414V | 无支架的双联微血管钳 |
| 微型钳 B-1 | S&T AG (Neuhausen, Switzerland) | 00396V | 单联微血管钳 |
| 尼龙缝线 10/0 | Laboratorio Aragó (Barcelona, Spain) | 19921 | 显微外科缝线 |
| OPMI Pentero 800 | Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany) | N/A | 手术显微镜 |
| PeriCam PSI 系统 | Perimed AB (Järfälla, Sweden) | N/A | 激光散斑对比分析设备 |
| Philips Intellivue MX450 | Philips Medizin Systeme (Böblingen, Germany) | N/A | 监护系统 |
| 啮齿类动物术后保护装置 | Fundación Centro de Cirugía de Mínima Invasión Jesún Usón (Cáceres, Spain) | P201400272 | 啮齿类动物术后保护器 |
参考文献
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