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使用基于FRET的传感器ATeam1.03YEMK对小鼠脑组织切片中细胞内ATP进行成像

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DOI：

10.3791/60294

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2019年12月19日

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1Institute of Neurobiology, Heinrich Heine University Düsseldorf, 2Department of Neurology, Düsseldorf University Hospital

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们描述了一种在小鼠前脑器官型脑片培养物中实现基因编码的基于FRET的传感器ATeam1.03YEMK细胞类型特异性表达的实验方案。此外，我们展示了如何利用该传感器对神经元和星形胶质细胞中的细胞ATP水平进行动态成像。

摘要

中枢神经系统（CNS）中的神经元活动会引发对细胞能量的高需求，这些能量由三磷酸腺苷（ATP）的分解提供。其中很大一部分ATP用于重建因神经元电信号传导而破坏的质膜离子梯度。有证据表明，星形胶质细胞虽然自身不产生快速的电信号，但能响应神经元活动而增加ATP的生成，并通过向活跃的神经元提供能量代谢物来支持其功能。近年来，针对不同代谢物的基因编码传感器的发展，使得研究神经元与星形胶质细胞之间的此类代谢相互作用成为可能。本文中，我们描述了一种利用腺相关病毒载体（AAV），在小鼠海马和皮层的器官型脑片培养物中实现ATP敏感型荧光共振能量转移（FRET）传感器ATeam1.03YEMK在特定细胞类型中表达的实验方案。此外，我们还展示了如何利用该传感器动态测量细胞外钾离子浓度升高以及化学性缺血（即细胞能量代谢受抑制）诱导后，神经元和星形胶质细胞内ATP水平的变化。

引言

神经元的兴奋性电活动主要依赖于钠离子（Na+）和钾离子（K+）等阳离子跨质膜的流动。因此，维持这两种离子的电化学梯度对于信号传导至关重要。这一过程由细胞膜上的Na+/K+-ATP酶（NKA）完成，NKA是一种普遍表达的生电型跨膜泵，每运输周期可将3个Na+排出细胞，同时摄入2个来自细胞外空间的K+，并消耗一分子ATP1。除了NKA外，还有多种消耗ATP的离子转运体，例如质膜Ca2+-ATP酶，该酶在活动诱导的钙内流之后，对维持细胞内Ca2+稳态及其外排具有关键作用2。在突触前囊泡中，一种液泡型H+-ATP酶（v-ATP酶）可建立质子梯度，该梯度是神经递质被摄入囊泡所必需的条件3。

尽管神经元的活动需要大量ATP4，但它们自身储存能量的能力却十分有限。相反，神经元似乎依赖于与邻近星形胶质细胞的代谢相互作用，后者是大脑中主要的糖原储存部位5。有研究提出，星形胶质细胞中的糖原确实在满足神经元能量需求方面发挥着重要作用；而在这类假定的神经元-胶质细胞代谢偶联中，一个关键现象是星形胶质细胞能够响应神经元活动而增强其ATP的生成能力6,7,8。这一假说被称为星形胶质细胞-神经元乳酸穿梭（astrocyte-neuron lactate shuttle, ANLS），目前仍存在争议，因为其他研究已提供证据表明，神经元自身在受到刺激时也可能提高糖酵解速率9,10，这反映出有必要开发更多方法和技术来深入研究神经元与胶质细胞之间的相互作用。

长期以来，由于缺乏适用于检测脑组织活细胞中代谢物浓度变化的探针，对神经元和星形胶质细胞的能量代谢及ATP水平的研究一直受到阻碍。然而，过去十年中，针对多种代谢物（包括ATP、乳酸、丙酮酸等）的新型工具和基因编码的荧光探针得到了快速发展11,12。利用这些工具，现在可以在完整脑组织中，以单细胞分辨率和细胞类型特异性的方式，直接研究与细胞ATP消耗及细胞能量水平变化相关的问题13。

在本研究中，我们描述了一种用于可视化培养的脑片组织切片中神经元和星形胶质细胞胞质内ATP动态变化的方法。我们展示了如何利用腺相关病毒载体（AAV）在小鼠脑片的神经元和星形胶质细胞中实现基因编码的ATP纳米传感器ATeam1.03YEMK（14）的细胞类型特异性表达，这些脑片可在细胞培养条件下维持数周15。本文还介绍了一种去除覆盖在培养组织切片表面的胶质瘢痕的方法，从而改善对下方器官型组织层中细胞的光学通透性和成像效果。最后，我们展示了在此模型中如何利用ATeam1.03YEMK进行基于FRET的细胞ATP水平变化成像。该方法具有多项主要优势：无需进行脑部手术操作，在培养的脑片中可实现传感器的高表达水平和细胞类型特异性，与电穿孔转染或其他病毒载体转导等方法相比，对细胞的侵入性和应激更小10,16,17。此外，本方案也可应用于其他基于FRET的纳米传感器，包括ATeam1.03的若干变体，后者对ATP具有更低的结合亲和力14。

方案

本研究严格遵循杜塞尔多夫海因里希·海涅大学的机构指南以及欧洲共同体理事会指令（2010/63/EU）。所有使用脑片组织培养的实验均已向杜塞尔多夫海因里希·海涅大学动物护理与使用设施的动物福利办公室通报并获得批准（机构许可编号：O50/05）。根据欧洲委员会的建议18，出生后10天以内的动物通过断头法处死。

1. 器官型脑切片培养物（OTCs）的制备

  1. 手术前一天或至少在手术前30分钟
    1. 准备培养皿（无菌条件下）。取下6孔板的盖子，向每个孔中加入800–850 µL OTC培养基。将板置于培养箱中（37 °C，5% CO2/95% O2），直至使用前。
    2. 准备清洗用培养皿（无菌条件下）。向每个30 mm培养皿中加入3 mL HBSS。每次手术共需5个培养皿。将其置于培养箱中（37 °C，5% CO2/95% O2）至少30分钟，可过夜，直至使用前。
    3. 配制ACSF（表1）。将不含葡萄糖的生理盐水于4 °C保存至次日。
生理盐水与培养基——配方
名称缩写成分浓度 [mM]备注
人工脑脊液溶液ACSFNaCl125用 5% CO2/95% O2 气体饱和，pH 7.4
KCl2.5使用前立即加入葡萄糖。
CaCl22含葡萄糖时储存不得超过一天
MgCl21约 310 mOsm/L
NaH2PO41.25
NaHCO326
Glucose20
实验用 ACSFE-ACSFNaCl136用 5% CO2/95% O2 气体饱和，pH 7.4
KCl3使用前立即加入葡萄糖。
CaCl22含葡萄糖时储存不得超过一天
MgCl21约 320 mOsm/L
NaH2PO41.25
NaHCO324
Glucose5
Lactate1
化学性缺血溶液CISNaCl136用 5% CO2/95% O2 气体饱和，pH 7.4
KCl3约 318 mOsm/L
CaCl22
MgCl21
NaH2PO41.25
NaHCO324
2,2-脱氧葡萄糖2
NaN35
8 mM 钾 ACSF8 mM K+ ACSFNaCl128用 5% CO2/95% O2 气体饱和，pH 7.4
KCl8约 320 mOsm/L
CaCl22
MgCl21
NaH2PO41.25
NaHCO324
Glucose5
Lactate1
HEPES 缓冲 ACSFH-ACSFNaCl125用 NaOH 调节至 pH 7.4
KCl3使用前立即加入葡萄糖
CaCl22含葡萄糖时储存不得超过一天
MgSO42约 310 mOsm/L（用蔗糖调节）
NaH2PO4125
Hepes25
Glucose10
汉克斯平衡盐溶液HBSSSigma（货号 H9394）。
杜尔贝科磷酸盐缓冲液DPBSGibco（货号 14287-080）
器官型培养基OTC 培养基热灭活马血清20%34°C，5% CO2，pH 7.4，培养条件下
MEM79%约 320 mOsm/L
L-谷氨酰胺1
胰岛素0.01 mg/mL
NaCl14.5
MgSO42
CaCl21.44
抗坏血酸0.00125 %
D-葡萄糖13

表1：溶液组成。

  1. 在制备当天，将葡萄糖加入ACSF中，置于冰上，并用95% O2/5% CO2持续通气至少30分钟，使pH值达到7.4。
  2. 解剖与切片
    1. 通过快速断头法处死出生后6至8天的小鼠（BalbC品系，雌雄均可），并将头部放入盛有冰冻ACSF的玻璃培养皿中。
    2. 从后部切开皮肤直至鼻骨后端以暴露颅骨，然后使用手术剪从枕骨大孔处小心剪开颅骨，暴露脑组织。
      注意：请确认该操作符合所在机构的相关指导原则。
    3. 取出脑组织，置于盛有冰冻ACSF的培养皿中的滤膜上。
    4. 分离大脑半球，并以45°角进行旁矢状切面切割。用速干胶将其中一个半球固定在振动切片机的组织台上。立即将组织块转移至盛有冰冻ACSF（用5% CO2/95% O2通气）的振动切片机浴槽中，最后对齐组织。另一个半球继续保存在冰冻ACSF中，待后续切片使用。
    5. 调节振动切片机，将切片厚度设为250–400 µm。以250 µm厚度切片时，每只动物可获得约12片切片（400 µm时约为7片）。
    6. 切片完成后（图1A），根据海马结构典型的形态特征（图1）进行识别，并使用皮下注射针头（23号，1英寸）分离海马，保留与海马相邻的部分大脑皮层。
      注意：在培养过程中保留新皮层有助于维持海马的完整性。但如有需要，也可在无皮层的情况下分离并培养海马。
    7. 将切片置于金属网架上，浸入预热的ACSF中（34 °C，用5% CO2/95% O2通气），直至所有切片收集完毕。
    8. 将切片转移至层流洁净台中，继续在无菌条件下操作。

脑切片比较，解剖结构；急性与器官型培养，标记区域，示意图，神经科学研究。
图1：急性与器官型脑切片制备的代表性透射图像。 使用宽场透射照明显微镜比较急性分离的旁矢状位脑切片（A）与培养维持12天的旁矢状位器官型脑切片（B）。DG = 齿状回；CA1/3 = 海马CA1/CA3区；E-CTX = 内嗅皮层；CTX = （新）皮层。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 切片培养

  1. 使用倒置的无菌玻璃巴斯德移液管，将切片从ACSF轻柔转移至一个预先温育的、盛有无菌Hank's盐溶液的培养皿中。
    注意： 组织的灭菌通过稀释实现（步骤3.2）。转移至培养皿时应尽量减少ACSF的带入量。
  2. 更换移液管，将切片转移至第二个培养皿。整个过程共重复5次。每次转移至后续培养皿时，应尽量减少HBSS的带入量。
  3. 每次将一个切片轻柔地放置于培养插件的膜表面。对每个切片重复此操作。避免移液管内产生湍流，等待切片缓慢沉降至巴斯德移液管尖端后再进行操作。每个膜上最多可放置4个切片。
  4. 使用细尖吸头小心去除插件表面多余的Hank's溶液。
  5. 将培养物（图2）置于37 °C培养箱中，在气相（碳氧混合气体，95% O2/5% CO2）与液相的界面处培养，直至实验当天。每2–3天更换一次培养基。

海马类器官培养示意图、AAV转导、用于神经元成像的FRET分析。
图2：利用基因编码传感器ATeam1.03YEMK在培养的类器官脑片中进行基于FRET的ATP成像原理。 本研究所展示方案的示意图。简言之，将培养1-3天的旁矢状面类器官脑片，用含有星形胶质细胞特异性hGFAP启动子或神经元特异性hSyn启动子以及ATeam1.03YEMK表达序列的腺相关病毒载体进行转导。将这些病毒载体稀释后（1:2-1:4）直接加于脑片表面，并在培养条件下继续培养至少6天以上。随后，通过在434 nm波长下激发，并同时在527 nm（受体）和475 nm（供体）处采集荧光发射信号，即可在表达该传感器的细胞中可视化其胞内ATP水平的变化。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 使用腺相关病毒载体表达ATP传感器（图2）

注意：务必满足所有关于转基因生物处理的要求！

  1. 处理病毒载体时，将腺相关病毒载体（AAV2/5）分装为每份 1–2 µL，以避免反复冻融。将分装后的样品储存于 -80 °C。
  2. 在无菌操作台内放置一个含有 10% 次氯酸钠的烧瓶，用于丢弃所有接触过病毒载体的已使用残留材料。
  3. 进行转导时，将 1 µL 病毒载体与 2–3 µL DPBS 混合稀释。储存液的物理滴度通常在每毫升 1012 个病毒基因组（vg/mL）左右。
  4. 将含有培养脑片的插件转移至无菌操作台内。
  5. 在不接触组织的情况下，将 0.5 µL 稀释后的病毒液直接加至每片脑片的表面。
    注意：在体外培养 1–3 天（DIV）时对培养脑片进行转导，可在组织深层获得更佳的表达效果。对培养时间较长的脑片进行转导，可能导致表达主要出现在周围胶质瘢痕中的细胞，或神经元中的表达水平较低。
  6. 最后，将脑片放回培养箱，继续培养至少 6 天。转导当天不要更换培养基。

4. 胶质瘢痕的清除（图3）

  1. 实验开始前，将含有培养脑片的插入物转移至无菌操作台，并放入一个含有 1 mL OCT 培养基或 MEM 的 30 mm 培养皿中。
  2. 将培养皿置于体视显微镜下，聚焦于脑片表面。
  3. 使用两根无菌皮下注射针（23 G，1"）在选定脑片的狭窄边缘处进行短的十字切口（图 3）。该操作可释放由胶质瘢痕产生的表面张力，使组织回缩，从而暴露其下方的层次结构（见 图 5）。
    注意： 第一层组织（胶质瘢痕）主要由反应性星形胶质细胞构成。在宽场成像中，这一致密组织层会导致光线额外散射，从而产生模糊图像。因此，去除瘢痕有助于更清晰地观察包含正常器官型组织的深层结构。操作时需注意仅在脑片制备物的边缘及表层进行切口，避免损伤下方组织。我们未观察到带有胶质瘢痕的器官型脑片与无瘢痕脑片所获得数据之间的差异（数据未显示）。
  4. 从插入物中取出已准备好的脑片。使用无菌手术刀，在镊子夹住膜边缘的同时，沿膜做两条平行直线切割，将脑片居中切割成方形或三角形。若插入物上还含有其他脑片，则将其放回原培养板并送入培养箱。培养基的表面张力可防止液体渗漏至膜表面。

神经科学研究中使用注射器示意图进行脑部特定区域靶向注射的技术。
图3：机械去除胶质瘢痕的示意图。 该图显示了一个被胶质瘢痕（蓝色椭球状结构）覆盖的海马脑片培养物。通过在培养物最小极点以及胶质瘢痕边缘（蓝色虚线）处使用两根注射器针头进行一次剪切操作，可使瘢痕翻转移开。请点击此处查看该图的放大版本。

5. 基于FRET的ATP成像（图4）

  1. 实验前，准备好E-ACSF并用95% O2/5% CO2气体饱和至少30分钟，以达到pH值7.4。打开单色仪的荧光光源（氙灯）（图4）。在将脑片从孵育箱中取出前，立即开始灌流。
    注意：整个实验过程中，需持续用95% O2和5% CO2混合气体饱和灌流液。
  2. 将脑片转移至实验记录室，使用蠕动泵持续灌注新鲜碳合化（carbogenated）的E-ACSF（图4）。随后用网格固定脑片。将记录室放置于显微镜载物台上，并连接灌流系统。建议使用防漏气的实验室管路进行灌流。
    注意：实验可在室温或接近生理温度下进行，具体取决于实验设计。需检查灌流系统的稳定性和可靠性，以避免因组织移动和/或剪切应力变化导致的聚焦漂移。我们实验室及许多其他实验室常用的脑片灌流标准流速为1.5–2.5 mL/min。

荧光成像光谱系统；示意图和显微镜、发射分析、组织研究。
图 4：FRET 成像系统的配置。（A）FRET 成像系统所需各组件及其空间排列的示意图。该系统由单色器（以氙灯作为光源）、直立式固定载物台显微镜（1）、图像分光系统（2）、用于延时记录的数字 CCD 或 CMOS 相机（3）以及适用于稳定持续灌流的实验浴槽（4）组成。浴槽灌流通过可调节流速的蠕动泵实现。（B）实验工作区的照片。FRET 成像系统安装在带有 x/y 平移台的防振台上，实验浴槽嵌入其中。编号：见（A）。（C）光路从单色器到数字相机的示意图。图中显示了各种滤光片和二向色镜的位置。编号：见（A）。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 使用透射光将培养的脑片调至焦点，确定实验操作区域（示例：海马体CA1区）。在开始成像实验前，至少等待15分钟，使脑片适应灌流液环境。实验装置的配置参见图4。
  2. 打开相机和成像软件，然后选择合适的滤光镜组。
  3. 在435/17 nm（约435 nm）激发供体荧光蛋白（eCFP），设置曝光时间为40至90 ms。
    注意：强荧光光照可能对脑片产生光毒性效应。
  4. 在435 nm激发下，可在475 nm（eCFP；供体）和527 nm（Venus；受体）均检测到发射光。使用发射光图像分光器在500 nm处分割荧光发射信号，并采用带通滤光片（483/32 和 542/27）进一步分离供体和受体荧光。若表达过强可能导致探测器饱和，此时可使用中性密度滤光片降低激发光强度。
  5. 选择一个明显无细胞荧光的区域作为背景扣除的感兴趣区域（ROI），然后创建勾画细胞胞体的感兴趣区域。
  6. 设置图像采集频率和总记录时间。对于长时间（>30分钟）实验，建议采集频率为0.2–0.5 Hz，以避免光毒性。
  7. 开始记录。建议至少在基线条件下记录5分钟，以确保样本状态稳定。
    注意：记录过程中如需，可调整细胞的焦平面。
  8. 为诱导细胞内ATP水平变化，将灌流管从标准ACSF切换至含有代谢抑制剂的灌流液（例如CIS，见表1及下文）。或者，可使用高钾浓度灌流液以模拟活跃神经元释放的钾离子。
    注意：浴式灌流作用较慢，且对整个样本产生全局性影响。需记录新溶液实际开始进入实验浴槽的时间。根据灌流槽与储液器之间的距离以及灌流速度，应考虑存在一定的延迟时间。

6. 细胞ATeam荧光的高分辨率记录

  1. 记录完成后，立即将含有脑片培养物的记录室转移至共聚焦激光扫描显微镜。
    注意：需特别小心。由于可能存在光损伤，此步骤仅在实验结束后进行。出于记录目的，可将E-ACSF更换为H-ACSF，因此不一定需要灌流系统。
  2. 在当前光学配置允许的最高z轴分辨率下采集z轴层扫图像。
  3. 应用去卷积算法以提高图像分辨率。

结果

AAV 载体是一种可靠的工具，可用于在活体组织中的特定细胞内选择性表达外源基因16。将含有 ATeam1.03YEMK 序列盒和特定启动子的 AAV 直接施加于组织，可在目标细胞类型中实现该传感器的高效表达。在体外培养的脑片组织中，转导约 10 天后（即 DIV 14），在切片表面以下深度达 50 µm 的新皮层区域，可在高密度下观察到在人源突触素启动子驱动下表达 ATeam 的神经元（图 5A）。在海马区也可获得类似结果（图 5B）。

皮层和海马神经元培养，荧光显微镜，细胞分布的三维可视化。
图 5：培养的旁矢状面脑片中表达 ATeam1.03YEMK 的神经元的可视化。 左侧图像分别为皮层组织 43 个光学切片（每个 1.05 µm）的扩展焦面投影（A）和海马组织 70 个光学切片（每个 0.6 µm）的投影（B）。右侧图像表示相同投影的体积视图。细胞根据其相对于切片表面的深度进行颜色编码，颜色编码标准见右侧的颜色标尺。 请点击此处查看该图的放大版本。

为检测星形胶质细胞中的ATP水平，在人源胶质纤维酸性蛋白（GFAP）启动子的调控下表达ATeam1.03YEMK。这可在培养的脑片组织的新皮层和海马区实现高效的细胞转导（图6）。值得注意的是，根据细胞在脑片中所处的深度不同，可区分出两种不同的形态表型。在浅层区域，细胞具有较粗大的初级突起，主要平行排列于脑片表面。这些细胞的结构域高度重叠，形成致密的网状结构，呈现出明显的反应性星形胶质细胞特征（图6）。而在较深层（距表面30–60 µm），转导的星形胶质细胞具有细密的细胞突起，形成近似球形的结构域，其形态与先前报道的原位星形胶质细胞相似19,20,21（图6）。为了更有效地转导深层星形胶质细胞并改善对这些深层区域的光学通透性，可按照步骤4所述方法去除胶质瘢痕组织。

培养中的海马星形胶质细胞层；荧光显微镜；z轴堆栈深度分析。
图6：培养的旁矢状面脑片中表达ATeam1.03YEMK的星形胶质细胞的可视化。 左侧图像为191个光学切片（每个0.45 µm）的扩展焦面投影。为便于说明，星形胶质细胞的投影中已排除胶质瘢痕部分。右侧图像表示同一投影在去除胶质瘢痕前后的三维视图。细胞根据其相对于切片表面的深度进行颜色编码，颜色标尺见右侧所示。请点击此处查看该图的放大版本。

成功表达 ATeam1.03YEMK 可实现对神经元或星形胶质细胞中 ATP 水平动态变化的检测，具体取决于所使用的启动子（见上文）。实验在持续灌流 E-ACSF（用 95% O2/5% CO2 气体饱和）的实验浴槽中进行。在海马神经元中表达 ATeam1.03YEMK 的脑片培养物中，于开始记录前选定感兴趣区域（ROIs），代表锥体细胞的胞体（图 7A）。此外，还选择了一个用于背景扣除的区域（图 7A）。随后分别采集每个 ROI 的 Venus 和 eCFP 荧光发射信号，并以随时间变化的荧光发射强度形式呈现（图 7B）。在对照条件下记录数分钟荧光信号，以确保基线稳定后，通过将脑片暴露于无葡萄糖人工脑脊液并添加 5 mM 叠氮化钠（NaN3）处理一分钟，抑制细胞代谢（图 7B）。该操作诱导了 FRET 供体-受体对发射强度的相反变化（图 7B，左图），表现为 Venus（527 nm）发射减少，而 eCFP（475 nm）发射增强。通过将 Venus 荧光发射强度除以 eCFP 荧光发射强度（FVenus/FeCFP）计算 FRET 比值，所得信号反映了细胞内 ATP 水平的相对变化，即所谓的“ATeam FRET 比值”（图 7B，右图）。在所有记录的神经元中（n = 70 个细胞，N = 5 片脑片），NaN3 引起 ATeam FRET 比值可逆性下降，表明在细胞代谢被抑制时，细胞内 ATP 水平出现可逆性降低。

荧光比率成像；CA1海马神经元FRET分析；荧光反应图。
图7：ATeam FRET比率成像的时间推移演示。（A）左上方：表达ATeam1.03YEMK的培养脑片海马CA1区锥体层和辐射层的宽场荧光图像，神经元中表达该探针。右上方：左侧方框区域的放大视图。白色线条标出用于分析的感兴趣区域（ROIs）1-3，代表CA1锥体神经元的胞体（见（B））。BG表示用于背景校正的感兴趣区域。下方：伪彩色图像，显示Venus（绿色）、eCFP（紫色）的荧光发射以及Venus/eCFP的比率。（B）在ROIs 1-3中的时间推移记录，代表神经元胞体（见图A）。左侧曲线显示Venus（绿色）和eCFP（品红色）的归一化荧光发射。右侧曲线显示相应的ATeam FRET比率。请注意，在无细胞外葡萄糖条件下灌注5 mM NaN3 1分钟（灰色条）会引起ATeam FRET比率的可逆性下降，表明细胞内ATP浓度降低。请点击此处查看该图的放大版本。

为确保在长期实验条件下制备物和传感器的稳定性，表达ATeam的神经元或星形胶质细胞的脑片持续灌注人工脑脊液（ACSF）较长时间（>50 分钟；每组 n = 12 个细胞，N = 3 个脑片来自 3 个大脑）。在这些条件下，ATeam 的 FRET 比值未发生改变（图 8）。相比之下，将制备物暴露于含有代谢抑制剂的缺糖缺氧溶液（“化学性缺血”，见 表 1）时，ATeam 的 FRET 比值再次出现如上所述的预期下降。

化学性缺血条件下神经元和星形胶质细胞的ATeam FRET比率图；时间与比率分析。
图8：使用ATeam的基线实验。 在基线条件下，对14个不同细胞中的神经元（上图）和星形胶质细胞（下图）进行长期ATeam FRET比率成像。数据采集条件与其他实验数据具有可比性。每次测量结束时，通过灌注CIS诱导化学性缺血，如箭头所示。注意：在基线条件下，ATeam FRET比率随时间保持稳定。请点击此处查看该图的放大版本。

接下来，我们分析了表达 ATeam1.03YEMK 的神经元和星形胶质细胞对细胞外钾离子浓度升高的反应。在建立稳定的基线后，用钾离子浓度从 3 mM 升至 8 mM 的生理盐水灌注神经元，持续 3 分钟（图 9A）。然而，该操作并未引起 ATeam FRET 比值的可检测变化（n = 56 个细胞，N = 5 个脑片）。为确认该传感器能够响应 ATP 水平的变化，随后再次将脑片暴露于化学性缺血状态，即用 CIS 液体替代 E-ACSF 以诱导持续的缺血。化学性缺血导致 ATeam FRET 比值迅速下降至一个新的稳定水平，表明在 2–3 分钟内 ATP 几乎耗竭（图 9A）。

神经元和星形胶质细胞的FRET分析；比值及对化学性缺血的反应、显微镜图像、图表结果。
图9：代表性实验，展示神经元和星形胶质细胞中ATP水平的变化。（A、B）：左侧图像显示来自海马CA1区脑片中神经元和星形胶质细胞的ATeam荧光信号。右侧曲线表示从单个细胞胞体区域（ROI）获得的ATeam FRET比值的时间序列记录。在两个实验中，脑片首先暴露于细胞外钾离子浓度升高环境持续3分钟（见图中横条），随后最终接受化学性缺血处理。请注意，神经元对细胞外钾离子浓度升高无反应（A），而星形胶质细胞则表现出ATP水平上升（B）。请点击此处查看该图的放大版本。

相同的实验方案在表达ATeam1.03的脑片中进行YEMK 在星形胶质细胞中表达。与在神经元中观察到的结果相反，星形胶质细胞对外界钾离子浓度升高的反应表现为ATeam FRET比率可逆性升高，提示细胞内ATP水平上升（n = 70个细胞，N = 5个脑片）图9B）。随后暴露于化学性缺血环境后，ATeam FRET比率显著下降，表明细胞内ATP几乎耗尽，该结果符合预期。图9B).

讨论

在此，我们演示了一种在小鼠脑组织切片培养物中的星形胶质细胞或神经元内，实现ATeam1.03YEMK（一种基于FRET的遗传编码纳米传感器14）细胞类型特异性表达的实验方法，用于检测ATP水平的变化15。在代表性记录中，我们显示，细胞外钾离子浓度的升高不会引起神经元内ATP浓度的变化，而星形胶质细胞的ATP水平则对此刺激产生上升反应。此外，我们的结果表明，在抑制细胞代谢后，ATeam1.03YEMK的FRET比值在两种细胞类型中均迅速下降，提示细胞内ATP水平快速降低。

在器官型脑片培养物中表达 ATeam1.03YEMK 需要在受控条件下维持组织培养至少 7–10 天。此外，ATeam1.03YEMK 也可用于急性分离的小鼠脑组织切片和视神经中 ATP 的检测13,15。然而，对急性分离组织的检测需要构建转基因动物或通过立体定位向脑内注射病毒载体，涉及动物实验及严格的动物护理规程。在这方面，器官型脑片培养物中表达 ATeam1.03YEMK 是一种有效且有价值的替代方法22,23。多年来，器官型脑片培养物已被确立为研究神经特性、连接性和发育的成熟模型系统24,25,26。它们不仅保留了组织的一般结构和层状排列（图 1），还具备细胞培养的优势特性，例如更高的可及性以及对实验条件的直接控制。器官型脑片培养物也常用于通过病毒载体表达外源基因27。已有多种类型的病毒载体被报道可用于向脑组织递送转基因16,28。腺病毒载体可在胶质细胞中诱导高水平表达，但在海马神经元中表达效果不佳16，并可能引发胶质细胞反应性17。而本研究中使用的腺相关病毒载体则是一种良好的替代选择15，其在体内的有效性也已得到证实29。

尽管器官型脑片培养物主要用于神经元特性的研究，但近期研究表明，它们也可用于星形胶质细胞的分析。培养的脑片通常被一层反应性星形胶质细胞覆盖19,30（图5），但在更深层中，星形胶质细胞表现出更接近天然状态的非反应性形态和细胞构筑19,30（图5）。在本研究中，我们描述了一种机械去除外层胶质瘢痕的方法，该操作可提高对器官型组织深层中天然星形胶质细胞进行实验操作和光学观测的可及性。此外，去除胶质瘢痕还能提升病毒在器官型脑片深层区域的转导效率；若不去除该瘢痕，腺相关病毒（AAVs）的转导可能主要局限于浅层细胞层。

在进行组织切片实验时，需要考虑多种外部机械因素。灌流速度的变化可能引起整个样本的移动和/或导致焦距变化，从而造成传感器信号出现人为的瞬时改变。此外，已有报道表明，星形胶质细胞和神经元均可对机械形变产生反应，例如高灌流速率所引起的形变32,33。在我们的实验条件下，使用可靠的蠕动泵，并保持组织与物镜之间盐溶液的体积较小且稳定（弯月面），可在本研究所用灌流速度下（1.5–2.5 mL/min；图8）获得稳定的FRET信号。

在本研究中，我们还证明了基于FRET的成像技术结合ATeam1.03YEMK可用于监测神经元和星形胶质细胞中的ATP水平。此前已提出一种替代方法用于细胞ATP测定，即所谓的荧光素-荧光素酶检测法34,35,36,37。然而，该方法基于生物发光成像，由于背景噪声水平较高，仅能提供较低的时间和空间分辨率。近年来另一种常规使用的方法是利用离子敏感型荧光探针镁绿（magnesium green）对细胞内镁离子浓度变化进行成像38,39,40。该方法依据的原理是ATP消耗会释放其辅因子镁离子。因此，使用镁绿成像仅能间接估算ATP水平的变化。此外，镁绿对细胞内钙离子浓度变化也具有敏感性，这在解读该方法所得结果时引入了另一重困难。

因此，近年来开发出的用于直接成像细胞代谢物的基因编码纳米传感器代表了重大进展11,12。已研发出多种不同的传感器，可用于细胞内ATP的检测36,41,42,43。其中包括比值型荧光ATP指示剂"QUEEN"41，以及可感知ATP:ADP比值的PercevalHR42。尽管后者是研究细胞能量状态的有力工具，但其应用需要同时检测pH的变化42。

ATeam 是一种纳米传感器，存在多种变体，这些变体在对 ATP 的结合亲和力方面有所不同14。在体外实验中，ATeam1.03YEMK 在 37 °C 时的 Kd 值为 1.2 mM，接近在不同类型的神经元细胞中测定的细胞内 ATP 水平，这些细胞包括下丘脑和小脑34以及海马体37,44,45。在比色皿测量中，将温度降低 10 °C 会导致 ATeam1.03YEMK 与 ATP 的结合亲和力显著下降，这表明该传感器在室温下进行细胞成像可能并不理想14。然而，我们先前的研究15表明，ATeam1.03YEMK 在神经元和星形胶质细胞中表达后，对各种干预的响应行为在接近生理温度和室温条件下相似，说明该传感器在两种条件下均可可靠地测定细胞内 ATP 水平。此外，我们之前的实验还探讨了细胞内表达的 ATeam1.03YEMK 对 pH 的敏感性15，结果显示其对细胞内 pH 变化约 0.1–0.2 个 pH 单位不敏感。如果低 mM 范围内的 Kd 值存在问题，可选用其他 ATeam 变体14，其中包括红移的 ATeam 变体（"GO-ATeam"）43。

我们使用 ATeam1.03YEMK 的实验表明，细胞外钾离子浓度仅升高数毫摩尔（从 3 mM 升至 8 mM）即可在脑片培养中的星形胶质细胞内引起 ATeam1.03YEMK 比值的短暂上升。该观察结果证实了先前的研究15,46，并明确表明星形胶质细胞会响应活跃神经元释放的钾离子而增加其 ATP 生成，这很可能是由于 Na+/K+-ATP 酶和 Na+/HCO3- 共转运体分别受到刺激所致47,48。与此相反，神经元未表现出响应，这也与以往的研究结果一致15。然而，这两种细胞类型均对细胞糖酵解和线粒体呼吸的抑制表现出快速而强烈的反应，这与先前报道相符15。在化学性缺血条件下，ATeam 的 FRET 比值下降至一个新的稳定水平，表明细胞内 ATP 出现显著耗竭。后一结果提示，即使在无突触激活或神经递质施加等额外刺激的稳态条件下，神经元和星形胶质细胞均存在显著的 ATP 消耗。综上所述，我们认为，基于 FRET 的成像技术结合基因编码的纳米传感器（包括 ATeam1.03YEMK）将为阐明不同条件下细胞内 ATP 水平变化及细胞 ATP 消耗所涉及的细胞过程提供一种有价值的手段。

披露

作者声明无竞争利益。作者获得了德国杜塞尔多夫尼康显微镜解决方案公司（Nikon Microscope Solutions）的财务支持，以实现本视频文章的开放获取出版，该公司生产了本文所用视频中涉及的仪器。但该公司未参与本文所述实验的设计、实施、数据处理，也未参与手稿的撰写。

致谢

作者谨此感谢Claudia Roderigo和Simone Durry提供的专业技术支持。感谢Niklas J. Gerkau博士和Joel Nelson理学硕士在制备器官型脑片培养过程中的协助。作者实验室的研究工作由德国研究基金会（DFG；FOR 2795：Ro 2327/13-1 和 SPP 1757：Ro 2327/8-2，资助CRR；SPP 1757：青年胶质细胞启动资金，资助RL）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-脱氧葡萄糖Alfa AesarL07338不可代谢的葡萄糖类似物
36-IMA-410-019 氩离子激光器Melles Griot波长为488 nm的氩离子激光器
抗坏血酸Carl Roth3525.1抗氧化剂，维生素C
带通滤光片 483/32AHF Analysentechnik AG分光器兼容的发射滤光片
带通滤光片 542/27AHF Analysentechnik AG分光器兼容的发射滤光片
分光镜 T 455 LPAHF Analysentechnik AG激发用二向色镜
分光镜 T 505 LPXRAHF Analysentechnik AG分光用二向色镜
共聚焦激光扫描显微镜 C1Nikon Microscope Solutions模块化共聚焦显微镜系统 C1
数据处理软件 Origin Pro 9.0.0 (64位)OriginLab corporation科学绘图与数据分析软件
D-葡萄糖一水合物Caelo2580-1kg
DPBSGIBCO/Life14190250杜氏磷酸盐缓冲液
Eclipse E 600FN 正置显微镜Nikon Microscope Solutions
Eclipse FN1 正置显微镜Nikon Microscope Solutions
实验腔室定制用于活细胞成像的灌流腔室
EZ-C1 Silver Version 3.91Nikon Microscope Solutions共聚焦显微镜成像软件
Hanks' 平衡盐溶液Sigma-AldrichH9394含酚红用于pH监测
HERAcell 150Thermo ScientificCO2 培养箱 HERAcell ® 150，带去污染程序
HERAsafe KS/KSPThermo Scientific安全柜
马血清GIBCO/Life26050088热灭活
Huygens ProfessionalSVI Imaging去卷积软件
Image J 1.52iWayne Rasban 国家卫生研究院公共领域可用的图像处理软件
胰岛素Sigma-AldrichI6634牛胰腺来源胰岛素
IP系列蠕动泵Ismatec高精度多通道泵
排版软件 Illustrator CS6Adobe矢量图形编辑器
L-谷氨酰胺GIBCO/Life25030024
Microm HM 650 VThermo Scientific振动切片机。Thermo Scientific目前已停止该设备的生产。任何其他适用于活体组织切片的切片机或组织切块器也可使用。
显微镜载物台定制
Microsoft Excel 16Microsoft用于基础数据处理的电子表格软件
Millicell 培养插件Merck MilliporePICM0RG50亲水性聚四氟乙烯（PTFE），孔径 0.4 μm
最低必需培养基 EagleSigma-AldrichM7278合成细胞培养基
单色仪 Polychrome VThermo Scientific/FEI超快速切换单色仪
NaN3（叠氮化钠）Sigma-AldrichS-8032线粒体抑制剂（复合体IV抑制剂）。注意：叠氮化物有毒，避免误食或吸入，并防止经皮肤吸收。
Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M ∞/0 WD 2.0Nikon Microscope Solutions水浸式显微镜物镜
NIS Elements 4.50 advanced ResearchNikon Microscope Solutions成像软件。用于FRET成像的升级版本
ORCA-Flash4.0Hamamatsu Photonics数字CMOS相机
灌流管路Pro Liquid GmbHTygon管路，1.52 × 322 mm（内径：0.85）
Photoshop CS6 版本 13.0Adobe图像处理软件
钠-L-乳酸盐Sigma-Aldrich71718-10G
ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A)ETH Zürichv244单链AAV载体，在人突触素1启动子片段hSyn1控制下诱导表达ATeam1.03YEMK。
ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A)ETH Zürichv307单链AAV载体，在人胶质纤维酸性蛋白启动子片段ABC1D控制下诱导表达ATeam1.03YEMK。
WVIEW GEMINI 光学系统Hamamatsu Photonics发射光图像分光器

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ATP FRET AAV

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