重建显微外科缺血再灌注损伤研究的临床前大鼠模型

显微外科已成为一种常见的重建手术技术，它允许干预（例如，自由组织转移），以恢复复杂的组织缺陷，重新种植截肢，甚至复合组织异体移植。

显微外科重建是创伤、烧伤或肿瘤切除引起的各种缺陷的理想选择。然而，自由瓣故障的百分比较低，其中缺血性再灌注（I/R）损伤是主要原因之一。所有显微手术转移组织都经受强制性缺血期，然后进行再灌注。这一时期原发性缺血通常耐受性良好;因此，显微外科手术的成功率超过90%1，2。然而，只有63.7%的皮瓣需要手术修正可以完全^保存3。此外，在再植手指外伤的情况下，成功率^为66%4;在复合组织异体移植遭受I/R损伤的情况下，由于I/R损伤激活先天^{免疫5，6，}排斥百分比增加。

因此，研究这种病理生理学现象是值得关注的。动物模型对于研究生理机制和评估新疗法至关重要，才能应用于^人类。血管解剖学和大鼠与人类的生理相似性使大鼠成为研究I/R损伤等生物过程的理想模型。

在这里，我们提出了一个详细的协议，用于创建具有I/R损伤的无鼠皮瓣模型，以及术中和术后评估的不同可能性。该方法的总体目标是描述一个有用的临床前模型，以研究I/R损伤和可能的治疗方法，以减少其相关损害。

所有程序均按照Jesés Usón微创手术中心的道德委员会和基于欧洲立法的地方政府的福利准则进行。

1. 手术前和外科准备

1. 在22~25°C的笼子里，有290~350克重的威斯塔大鼠，可以自由获得食物和水。手术前1周适应，以防止压力引起的问题。
2. 将大鼠放入麻醉诱导室，输送5分钟氧气（0.5-1升/分钟），并使用蒸发器输送5%的分氟病以诱导麻醉。
3. 麻醉后将大鼠带出腔室。将吸入面罩放在大鼠身上，并提供2%的分氟化物流速以维持麻醉。检查脚趾捏没有反应。
4. 使用眼保护膏，防止角膜干燥和损伤。
5. 监测动物在一般麻醉下如下:放置直肠温度计（35.9~37.5 °C），检查粘膜颜色，并定位啮齿动物脉搏血氧仪，_检查O2饱和度（>95%）和心率（250~450 bpm）。
6. 使用热支持（电加热垫或循环水毯）来避免体温过低，并改善术后麻醉恢复。
7. 注射5 mL的温暖皮下生理盐水溶液，以保持适当的水化。
8. 在手术前和术后5天，提供镇痛和消炎药（1毫克/千克/天）和预防抗生素（安罗伐沙辛7.5毫克/千克/天）。
9. 勒有动物的腹部和内脏区域。
10. 应用局部的波维酮碘，然后70%乙醇。用无菌窗帘盖住动物。

2. 免费皮肤皮瓣模型手术

1. 使用手术标记，绘制一个3厘米x6厘米的活门匹配6厘米两侧与腹部中线。接下来，在腹部中线进行6厘米的皮肤切口，在6厘米中线切口的上部和下部进行两个垂直3厘米切口。
2. 要开始解剖设计的 3 厘米 x 6 厘米皮瓣，使用剪刀和 Adson 钳子提高皮瓣 （而不是手术刀） 由于皮肤的流动性。
3. 轻轻地将皮瓣从颅面区域拉向胆小板区域，以帮助进行解剖，并确定被大量松散结缔组织包围的表观胃囊。
4. 在不接触皮瓣的情况下，不接触它，或者尽可能少地抓住花瓣，以避免损坏船壁。
5. 使用 8/0 尼龙缝合线通过结扎近端牛股体血管、侧周弯曲股体容器和树液容器来遮挡。因此，皮瓣的灌注由股动脉提供，并直接通过表面的牛皮胃动脉继续，而静脉排水由表面牛皮胃静脉对股骨静脉执行。
6. 夹紧血管，然后切开它，开始8小时缺血期。在手术过程中使用电热毯来保持温度。两次5ml注射热 （25°C） 0.9% 盐水溶液被分皮施用。第一次管理在程序开始后 2 小时执行;第二个在程序结束时获得动物的适当恢复。
7. 使用肝素化盐水溶液（100 U/mL）注入皮瓣，从微循环中去除停滞的血液。
8. 使用10/0尼龙缝合线进行显微手术麻醉剂。
9. 8小时后缺血后，通过取出微血管夹来重新注入皮瓣，并检查如下所述的血管通量。

3. 术中评估

1. 对静脉和动脉执行手动试管测试（空和填充测试）。为此，使用两个显微手术钳，将它们定位到远端的麻醉，并进行挤奶。首先释放最接近阿阿托莫西斯站点的钳子。如果血管部分被清空后血流继续，那么血管炎是专利。
2. 使用中转时间超声波流量计和显微外科探头评估血流量。
   1. 测量水泡容器的直径，以便为流动探头选择合适的尺寸。
      注:0.7 mm 流量探头可测量 0.4 mm 至 0.7 mm 的容器;1.0 毫米流量探头可测量 0.7 mm 至 1.0 mm 的容器;1.5 mm 流量探头可测量 1.0 mm 至 1.5 mm 的容器。
   2. 将目标容器放置在流量探头的超声波感应窗口（反射器和传感器之间），以量化流量。
      注:将探头保持空对容器平面，以避免任何张力或拉力。
   3. 通过观察显示屏上所有条形均为绿色，检查声耦合的质量。
      注:如果难以获得良好的声学耦合，请使用超声波凝胶或生理盐水溶液进行局部使用。
   4. 当实现良好的耦合并将容器放置在无张力的声学窗口中时，单击显示屏上的"记录"按钮以存储数据。
      注:要获得可靠和正确的测量，请确保波形模式是可连续重复的。
3. 完成后，使用聚糖酸 （PGA） 4-0 可吸收编织缝合线 （16mm 3/8 三角针） 关闭皮肤。如果部分缝合线在术后被大鼠咬掉，请使用简单的中断模式来维持强度和组织位置。
4. 使用激光斑点对比度分析 （LASCA） 评估活门的微循环。
   1. 为每个动物和每次研究的后续记录进行新的记录。为此，请单击"文件/新录制"。将打开一个新窗口，并显示"设置面板"。然后编辑项目名称、主题、操作员和录制名称的信息。
   2. 为了达到最大可重复性，可标准化以下参数:工作距离、测量面积、点密度、帧速率和环境光照条件。
      1. 通过移动与组织相关的激光来调整工作距离。放大或缩小激光头朝向感兴趣的组织。要检查测量值，请单击"图像设置"。这里，设置在12.0厘米。
      2. 通过在图像设置中输入所需的宽度和高度来标准化测量区域。设计的活门尺寸为 3 厘米 x 6 厘米。对于此测量，请选择宽度为 4.0 厘米和高度为 7.0 厘米以具有一些额外空间。
      3. 在图像设置中将点密度设置为高。高、中和低是三个选项。
   3. 在图像捕获设置中，选择录制的帧速率（10 图像/秒） 和录制持续时间（1 分钟）。
      注:在手术或执行评估时，在手术室中具有相同的环境光条件。
   4. 单击"录制"按钮开始录制。设置面板由录制面板替换。数据将自动保存。在此过程中拍摄快照，以便进一步比较。
      注:可以更改灌注比例以提高可视化效果（单击"工具" |过滤器和色阶 |灌注量表 |手动 0 - 150），但测量的灌注值不会受到影响。在录制之前和之后，可以创建不同的兴趣区域 （ROIs） 来测量其中的灌注。在这里，我们只评估了练习的活门区域（3 厘米 x 6 厘米）。
5. 使用 ImageJ 软件测量生存和坏死区域。
   1. 在活门侧面找到一把尺子，然后拍摄控制图片，以对活门生存区域进行宏观测量。
   2. 要评估图片，请打开 ImageJ 用户界面。单击"文件"并打开要测量的图像。
   3. 在工具箱处选择直线，并在标尺 1 厘米以上绘制一条直线。点击分析 |设置比例，并在文本框中引入已知距离值 1 厘米。
   4. 单击"多边形选择工具"，并在活门上绘制多边形线以计算可行区域。最终，点击分析 |度量以获取面积值。
6. 在住房前在动物身上放置术后敷料，以防止手术区域自残。手术后，动物分别被安置在笼子里，在有温度控制的房间里（22°C至25°C）。

4. 术后评估和组织取样

1. 按照本议定书（步骤1.2和1.3）中前面描述的步骤，在术后7天对大鼠进行皮瓣评估和组织取样麻醉。检查麻醉的深度，因为对脚趾捏没有反应。
2. 拍摄手术区域，以便对皮瓣生存和坏死区域进行宏观测量。按照协议（步骤 3.5）中之前解释的术中评估的相同步骤进行术后宏观测量。
   注:在使用多边形选择工具时，请注意绘制分隔可行区域的活门上的线条（以厘米²为单位）。可计算面积的百分比可以计算为（可生存面积的厘米^2/总活门面积的 cm^2） = 100。
3. 使用 LASCA 技术（步骤 3.4）评估活门的微循环，以可视化和量化灌注差异
4. 在宏观分析后，去除4/0缝合线，并升高皮瓣，使用中转时间超声波重新评估血管血流量。
5. 通过纵向将活门分成两个部分，1.5 厘米 x 6 厘米，执行组织采样。
   1. 在室温下将一部分浸入活检容器中，在室温下使用4%的甲醛，以便进行进一步组织学分析。
   2. 将组织的另一部分引入冷冻保存管中，将其浸入液氮中，然后冷冻保存管，将其储存在-80°C，以用于未来的分子分析。
6. 根据道德委员会的建议，在普通吸入麻醉下，使用2M KCl/kg的快速心脏内注射对大鼠进行安乐死。

在显微外科麻醉剂的产生之后，我们获得比文献8中建议的最小流量更高的血流量;因此，所有显微外科麻醉剂在手术后1周均获得专利（图1）。

图1:过境时间超声血流评估。（A） 显微外科流动探针的位置，以评估血流。（B） 皮瓣的血管获得血流模式和定量。请点击此处查看此图的较大版本。

利用LASCA技术，观察缺血性侮辱期间血流的微循环剥夺，包括皮瓣再灌注过程中的立即过度灌注，以及术前，在研究结束后7天确实坏死的术后皮瓣坏死的不同区域（图2）。

图2:激光斑点对比度分析技术。（A） 生理条件下微循环组织血液灌注的可视化.（B） 缺血期间微循环组织血液灌注的可视化. （C） 再灌注后立即对微循环组织血液灌注进行可视化.请点击此处查看此图的较大版本。

8小时后缺血及其后续再灌注后的皮瓣生存面积约为40%。先前公布的结果9显示，当该模型与未造成缺血性侮辱的皮瓣进行比较时，具有统计学意义。

作者没有什么可透露的。