方法文章

Abbiategrasso脑库衰老大脑采集、处理与表征操作规程

DOI：

10.3791/60296

⸱

2020年6月3日

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1Department of Neurology and Neuropathology, Golgi-Cenci Foundation, 2Laboratory of Neurobiology and Neurogenetic, Golgi-Cenci Foundation, 3Department of Neuropsychology and Social Sciences, Golgi-Cenci Foundation, 4Department of Rehabilitation, ASP Golgi-Redaelli Geriatric Hospital, 5Genomic and Post-Genomic Center, IRCCS Mondino Foundation, 6Department of Brain and Behavioral Sciences, University of Pavia, 7Department of Pathology, ASP Golgi-Redaelli Geriatric Hospital, 8Department of Neurological Science, IRCCS Mondino Foundation, University of Pavia

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了一种通过脑组织捐献项目及对脑组织进行适当表征来追踪个体脑衰老轨迹的方法。脑捐献者参与了一项长期纵向研究，包括系列多维度评估。本方案包含脑组织处理的详细描述以及准确的诊断方法学。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在人口持续老龄化的背景下，神经退行性疾病的患病率预计会上升。了解疾病机制是寻找预防和治疗方法的关键。实现这一目标最有效的方式是直接检查患病和健康的脑组织。作者介绍了一种方案，用于获取、处理、鉴定和储存来自生前脑组织捐献项目登记个体所捐赠的高质量脑组织。该捐献项目包括以共情方式与个体进行面对面沟通，收集补充性的临床、生物学、社会和生活方式信息，并通过长期连续的多维度评估，追踪个体在正常衰老和认知衰退过程中的变化轨迹。由于许多神经系统疾病具有不对称性，本脑库提供了一种独特的鲜组织切片方案：将大脑两半球的脑组织切片交替进行冷冻（-80 °C）或福尔马林固定；一侧半球的固定切片与另一侧半球的冷冻切片相对应。通过该方法，可对所有冷冻样本进行完整的组织病理学表征，同时可在组织病理学明确界定的双侧半球组织上开展组学研究，从而更全面地评估神经退行性疾病的发病机制。这些疾病的准确且确定的诊断，只有在结合临床综合征与神经病理学评估的基础上才能实现，而神经病理学评估往往能提供解释发病机制所必需的重要病因学线索。该方法可能存在耗时、成本较高以及地理覆盖范围有限等局限性。尽管如此，其所提供的高度表征数据仍具有重要价值。我们的最终目标是建立意大利首个脑库，同时强调经神经病理学验证的流行病学研究的重要性。

引言

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根据世界卫生组织（WHO）的数据，目前约有5000万人患有痴呆症，这一数字预计到2050年将增至三倍。阿尔茨海默病是导致痴呆的主要原因，其次是脑血管疾病及其他与年龄相关的神经退行性疾病。2017年，世界卫生组织建立了全球痴呆观察站，旨在提高公众对痴呆症的认识，并推动制定全球应对痴呆的行动计划1。每个人的大脑衰老轨迹各不相同，因此由于神经退行性疾病发病机制的复杂性，寻找治愈方法具有挑战性。也许，每个人的脑组织中都记录着独特的发病机制，需要采取个体化的研究策略。因此，对脑组织的研究将是理解神经退行机制的关键。

回顾神经科学的历史，我们意识到，最令人印象深刻且具有突破性的发现，无一不是基于对人脑的直接研究。随着时间推移，用于研究的脑组织来源已从早期粗糙的解剖、偶然的“意外获取”，甚至在某些情况下的非法交易，逐步发展为有组织的脑组织库以及现代战略性脑库。对诸多伦理问题的考量，是现代脑库区别于过去脑组织收藏的主要因素之一。真正意义上的首批现代脑库（BBs）建立于20世纪下半叶th 世纪。尼古拉斯·科塞尔利斯（Nicholas Corsellis）和华莱士·图尔泰洛特（Wallace Tourtelotte）可被视为现代脑库事业的先驱。在英国，科塞尔利斯建立了一个收藏量超过1000例大脑的样本库，这些大脑均患有各种精神和神经系统疾病，且病例资料详实。2此外，Corsellis 帮助揭示了为进行生化检测而将新鲜脑组织保存在冰中的必要性。3与此同时，在美国，Wallace Tourtelotte 推出了生前脑组织捐献计划，以促进潜在脑组织捐献者的招募，并确保所收集的脑组织附有完整的医学和神经学病史记录。4,5。有关脑库的历史概述及现代脑库的更多信息，参见 Carlos 等6.

那么，我们为何仍需要人脑研究？脑部疾病的明确诊断唯有通过神经病理学检查才能确定。神经病理学能够验证临床诊断的准确性，是正确解读临床症状以及发现新综合征亚型组织学基础的关键。事实上，诊断往往需依据病理表现重新界定。然而，由于近年来神经影像技术的创新发展，尸检率在过去几十年中持续下降。借助脑成像技术，可评估大脑中的形态学、功能及代谢改变，以及蛋白质错误折叠的程度。 体内。然而， 体内 神经影像学及其他生物标志物研究只能提供病理状况的“估计”，因为它们无法检测到细微的细胞和分子变化。分子影像学的进步以及新生物标志物、靶分子和示踪剂的发现7 （例如淀粉样蛋白、TAU、小胶质细胞示踪剂）使得人脑在解读临床评估和生物标志物检测所获得的数据方面变得更加不可或缺。此外，对新鲜和冷冻脑组织进行的组学技术（基因组学、表观基因组学、转录组学、代谢组学、蛋白质组学、脂质组学等）为理解疾病机制以及发现风险基因、新型诊断和预后标志物及潜在药物靶点开辟了新的可能性8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.

出于这些目的，现代脑库（BBs）保存了特征明确、高质量的脑组织，并向科学界提供这些资源3,24。脑库所提供的脑组织应附有完整的临床病史。脑库的运作包括以下内容：（1）识别并招募患有疾病和健康的个体加入脑组织捐献计划；理想情况下，应对捐献者进行终身多学科随访，以获取完整的临床资料、生活方式与社会背景信息以及生物标志物谱型；事实上，认知储备和脑结构受生活方式及社会教育因素的影响25,26，因此这些信息能够丰富现有的整体数据。（2）在捐献者去世后，依照标准化的法律和伦理规范，获取脑组织（包括大脑、小脑和脑干）及相关组织（如脊髓、颅神经和神经节等）。（3）根据标准化的操作规程，对脑组织进行适当的处理（如解剖、固定、冷冻），以获得高质量的组织样本，并确保其可用于未来的多学科研究。（4）进行详细的神经病理学表征，提供最终的确诊诊断。（5）将组织材料储存并向科研社区分发27,28。

所有脑库（BB）均储存冷冻组织和福尔马林固定石蜡包埋组织。每个脑库都有其自身的操作流程。除特定研究外（例如新泽西州生物医学研究所的双半球切片方案29以及Deramecourt关于脑血管病理学的研究30），全球规模较大的脑库通常仅沿中线（矢状面）将大脑、小脑和脑干切开。其中一半组织以新鲜状态解剖后冷冻，用于生化研究；另一半则用福尔马林固定，用于组织病理学评估。因此，生化分析和组织病理学分析分别在两个半球上独立进行。至于哪一侧固定、哪一侧冷冻（侧向性选择），则取决于各个脑库的具体规定31,32,33,34,35。由于许多神经系统疾病具有不对称性，本脑库提供一种独特的鲜脑切片方案：脑干及两侧半球的相邻切片交替进行固定与冷冻处理；一侧半球的固定切片对应另一侧半球的冷冻切片。通过该方法，可最大化利用脑组织，并实现对所有冷冻样本的完整组织学表征，同时能够获取并比较双侧半球各区域的组织学与生化信息。

我们脑库项目的研究范围位于意大利北部米兰市西南约22公里处的小镇阿比亚泰格拉索（Abbiategrasso）。该镇人口约为32,600人，是Golgi-Cenci（GC）基金会所在地。GC基金会隶属于一家大型老年康复医院（ASP Golgi-Redaelli），是一家专注于老龄化研究及老年人照护的机构，尤其致力于研究心理老化过程、影响老化的社会与行为因素，以及与年龄相关的神经认知障碍（NCDs）背后的生物学机制和病理基础。2009年，GC基金会启动了一项新的纵向研究，共纳入1321名参与者（符合条件的1644人中有80.3%响应率），这些参与者均为1935至1939年出生（年龄介于70–75岁之间）、高加索人种，并居住在同一小范围地理区域内。该研究命名为InveCe.Ab（Invecchiamento Cerebrale Abbiategrasso；英文含义：阿比亚泰格拉索脑老化研究，ClinicalTrials.gov, NCT01345110），目前仍在持续进行中。InveCe.Ab旨在建立一个具有最大同质性和最小变异性的队列，以评估痴呆的发病率、患病率及其自然病程，同时分析其可能的危险或保护因素，包括行为、心理社会、临床和生物学变量36。该队列的特征见图1和Table 1。流行病学数据显示，该队列结果与欧洲人群的痴呆趋势一致37,38，且InveCe.Ab参与者具有相似的遗传和环境特征，是研究从正常老化向神经认知障碍演变轨迹的理想模型。事实上，同质性较高的群体所需样本量更小即可达到足够的统计效能。InveCe.Ab的研究方法此前已有报道36，但需特别强调其多维度的研究设计，即通过每2–3年一次的定期随访，采用统一的评估工具，包括：采血（代谢指标、同型半胱氨酸和维生素检测、DNA提取以分析载脂蛋白E（APOE）及其他与认知和老化相关的遗传多态性）、人体测量（体重、身高和腰围）、行走时说话测试（双重任务测试）、生活方式访谈（地中海饮食依从性、体力活动水平和认知参与度）和社会因素评估（社会参与度、孤独感）、神经心理学评估以及临床体格检查。将此类纵向数据与死后神经病理学数据进行比较，对科研具有重要意义。因此，我们的团队，特别是Michela Mangieri博士，提出了上述神经病理学研究方案。自2014年第二次随访起，InveCe.Ab的参与者被邀请捐献大脑，由此促成了阿比亚泰格拉索脑库（ABB）的诞生。ABB的核心捐献者为InveCe.Ab的参与者，但目前也向其他志愿捐献者开放，包括来自ASP Golgi-Redaelli医院的患者（其中许多患有不同类型的神经系统疾病），以及通过了解ABB项目而自愿参与、且来自同一地理区域（阿比亚泰格拉索及其周边地区）的成年志愿者。所有捐献者均接受相同的评估流程。

作者提出了一种方法，用于追踪正常衰老的个体轨迹以及向非传染性疾病（NCDs）可能发展的进程，并对通过纵向随访获得的此类供体脑组织进行准确的管理、处理和特征分析。此外，我们的目标是通过定期的神经学评估、讲座及有关脑健康的教育活动，与个体建立联系并促进其参与，同时提高他们对为科研目的捐献脑组织的认知与意识。

方案

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根据本机构的人类研究伦理委员会和BNE行为准则，ABB依照伦理标准开展活动39,40。脑组织采集程序已提交至帕维亚大学伦理委员会，并在InveCe.Ab研究项目背景下获得批准36。研究程序遵循1964年《赫尔辛基宣言》及其后续修订版所规定的伦理原则。知情同意书内容完整且易于理解。参与捐献项目是一项个人决定，需具备充分的认知和自主意识。若当事人被认为不具备签署知情同意书的能力，则需由其法定监护人或近亲（NOK）提供授权。表2列出了脑组织捐献的纳入与排除标准。本研究在Federazione Alzheimer Italia的监督下进行。

1. 脑捐献项目的招募

  1. 召集有脑组织捐献意愿的受试者及其近亲属（NOK）和/或法定监护人，介绍本项目（捐献项目的范围；脑组织的摘取、保存、使用和分配流程）、随时退出项目的权利、匿名性保护措施以及随访策略。讨论开展额外生物标志物检测和基因检测的可能性，并记录潜在捐献者或其近亲属是否希望获知检测结果的意愿。
  2. 说明所有经济相关事项，包括基金会和捐献者均不会从中获得任何经济利益（脑组织为无偿捐献和 altruistic 分配）。告知对方 ABB 承担遗体运输费用，而丧葬、埋葬或火化费用由家属承担。
  3. 若对方同意参与，则获取其签署的参与捐献项目知情同意书。为捐献者分配一个独立的数字编号，以确保匿名性。记录参与纵向研究者的识别编号，并为脑库提供另一个独立编码，以便清晰区分两类捐献者（是否参与纵向研究；见表3）。
  4. 向捐献者发放一张身份识别卡，声明其捐献者身份，并印有可随时拨打（24/7）的通知脑库其死亡信息的联系电话。

2. 供体评估与连续随访

注意：可以仅对以下部分检查项目同意，而非全部。所有临床评估均由同一团队完成，团队成员包括一名神经科医生、一名具有神经学专长的老年医学专家以及三名心理学家。若出现新的症状或认知功能下降进展，随访的时间间隔可相应缩短。

  1. 与 InveCe.Ab 研究类似，获取生活方式与社会因素问卷，包括自主能力程度（ADL、IADL）、个人习惯、社会及生活方式因素，这些因素可能影响认知功能。收集家族史、既往病史和神经系统病史，内容涵盖遗传性、感染性、中毒性、代谢性、自身免疫性、心血管性、创伤性、变性、肿瘤性及神经系统疾病。收集既往临床检查结果，并列出所有药物治疗方案。
  2. 进行广泛的神经运动功能评估，包括颅神经功能、眼底、视野、肌力与肌张力、感觉功能、腱反射、外感受性反射和原始反射、脑膜征、姿势、步态、运动、协调性、括约肌功能，以及局灶性体征或巴宾斯基征（Babinski sign）的存在情况。评估语言能力、精神状态及行为改变。
  3. 进行广泛的神经认知评估，包括整体认知功能及针对特定认知域的完整神经心理学评估：言语与视觉记忆、注意力、精神运动速度、语言、语义记忆、执行功能和视空间能力（详见表4）。考虑是否存在抑郁症状（采用 CES-D 量表）。
  4. 采集血样，用于血液生化分析（表5）以及DNA、血浆和外周血单个核细胞（PBMC）的分离与保存。进行 APOE 基因分型（rs429358 和 rs7412）（InveCe.Ab 研究参与者已进行更广泛的基因谱分析；见表6）。记录心电图（ECG，评估心脏异常、心房颤动）和静息状态下的定量脑电图（QEEG）。
  5. 可选地进行生物标志物检测，包括脑脊液（CSF）中的 TAU 蛋白、磷酸化 TAU 蛋白和 β-淀粉样蛋白，以及脑部影像学检查（MRI 用于检测体内神经退行性变、缺血或炎症；FDG-PET 用于检测代谢功能障碍；PIB-PET 用于检测与阿尔茨海默病病理生理相关的脑淀粉样变）。
  6. 制定脑捐献者后续随访计划。根据不同年龄组设定随访时间间隔（64 岁及以下：每 10 年一次；65–74 岁：每 3 年一次；75 岁及以上：每 2 年一次）。
  7. 根据 DSM-V 标准确定临床诊断和/或神经认知诊断。采用临床痴呆评定量表（CDR）对痴呆严重程度进行分期。在死亡前最后阶段更新 CDR 评分。
  8. 建立与纸质记录图形相似的数据库。将所有收集的数据录入脑库数据库。安排另一名工作人员进行数据复核，以检查可能存在的错误。

3. 死亡时间与脑组织取出

注意：根据意大利法律，必须有超过 20 分钟的无脉电活动（心电静止）才能确认死亡。持续至少 20 分钟的直线心电图（ECG）记录（称为死亡心电图，thanatography）可允许在死亡后 24 小时内进行尸体解剖（DPR 285/90 第 8 条及 1993 年 12 月 29 日第 578 号法律）。死后时间 <24 小时是保持整体组织质量的良好目标。若死后时间 >30 小时，则取消尸体解剖（见表 2）。尸体解剖团队由一名病理学家、一名神经学家和/或神经生物学家、一名护士、一名解剖室技术人员以及若干实习学生组成；其中前两名成员同时负责神经病理学诊断。在尸体操作与解剖过程中，必须穿戴适当的防护服装（外套、手套、护目镜和发网）。本节中，我们介绍实验室通常使用的主要工具和设备。读者可自行选择所用器械。有关本实验所用材料的详细说明，请参见材料表。

  1. 确保家属选择的殡葬机构将遗体运送至 ABB 设施。进行死亡确认检查，期间必须无心脏活动。若确认无生命体征，则签署死亡证明，并开始解剖程序。
  2. 将遗体转移至解剖室。测量颅骨最宽处的头围。从鼻根至枕外隆凸测量，获得前后径（APD），从一侧耳至另一侧耳的距离为横径（TD）。使用公式计算头指数（CI）：CI = TD/APD × 100。
  3. 使用锋利的手术刀，在冠状面上从一侧乳突尖端向另一侧做头皮切口，经过头顶。切开毛发、皮肤和皮下组织，并小心将头皮两瓣从下方颅骨分离。切口应持续至可见眶上黄色脂肪组织，然后将头皮向前翻起，另一部分向后牵拉。
  4. 使用手术刀和镊子，在两侧各取一小块颞肌组织，一份置于4%甲醛中固定，另一份冷冻保存（见第7节）。
  5. 使用电动锯在额部按V形切口锯开颅骨。取下颅盖，切开脑膜。取硬脑膜组织块，分别进行4%甲醛固定和冷冻保存（见第7节）。
  6. 将20 G 3.5英寸针头穿过胼胝体插入第三脑室，采集约10 mL脑脊液（CSF）。评估脑脊液的外观、颜色和浑浊度，并测定pH值。随后将其分装为约1 mL每份的10份等分试样，于-80 °C保存。
  7. 轻柔牵拉双侧额叶，抬起大脑，切断视神经、漏斗部、颈内动脉（ICA）以及第Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ对脑神经。切开小脑幕以进入后颅窝，切断椎动脉和低位脑神经。将手术刀尽可能深地插入枕骨大孔，切断延髓最尾端部分。此时，轻柔取出整个脑组织。
  8. 用手术刀刺破Meckel腔上方的骨质，从双侧获取三叉神经节（Gasser神经节）。一侧神经节用4%甲醛固定，另一侧冷冻保存（见第7节）。使用外科锤和凿子击碎蝶鞍骨质，取出垂体并用4%甲醛固定。
  9. 检查颅骨和全脑是否存在肉眼可见的异常改变及血管变化。使用卷尺测量脑组织的横径和前后径。小心取下Willis环，并进行大体观察（图2E），评估是否存在解剖变异、病变或血管狭窄。
  10. 从大脑凸面取1–2块大小为2–4 cm2的软脑膜组织，置于含20%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素（pen/strep）、1%谷氨酰胺和1%非必需氨基酸的完全高糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中，于4 °C保存（参照既往发表方法并略有修改）41。
    1. 为获得成纤维细胞培养物，将软脑膜组织置于10 cm培养皿中，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗两次，每次弃去液体。
    2. 使用手术刀和移液器吸头将软脑膜组织切成约2–3 mm的小块，每块6孔板预先用0.5%明胶包被，每孔接种3–4块组织，并加入2 mL完全培养基，同时添加1%两性霉素B（所有操作均在生物安全柜中进行，以确保培养无菌）。
    3. 将培养板置于37 °C、5% CO2培养箱中至少培养一周，每3–4天更换一次培养基。当细胞融合度达约70%时，使用无菌1×胰蛋白酶消化细胞。将软脑膜成纤维细胞转移至T75培养瓶，加入12 mL完全培养基。5天后再次胰蛋白酶消化，并用900 μL FBS和100 μL二甲基亚砜（DMSO）保存细胞。
  11. 分离并分别检查大脑、小脑和脑干，称重。取下松果体并用4%甲醛固定。移除嗅球和视神经，每对中任选一侧进行固定或冷冻保存。将大脑、小脑和脑干置于冰上4 °C环境中至少2–4小时，待解剖前使用，以尽量减少组织损伤并降低组织软化程度。
  12. 取材完成后，应对遗体给予充分尊重与妥善处理。使用强力胶重新粘合颅骨，并用外科缝合针和不可吸收缝线缝合头皮。
  13. 以轻柔操作表达对逝者的尊重与感激。清洁并剃净面部，清洗并吹干头发，因为遗体将被安置于开放棺木中供亲友瞻仰。
    注：遗体复原工作由技术人员完成。本方案可在此处暂停。

4. ABB 解剖方案

注意：同一位病理学家和/或神经学家在通风橱中对脑干、小脑和大脑进行切片。神经生物学家在切片完成后对切片进行排列。一名不接触脑组织切片的受训人员负责全程拍照记录，并将照片上传至数据库，以作为后续组织处理阶段的参考指南。

  1. 使用解剖刀沿轴向切开脑干，第一刀在中脑前部水平，穿过上丘，以获得两个暴露黑质（SN）的切片。
  2. 继续进行其余切割，获取厚度为8 mm的脑干切片，共约10个节段。注意包含通过脑桥前部、靠近第四脑室上缘的切面，以便观察蓝斑（LC）；同时包含通过延髓、位于听纹下方且紧邻第四脑室下端尖部的切面，以确保切片中包含迷走神经背核（DMNV）。
  3. 按照从头侧到尾侧的顺序为所有切片命名，以BS（脑干）开头，后接阿拉伯数字以标识各节段。在最后一个脑干切片之后，使用SC（脊髓）作为前缀，后接数字1–n。根据所取脊髓节段的数量，通常可获得约2–4个SC切片（图2H–I）。
  4. 对所有切片交替标记为固定或冷冻保存，并拍摄照片存入影像档案（图2）。随后，按照下文步骤4.7和4.8所述方法对所有切片进行固定和冷冻处理。
  5. 沿矢状面切割小脑，在蚓部水平将两侧小脑半球分离。继续进行矢状切片，从每侧半球各获取5个切片（图2F–G）。
  6. 将来自蚓部的所有切片分别命名为CBR或CBL（分别代表右侧和左侧小脑），并用阿拉伯数字编号以标识各节段。对所有切片交替标记为固定或冷冻保存，并拍照归档（图2）。随后，按照下文所述方法对所有切片进行固定和冷冻处理。
  7. 通过胼胝体将大脑的两个半球分离（图2A–B），并在冠状面上单独进行切片。第一刀应位于视交叉与乳头体之间的平面，穿过额叶、颞极、前扣带回、前连合、Meynert核及基底神经节。
  8. 第二刀在约1 cm后方进行，穿过乳头体，暴露基底神经节、前丘脑、底丘脑和杏仁核。继续切片，将前部与后部区域分开，制成厚度为1 cm的切片，每侧半球可获得15至20个节段。
  9. 将切片平放在平面上，按照其在前后方向上的原始位置依次排列，从额极到枕极，并使与前一切片相连的部分朝上。
  10. 通过比较两侧半球的切片，从每侧交替选取切片用于固定或冷冻保存。确定需固定并用于组织病理学处理的主要切片，包括额叶和颞叶、扣带回、基底神经节、Meynert基底核、杏仁核、丘脑、海马、内嗅皮层、枕颞回、顶叶和枕叶。
  11. 按照前后方向为所有切片命名，以L（左）或R（右）开头，后接阿拉伯数字，并标注该切片是用于固定还是冷冻保存（图2A–D）。为便于识别，拍摄照片存入影像档案。随后，按照第7和第8节所述方法对所有切片进行固定和冷冻处理。

5. 脑组织与血管检查及肉眼宏观病理学评估

  1. 进行一般性肉眼检查，观察脑膜改变、弥漫性或局限性皮质萎缩、海马萎缩、脑室扩大、小脑萎缩、脑干萎缩、黑质苍白、白质改变（注明类型和部位）。
  2. 检查Willis环，评估动脉粥样硬化和闭塞情况。若存在动脉粥样硬化斑块但无超过50%的狭窄，评分为1；若至少有一条动脉闭塞≥50%，评分为2；若两条或更多动脉闭塞≥50%，评分为342。评估其他颅内血管是否存在病变。
  3. 为检测实质血管病变，检查大脑半球、小脑和脑干。考虑腔隙性病灶（直径 < 10 mm）、缺血性或出血性梗死以及出血（直径 > 10 mm）。若存在，需注明病灶大小（毫米）、数量和部位。同时评估是否存在蛛网膜下腔出血。

6. 组织质量控制

注意：濒死期因素评分（Agonal factor score, AFS）范围为0至2，是评估组织质量的重要指标。确定AFS时，需考虑死亡前后发生的临床状况（特别是导致脑组织酸中毒的状况）以及濒死期持续时间（突然死亡或长时间濒死）。若AFS > 1，脑组织可能并非处于最佳质量43。还需考虑脑组织和脑脊液（CSF）pH值；若pH < 6，脑组织可能并非处于最佳质量43,44。

  1. 确认死亡是否由可能损伤脑组织的状况引起，包括缺氧、持续性酸中毒、机械通气、多器官衰竭、高热、严重颅脑外伤、摄入神经毒性物质、严重脱水、严重低血糖、癫痫状态及长时间昏迷。若存在上述任一情况，记1分。
  2. 确认濒死期持续时间（若死亡发生在1小时内为快速，若死亡发生在1至24小时内为中等，若濒死期持续超过1天为缓慢）。若为中等或缓慢死亡，记1分。
  3. 计算AFS评分，并使用电极pH针测量脑脊液pH值，同时使用表面pH计测量各脑叶脑组织切片及小脑切片的组织pH值。

7. 组织冷冻

  1. 将所有待冷冻的组织置于冰上，保持在 4 °C。随后迅速冷冻。将组织放在预冷的铝制托盘上，再用相互锁合的铝板覆盖，以保持组织平整。将其置于 -120 °C 的液氮中 3 分钟。
  2. 将切片放入塑料袋中，并在袋上标注相应的编号代码和切片编号。将塑料袋按三个部分分别放入冻存盒中（分别为右半脑、左半脑和脑干），于 -80 °C 保存。

8. 组织固定

  1. 将切片逐一用纱布包裹，并放入10%磷酸盐缓冲福尔马林溶液中。24小时后，更换为新鲜的福尔马林溶液，随后在4 °C的冷室中继续固定约5天。
  2. 所有切片均保持完整，仅将包含海马和杏仁核的切片分为两部分（图3）。两片的上半部分均包含额叶（图3中的R10a–L9a）；下半部分则分别包含：（1）杏仁核、颞叶和基底神经节（图3B中的L9b），以及（2）海马和部分颞叶（图3A中的R10b）。此操作旨在维持各结构之间的空间关系。
  3. 将所有组织块置于磷酸盐缓冲液中至少2天，以充分洗去并清除交联产物。
    注意：本实验方案可在此处暂停。

9. 脱水、透明、石蜡包埋和切片制备

  1. 配制浓度从70%到100%的梯度乙醇、二甲苯以及两套熔融石蜡。将脑组织切片放入自动组织处理机中进行脱水、透明处理及石蜡浸润（针对大样本（大脑和小脑切片）与小样本（脑干切片及其他小组织样本）采用两种不同的组织处理方案）（表7）。将组织包埋于金属或塑料模具中的石蜡中。
  2. 根据Montine指数选择需切片的区域，以评估所有目标区域的神经病理学特征45（表8），随后对选定区域进行切片。
  3. 大组织切片使用推拉式切片机，小组织切片使用旋转式切片机。苏木精-伊红（H&E）染色切片厚度为5 μm，其他染色及免疫组织化学染色切片厚度为8 μm。将切片分别置于三种不同规格的组织学载玻片上：最大切片使用8.5 cm × 11 cm载玻片，中等大小切片使用5 cm × 7.5 cm载玻片，最小切片使用标准的2.5 cm × 7.5 cm载玻片。
    注意：本方案可在此处暂停。

10. 脱蜡、组织学染色和免疫组织化学（IHC）

  1. 进行脱蜡处理，以使组织能够与水溶性染液发生反应。使用二甲苯及梯度递减的酒精浓度进行脱蜡（每步5分钟）。用蒸馏水再水化5分钟。
  2. 使用以下组织学染色方法评估组织结构和形态学异常以及细胞形态：苏木精-伊红染色（H&E，用于检测血管显微病变和炎症）、焦油紫染色（NISSL，用于检测神经元丢失）、Luxol快蓝染色（LFB，用于检测脱髓鞘）、Gallyas染色（用于检测神经炎性斑块和神经毡细丝）。
  3. 使用免疫组织化学（IHC）以特异性标记目标结构。抗NeuN和抗GFAP抗体用于识别神经元和胶质细胞区室；4G8、AT8、α-SYN和TDP-43用于识别在神经退行性疾病中发生聚集的蛋白质（材料表）。
    1. 将脱蜡切片用3% H2O2预处理10分钟，然后用PBS缓冲液漂洗。对于4G8、α-SYN、TDP-43和NeuN抗原，使用0.01 M pH 6的柠檬酸缓冲液进行抗原修复处理（微波加热程序依次为2分钟、1分钟和2分钟）；对于4G8和α-SYN，使用70%甲酸处理。在5%正常山羊血清中预孵育30分钟。
    2. 在4 °C条件下与一抗孵育过夜。次日，用PBS缓冲液漂洗切片，然后在室温下以1:2的稀释比例加入二抗（Envision+ System-HRP标记聚合物），孵育1小时。
    3. 多次用PBS缓冲液洗涤，随后加入显色系统（液体DAB+底物显色系统）进行孵育，并在显微镜下观察反应进展（放大倍数4–10倍）。最后用PBS缓冲液洗涤切片。用苏木精复染切片，脱水后用DPX封片剂封片。
      注意：表8总结了标准操作流程。所有切片均需进行H&E染色，而特殊/特异性染色和反应仅用于选定切片。特定病例可能需要额外区域或额外反应。材料表列出了IHC所用抗体的详细信息。

11. 神经病理学基本表征

注意：研究非特异性脑组织改变、血管病变、阿尔茨海默病（AD）病理、非AD TAU蛋白病、突触核蛋白病、TAR DNA结合蛋白（TDP-43）病理以及海马病变。使用连接相机的光学显微镜检测实质显微病变。组织病理学评估由一组经过培训的神经病理学专业人员完成，包括一名神经病学教授、一名神经科医生和一名病理学家。该评估基于改良的Montine方法45（表8），并进一步包括：（1）异质性的非AD TAU蛋白病，其为与TAU沉积相关的额颞叶变性（FTLD）的病理特征，包括Pick病、非流利性原发性进行性失语（TAU-nfPPA）、进行性核上性麻痹（PSP）46,47和皮质基底节变性（CBD）48。此外，非AD TAU蛋白病还包括与衰老相关且无明确临床意义的病变，如原发性年龄相关性TAU病变（PART）49、年龄相关性TAU星形胶质细胞病（ARTAG）50和嗜银颗粒病48。（2）路易型突触核蛋白病（LTS），与帕金森病（PD）和路易体痴呆（LBD）相关。为检测LTS，应按以下层级步骤进行：首先检查嗅球、脑干、杏仁核/颞叶皮层；若上述区域呈阳性，则进一步检查边缘结构（海马结构、内嗅皮层、前扣带回）、中额回、下顶小叶和枕叶皮层45。若存在皮层型LBD的临床特征（如波动性认知障碍和/或幻觉），则在第一步即应考虑边缘结构和同型皮层。（3）TDP-43沉积，为与TDP-43沉积相关的额颞叶变性（FTLD）的病理标志，包括行为变异型额颞叶痴呆（bvFTD）、语义性痴呆（SD或svFTD）、TDP-nfPPA以及额颞叶痴呆-运动神经元病（FTD-MND）。TDP-43的免疫组化（IHC）检测应在以下脑区切片上进行：杏仁核、海马、内嗅皮层和中额回；对于临床怀疑为FTLD的病例，建议额外检查其他脑区切片51。

  1. 使用 H&E、NISSL、LFB 以及 GFAP 和 NeuN 的免疫组织化学（IHC）方法，在所选切片中评估非特异性脑组织改变。观察神经元稀疏、气球样神经元、海绵状变性、胶质增生、髓鞘丢失，以及是否存在炎性或肿瘤性浸润，并明确这些改变的主要分布部位。
  2. 为检测显微血管病变，需检查 H&E 和 LFB 染色切片，包括至少两个大脑半球大体切片（第一个通过乳头体（Charcot 切面），涵盖额叶、颞叶、基底节、前丘脑和杏仁核；第二个通过枕叶），海马结构的"膝状体"区域，一个小脑切片，以及脑干的三个主要切面（分别通过黑质、蓝斑和迷走神经背核）。
    1. 检测小血管病，包括小动脉硬化、脂质玻璃样变、血管周围间隙扩张、白质丢失，以及软脑膜和/或实质和/或毛细血管性脑淀粉样血管病。明确分级（0–3）及主要分布部位42,52。注意是否存在含铁血黄素渗漏、微出血和微梗死。
    2. 采用分级的Deramecourt 方案（血管壁改变–小血管病–大体梗死）评估血管损伤对认知功能障碍的贡献程度。评估时应包括额叶和颞叶切片、基底节和海马（评分 0–20）30。同时，通过考虑大脑半球大体梗死及枕叶小血管病（包括中至重度小动脉硬化和淀粉样血管病）来估算脑血管疾病导致认知障碍的可能性，使用VCING 评分（低-中-高）进行判断53。
  3. 使用 IHC（4G8）检测淀粉样蛋白扩散，评估阿尔茨海默病（AD）病理。确定 Thal 分期（1–5）54，进行淀粉样蛋白评分（0–3）45，并按部位描述其形态（弥散型、局灶型、核心型）。
    1. 使用 IHC（AT8）评估 AD Tau 病理，并描述各部位的主要形态特征（神经原纤维缠结、神经突网线、轴索斑）。确定Braak 分期（I–VI +；“+”表示存在超出 Braak 分期体系范围的过度磷酸化 Tau 病理区域）55，并进行综合评分（0–3）45。
    2. 使用 Gallyas 染色评估轴索斑，并进行CERAD 评分（0–3）56。随后，结合Aβ-Braak-CERAD 评分（ABC 评分 0–3）判断神经病理特征对应于临床阿尔茨海默病综合征的可能性：无-低-中-高45。
  4. 使用 AT8 免疫组织化学检测是否存在非 AD 的 TAU 病理，并明确其主要分布部位及特殊形态学表现。观察神经元包涵体，如火焰状或球形缠结、球形-球状包涵体（如 Pick 小体）57、神经突网线、营养不良性轴索、嗜银颗粒；以及胶质细胞包涵体，如束状星形细胞、棘状星形细胞、星形细胞斑、缠绕体、球状包涵体58,59。
  5. 使用 α-syn 免疫组织化学在上述区域检测LTS（路易小体、苍白小体和路易轴索）。若结果为阳性，应用McKeith 分级（0–4）评估病变严重程度60；随后使用Beach 分期（I–IV）评估其拓扑分布（嗅球、脑干为主、边缘系统为主、新皮层）61。比较 Beach 分期与 Braak 分期，以明确路易体病（LBD）与 AD 病理之间的关系60,61,62。
  6. 注意是否存在胶质细胞质包涵体（GCI；非路易体型胶质α-突触核蛋白病），这是多系统萎缩（MSA）的病理标志，并明确其主要分布部位63。
  7. 使用 TDP-43 免疫组织化学在上述区域检测TDP-43 沉积。识别各部位的主要形态：神经元胞质包涵体（NCIs）、营养不良性轴索包涵体（DNs）、核内包涵体（NIIs）。确定其分布模式：A 型（以 NCIs 和 DNs 为主：见于行为变异型额颞叶痴呆 bvFTD 和非流利性原发性进行性失语 nfPPA）；B 型（以 NCIs 为主：见于额颞叶变性-运动神经元病 FTD-MND）；C 型（以长段 DNs 为主：见于语义性原发性进行性失语 svPPA 和 bvFTD）51,64。使用 Nelson 分级方案判断 AD 病例中是否存在 TDP-43 病理65,66。
  8. 从下托和 Sommer 区（CA1）开始评估海马。使用 Rauramaa 评分（0–4）：1–2 分分别对应微梗死和大梗死；3–4 分分别对应中度和重度神经元丢失及海马萎缩（海马硬化：HS）。指出是否存在病理蛋白沉积（按发生频率递减顺序：pTAU、TDP-43、α-syn）67。
  9. 确定神经病理学诊断，并将所有病理数据录入数据库。
    注：存放供体生物材料和敏感信息的房间始终上锁，仅限授权人员进入，以确保安全与隐私。冷冻生物材料保存在 -80 °C 的上锁冰箱中，而福尔马林固定石蜡包埋的组织则存放在室温下的上锁柜中。使用双压缩机冰箱，并配备备用冰箱。此外，为确保冰箱持续运行，配备了 24/7 监控系统，一旦异常即触发警报。还设有应急发电机，以防断电。参与者以数字编码匿名化处理，以保护其隐私；非授权人员无法追溯供体身份及其敏感信息。所有信息均存储于密码保护的数据库中；同时，纸质版数据也保存在上锁的档案柜中。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脑捐献者及脑组织采集数据
2014年，在InveCe.Ab研究的第二次随访期间启动了捐献者招募工作，共纳入1061名符合条件的受试者中的1010名（应答率为93%；图1）。在InveCe.Ab纵向研究的参与者中，有290人（占1010人的28.7%）同意登记成为脑捐献者（其中160人已正式登记，130人表达了登记意愿）。捐献者的教育水平高于非捐献者（本研究中66%的捐献者具有中等及以上教育水平：接受学校教育8年或以上），表明文化和教育的重要性。许多“健康”个体也对脑捐献项目表现出兴趣。我们的多数“对照”参与者表示，他们能够理解神经系统疾病患者及其家属的处境，并希望以某种方式为推动相关研究、增进对神经系统疾病的认识作出贡献。生前定期参与献血或骨髓捐献的人群，以及已同意死后捐献器官的人群，更易于接受脑捐献的理念。他们意识到，尽管没有直接的活体受者，但他们的捐献对科学研究具有重要意义。另一个促进脑捐献的因素是倾向于选择火葬。目前，ABB脑库的捐献者总数为427人（包括290名InveCe.Ab研究参与者和137名来自ASP Golgi-Redaelli老年病医院的志愿者或患者），其中75%年龄在70岁或以上。女性占明显多数（64%），且约85%为认知功能完好的老年人。截至目前，在40名已故捐献者中，已有27例完成了脑组织采集（尸检率为67%）；13例未进行尸检，原因包括未向ABB报告死亡信息、严重外伤导致脑组织破坏、存在危险性传染性疾病以及1例克雅病（CJD）病例；另有4例捐献者生前撤销了捐献同意。迄今为止，已采集的27例脑组织中，有24例已完成全面的神经病理学评估，并获得明确的临床-病理诊断，其余3例仍在分析中（表3）。ABB提供的其他脑组织采集数据包括：死亡时平均年龄（81岁）；平均死后间隔时间（10.37小时）；脑脊液平均pH值（6.64）；组织平均pH值（6.07）；平均脑重量（1012.86克）；90%的已故个体脑组织自溶评分（AFS）为1级。

神经生理学生物标志物（定量脑电图，QEEG）
定量脑电图（QEEG）是多维研究方法的一部分。它是一种简单、无创且经济的方法，有可能用于检测轻度神经认知障碍（mild-NCD 或轻度认知障碍，MCI）向重度神经认知障碍（major-NCD 或痴呆）的转化。在整个多维研究流程中，均会进行常规QEEG检查，并评估其作为痴呆生物标志物的潜在作用。我们对初步纳入的36例脑组织捐献者（18例正常老年人[NOLD]、11例轻度-NCD和7例重度-NCD；其中9例具有明确的神经病理学诊断）的研究数据显示，重度-NCD组的α节律平均百分比显著低于轻度-NCD组（p: 0.002）和正常老年人组（p: 0.033）。相反，重度-NCD组的较慢脑电频率（theta/delta）显著高于正常老年人组和轻度-NCD组（见图4中的示例病例）。在我们的研究队列中，脑电节律分布能够区分正常老年人/轻度-NCD个体与重度-NCD患者，且不受病因学诊断的影响，提示脑节律受神经退行性病变负荷的影响，而与病变类型无关。事实上，9例经检查的脑组织中有7例显示痴呆由多种混合性病理所致。由此可见，脑电节律对病理性质的特异性较低，其变化更可能受病变负荷及其解剖分布的影响，而非其分子本质（Poloni 等，AD/PD 2019 大会论文集，里斯本，数据未发表）。

典型病例
在某些情况和条件下，ABB 方案可能具有实用性和必要性。例如存在不对称性病变时（图5）。我们的方案非常适用于此类病变的识别与准确表征。迄今为止，我们已观察了4例具有不对称受累的脑组织，其中部分病例如 图5 所示。肉眼观察可见，其中一例表现为右侧萎缩（图5A），在冠状切面上，右侧脑室显著扩张，而左侧则相对较轻（图5C 与 图5B 对比）。另一例显示右侧半球梗死（图5D），还有一例显示右侧乳头体明显萎缩（图5E）。在显微镜下，一例额颞叶变性（FTLD）病例显示TDP-43阳性呈不对称分布，右侧额叶的染色强度明显高于左侧（图5F,G）。

大体切片（图6A,C）用于获得整体观。LFB染色有助于识别髓鞘丢失（图6D），而针对4G8和AT8的免疫组化染色（图6B）可肉眼评估半球内免疫反应性的分布情况。在ABB系列中，可获取相关个体的脑组织进行比较。

在图7中，将同卵双胞胎脑组织切片的显微图像并列放置，以便于比较（双胞胎1（BB137）：图7A,C,E,G,I,K 对比 双胞胎2（BB138）：图7B,D,F,H,J,L）。与之前一项类似研究68一样，通过对两位双胞胎进行临床和神经病理学评估来进行比较。两位双胞胎均被诊断为由多种病因导致的主要神经认知障碍（major-NCD），但分别在83岁（痴呆发病年龄为72岁）和85岁（痴呆发病年龄为76岁）时去世，相隔两年。他们的脑组织表现出非常相似的神经病理学特征，均具有严重的阿尔茨海默病（AD）病理改变，并伴有淀粉样血管病。4G8免疫反应性广泛分布于皮层（图7A,B）和基底节（图7C,D），可见弥散性、致密性和核心斑块。在皮层和小脑的实质及软脑膜血管中也明显可见（图7A,B,G–J）。在更高倍镜下观察，毛细血管CAA（capCAA）表现清晰（图7G,H）。AT8免疫阳性斑块、神经原纤维缠结和细丝在两个大脑的顶叶皮层中均呈弥散分布（图7E,F,L）。就淀粉样蛋白和神经原纤维缠结（NFT）病理负荷而言，双胞胎1属于Thal 3期（montine A2）和Braak 5期（montine B3），而双胞胎2属于Thal 5期（montine A3）和Braak 6期（montine B3）。两人受教育年限相同，生活方式相似；然而，其中一人（BB137）曾结婚并在不久后丧偶，另一人则未婚（BB138）。他们在疾病起始和病程相同的情况下，表现出不同程度的临床-病理变异，但发生在不同的时间框架内。这证实了尽管遗传因素在疾病发展中起关键作用，表观遗传和环境因素在决定轻微不同的临床表现方面同样至关重要。

在某些情况下，临床表现与神经病理学特征并不一致。在图8中，两个病例在临床上被诊断为阿尔茨海默病（AD）；但神经病理学分析显示，除具有中等程度的AD病理改变外，还存在α-突触核蛋白（α-syn）的弥漫性阳性表达。在第一个病例中，严重的路易体病累及颞叶（LTS，Beach IV级）表现为路易小体均匀分布于扣带回（图8A），并在黑质（SN）中表现为被神经黑色素包围的胞质包涵体（图8B,C）。在第二个病例中，路易小体伴随路易神经突起在杏仁核中呈弥漫性分布（图8D,E），并在Meynert核中亦可见类似表现（图8F,G），提示为边缘型LTS诊断。事实上，病变的解剖分布位置而非其分子特性决定了临床表现。

InveCe.Ab study participant flowchart 2010-2018, showing response and eligibility data over four waves.
图1：Inve.Ce.Ab 研究的流程图。 基线时，痴呆的总体患病率为3%。在随访过程中，患病率分别为：4.4%（1st)69, 7.1% (2nd), 10.9% (3rd）。八年发病率为15例/千人/年（95%置信区间：13–18例/千人/年）。供体招募始于2014年（第二次随访期间）。 请点击此处以查看此图的放大版本。

大脑解剖分析：脑切片、血管结构、用于解剖学研究的标记样本。
图 2：大脑（A）、小脑（F）和脑干（H）的解剖流程。 威利斯环和单侧半球分别显示于（E）和（B）。右侧（C）和左侧（D）的冠状切面已编号，并交替进行固定（“F”）和冷冻（“C”）。图中还展示了小脑的矢状切面（G）和脑干的轴向切面（I）。请点击此处查看此图的放大版本。

脑切片比较，人脑切片示意图，突出解剖学差异。
图 3：显示固定的右侧（A）和左侧（B）额颞叶的冠状切片。
在右侧切片中，海马体和颞叶（A，R10b）与额叶（A，R10a）分离。在对侧切片中，杏仁核和基底神经节（B，L9b）与额叶（B，L9a）分离。比例尺：1.7 cm。请点击此处查看该图的放大版本。

相对光谱功率分布图；脑电图频率分析，从δ波到β波的比较。
图4：非痴呆性轻度认知障碍（NOLD）与主要神经认知障碍（major-NCD）受试者的相对光谱功率分布。 请点击此处查看该图的放大版本。

脑解剖；断层解剖学分析；用于组织病理学研究的标记组织切片。
图 5：非对称性病理的代表性图像。（A）第一例：右侧脑萎缩。冠状面切片（B）和（C）显示右侧脑室扩张，尤其在第10–12节段中更为明显（C，箭头所示）。在切片（B）和（C）中，“F”表示固定组织，“C”表示冷冻组织（意大利语：congelato）。（D）第二例：右侧大脑半球严重梗死。（E）第三例：右侧乳头体萎缩（箭头所示）。（F、G）第四例：显微图像显示，在额颞叶痴呆病例中，右侧额叶皮层的TDP-43免疫反应性（G）较左侧（F）更强。比例尺：183 µm（F, G）。请点击此处查看该图的放大版本。

脑组织切片的组织学分析，染色切片 A-D，突出显示结构差异和病理变化。
图 6：大体切片。（A, C）固定的额颞叶冠状切面（A）和新鲜的顶叶切面（C）。（B）用 AT8 抗体进行免疫标记的额颞叶组织切片。免疫反应性明显分布于整个皮层，但在颞叶中更为强烈。（D）用 LFB 染色的顶叶组织切片。箭头指示白质脱髓鞘区域。比例尺：1.55 cm（B, D）。请点击此处查看该图的放大版本。

显示蛋白质分布的组织学图版；用于研究的免疫组织化学分析。
图7：同卵双胞胎。 两名纯合子双胞胎（BB137 [A, C, E, G, I, K] 和 BB138 [B, D, F, H, J, L]）脑组织的比较。神经病理学图像非常相似。（A）和（B）显示枕叶中弥漫性4G8阳性染色，伴有淀粉样斑块以及软脑膜（箭头）和实质（箭头指示）血管的沉积。毛细血管淀粉样血管病（星号）在更高倍镜下清晰可见（G）和（H）。4G8在基底神经节中呈弥漫性分布（C, D），并在小脑软脑膜血管周围可见（I，J：箭头）。AT8免疫反应性标记出顶叶皮层中的神经原纤维缠结、神经纤维丝和斑块（箭头）（E, F）。Gallyas染色（K）显示神经炎性斑块，结果与AT8抗体染色（L）一致。比例尺：470 µm（A–F；I–J）；90 µm（G–H；K–L）。请点击此处查看该图的放大版本。

免疫组织化学研究中显示脑组织炎症及细胞标志物的组织病理学示意图。
图8：临床诊断与神经病理学诊断的比较。 本图展示了两个神经病理学诊断与临床诊断不一致的病例。α-syn 免疫反应阳性为意外发现。(A–C) 第一例：扣带回（A）显示黑质（SN）中路易小体呈均匀分布（B-箭头）。在黑质的一个神经元中可见被神经黑色素包围的双路易小体（C）。(D–G) 第二例：杏仁核（D, E）和 Meynert 核（F, G）中可检测到弥漫性的 α-syn 阳性表达。细胞体和路易神经突（星号）染色清晰。比例尺：154 µm（A, D, F）；37 µm（B, E, G）；20 µm（C）。 请点击此处查看该图的放大版本。

生物材料申请表模板，包含申请人研究详情和发表指南。
图9：转让协议模板。 请点击此处查看此图的放大版本。

n%
性别男性60745.9
女性71454.1
出生队列193523617.8
193621916.6
193726420.0
193830523.1
193929722.5
婚姻状况已婚87266.1
同居131.0
分居/离异292.2
丧偶32524.6
单身806.1
主要职业体力劳动者66650.6
脑力劳动者45934.9
家庭主妇19114.5
受教育年限≤5年75457.2
>5年56542.8

表1：InveCe.Ab 研究参与者的人口社会学特征。

纳入标准排除标准
所有年满18岁及以上的个体公然拒绝捐赠的人
居住在阿比亚泰格拉索地区的人们居住在伦巴第大区以外的人群
自愿同意的志愿者潜在捐献者与近亲在脑组织捐献意愿上的分歧
无法决定且无亲属同意的受试者严重破坏大脑一致性的状况 
自然原因死亡临床病程 <2年 除非 朊病毒病的可能性 已被排除
由他杀或自杀导致的死亡，需出具验尸官报告
死亡后间隔时间 >30 小时

表2：脑组织捐献的标准。

编号性别BB 编号InveCe 编号年龄受教育年限（年）临床诊断CDRAFS死亡后时间（小时）组织 pH 值脑脊液 pH 值神经病理学诊断
1FBB 37875主要神经认知障碍，由阿尔茨海默病（AD）引起（伴有精神行为症状，BPSD）5229ndndAD 病理严重，小血管病（SVD）中度，TDP43 阳性，皮层路易小体（LTS），海马硬化（HS）
2FBB 105945主要神经认知障碍，由阿尔茨海默病（AD）引起5155.726.78AD 病理严重，小血管病（SVD）轻度，海马硬化（HS）
3FBB 137833主要神经认知障碍，由多种病因引起（AD-血管性痴呆，VaD）5116ndndAD 病理严重，小血管病（SVD）中度，枕叶梗死，脑淀粉样血管病（CAA）-capCAA
4MBB 1817113主要神经认知障碍，由阿尔茨海默病（AD）引起（伴有精神行为症状，BPSD）523ndnd严重路易小体病（LTS，Beach IV 型），AD 病理中等，小血管病（SVD）轻度，微CAA（mCAA）
5MBB 115I 6367818主要神经认知障碍，由阿尔茨海默病（AD）引起516ndndAD 病理中等，小血管病（SVD）中度，炎症，黑质内路易体病（ILBD，Beach IIa 型），海马硬化（HS）
6FBB 23I 65793主要神经认知障碍，由脑血管疾病引起5114ndndCAA 严重且广泛，AD 病理中等
7MBB 102I 412798主要神经认知障碍，由脑血管疾病引起318ndnd血管性痴呆，黑质内路易体病（ILBD）
8MBB 224I 16803主要神经认知障碍，由多种病因引起5111nd5.99小血管病（SVD）中度，AD 病理轻度，黑质内路易体病（ILBD，Beach IIa 型），海马硬化（HS）
9FBB 47785主要神经认知障碍，由多种病因引起（路易体痴呆-LBD，血管性痴呆-VaD，伴有精神行为症状，BPSD）508ndndAD 病理严重，基底节（BG）TAU 病理，老年相关TAU病变（ARTAG），小血管病（SVD）轻度，海马硬化（HS）
10FBB 153I 965795轻度神经认知障碍（死因为结肠癌伴广泛转移）0.518nd6.73AD 病理轻度，基底节（BG）-SVD 中度
11MBB 118I 12117913无神经认知障碍（NOLD，死因为肝癌）023nd6.51小血管病（SVD）中度
12MBB 236I 521803主要神经认知障碍，由阿尔茨海默病（AD）引起（伴有精神行为症状，BPSD）4115nd6.15AD 病理严重，基底节（BG）-SVD 严重（多发微出血），海马硬化（HS）
13FBB 138853主要神经认知障碍，由多种病因引起（AD-VaD，伴有精神行为症状，BPSD）4015nd6.75AD 病理严重，小血管病（SVD）中度，脑淀粉样血管病（CAA），边缘系统 TDP43
14MBB 109I 876798无神经认知障碍（NOLD，死因为脑肿瘤-GBL）0116nd6.4AD 病理轻度，黑质内路易体病（ILBD，Beach IIa 型），小血管病（SVD）轻度
15FBB 271848主要神经认知障碍，由阿尔茨海默病（AD）引起（伴有精神行为症状，BPSD）412nd6.7AD 病理中等，边缘系统路易小体（LTS），基底节（BG）-SVD 中度，微CAA（mCAA），TDP
16FBB 71I 1080798无神经认知障碍（NOLD，死因为心力衰竭）006nd6.26基底节（BG）-SVD 中度，黑质内路易体病（ILBD），淀粉样 TDP，AD 病理轻度
17FBB 189I 858805主要神经认知障碍，由阿尔茨海默病（AD）引起（伴有精神行为症状，BPSD）3020nd6.42AD 病理中等，CAA-capCAA，TDP43，基底节（BG）-SVD 中度，海马硬化（HS）
18FBB 278I 924805主要神经认知障碍，由路易体病（LBD）引起（伴有精神行为症状，BPSD）3156.027.05AD 病理中等，边缘系统路易小体（LTS，Beach IV 型），边缘系统 TDP，海马硬化（HS）
19FBB 2471048主要神经认知障碍，由多种病因引起（可能为混合性病理）3066.487.22TAU 病理（原发性年龄相关性tau病变-PART-ARTAG），海马硬化（HS）
20MBB 85I 198310主要神经认知障碍，由路易体病（LBD）引起（伴有精神行为症状，BPSD）3196.267.3边缘系统路易小体严重，AD 病理中等，小血管病（SVD）中度，CAA-capCAA 严重，海马硬化（HS）
21FBB 14I 222828主要神经认知障碍，由多种病因引起（AD-VaD）21115.596.4AD 病理中等，小血管病（SVD）中度
22FBB 282768主要额颞叶神经认知障碍（非流利性原发性进行性失语，nfPPA，伴有精神行为症状，BPSD）31106.076.39TDP（A型），黑质内路易体病（ILBD），小血管病（SVD）中度，AD 病理轻度，海马硬化（HS）
23FBB 154I 1079805无神经认知障碍（NOLD，死因为癌症伴广泛转移）0156.496.9小血管病（SVD）中度，脑淀粉样血管病（CAA），AD 病理轻度，边缘系统脑炎
24FBB 2906513主要额颞叶神经认知障碍（行为变异型额颞叶痴呆，bvFTD，伴有精神行为症状，BPSD）51125.736.42TDP（A型）
25FBB 210898主要神经认知障碍，由阿尔茨海默病（AD）引起（伴有精神行为症状，BPSD）51155.946.4进行中
26MBB 2937518主要额颞叶神经认知障碍（行为变异型额颞叶痴呆，bvFTD，伴有精神行为症状，BPSD）5186.146.83进行中
27FBB 99I 1370799无神经认知障碍（NOLD，死因为败血性休克）02146.37.12进行中
M/F平均值平均值平均值平均值平均值平均值平均值
0.5817.73.21.010.46.16.6

表3：ABB系列的临床/神经病理学诊断。 BB：脑库；edu (yrs)：受教育年限；CDR：临床痴呆评分（0 = 无痴呆；0.5 = 轻度认知障碍；1 = 轻度痴呆；2 = 中度痴呆；3 = 重度痴呆；4 = 极重度痴呆；5 = 终末期痴呆）；AFS：濒死期因素评分；PM (hrs)：死后小时数；nd：未检测；M/F：男性/女性；BPSD：痴呆的精神行为症状；VaD：血管性痴呆；NOLD：正常老年人；GBL：胶质母细胞瘤；nfPPA：非流利性原发性进行性失语；bvFTD：行为变异型额颞叶痴呆；SVD：小血管病；LTS：路易型突触核蛋白病；HS：海马硬化；CAA：脑淀粉样血管病；capCAA：毛细血管CAA；mCAA：软脑膜CAA；ILBD：偶然性路易小体病；BG：基底节；ARTAG：年龄相关性TAU星形胶质细胞病；PART：原发性年龄相关性TAU蛋白病；amy：杏仁核。

领域测试名称
抑郁流行病学研究中心抑郁量表 (CES-D) [2]
整体认知功能简易精神状态检查 (MMSE) [1]
言语与视觉记忆自由与提示选择性提醒测试 [3]
科西测试 [4]
雷-奥斯泰里思复杂图形 (ROCF) 回忆 [5]
注意力/心理运动速度连线测试 A [6]
注意力矩阵 [4]
语言-语义记忆语义性言语流畅性测试（颜色、动物、水果、城市）[4]
执行功能连线测试 B [6]
瑞文彩色推理测验 [7]
视空间能力画钟测试 (CDT) [8]
雷-奥斯泰里思复杂图形 (ROCF) 临摹 [5]

表4：脑捐献者的神经心理学评估。

代谢物
全血细胞计数
高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇
甘油三酯
葡萄糖
糖化血红蛋白（HbA1c）
同型半胱氨酸
钴胺素（维生素 B12）
叶酸
白蛋白
尿素
肌酐
转氨酶（ALT 和 AST）
γ-谷氨酰转移酶
促甲状腺激素（TSH）
维生素 D（25-羟基维生素 D）
C-反应蛋白（CRP）
电解质

表5：脑捐献者的代谢指标检测面板。

基因名称dbSNP
载脂蛋白E（APOE）rs429358
rs7412
过氧化氢酶（CAT）rs1001179
超氧化物歧化酶2（SOD2）rs4880
血管紧张素原（AGT）rs699
去乙酰化酶2（SIRT2）rs10410544
线粒体外膜转位酶40（TOMM40）rs2075650
桥接整合因子1（BIN1）rs7561528
儿茶酚-O-甲基转移酶（COMT）rs4680
亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）rs1801133
rs1801131
脑源性神经营养因子（BDNF）rs6265
溶质载体家族6成员4（SLC6A4 或 5HTT）5-羟色胺转运体基因连锁多态区（5-HTTLPR）
rs25531

表6：针对InveCe.Ab脑捐献者分析的SNP。

步骤溶液持续时间
大样本小样本
固定10% 缓冲福尔马林4 °C 下 8 天4 °C 下 8 天
洗涤磷酸盐缓冲液室温下 2–15 天室温下 2–15 天
洗涤H2O 洗涤自来水冲洗 2–3 小时自来水冲洗 2–3 小时
脱水70% 乙醇24 小时8 小时
脱水80% 乙醇24 小时4 小时
脱水90% 乙醇60 小时（通常过周末）4 小时
脱水95% 乙醇12 小时4 小时
脱水95% 乙醇12 小时4 小时
脱水100% 乙醇6 小时4 小时
脱水100% 乙醇6 小时4 小时
透明二甲苯 I12 小时10 小时
透明二甲苯 II12 小时10 小时
浸蜡石蜡 I12 小时11 小时
浸蜡石蜡 II12 小时11 小时
包埋石蜡

表7：ABB组织处理方案。

脑区苏木精-伊红 (H&E)克雷斯尔紫 (CRESIL VIOLET)劳-福二氏染色 (LFB)加利亚斯染色 (GALLYAS)4G8AT8α-SYNTDP-43NeuNGFAP
脑干
延髓-迷走神经背核xxx
脑桥-蓝斑xxx
中脑-黑质xxxx
小脑
小脑皮质和齿状核xxxx
大脑
中额回xxxxxxx
基底节 + 梅内尔特核xxxxxx
前扣带回xxxxxxx
杏仁核xxxxxx
丘脑和丘脑下核xx
颞上回和颞中回xxxxxxxxx
海马及内嗅皮质xxxxxxxxxx
顶下小叶xxxxxxx
枕叶皮质xxxxx
嗅球xx

表8：评估区域、染色及免疫组织化学。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

实验方案中的关键步骤
我们的目标是获取、表征并储存来自具有通过纵向观察获得详细病史受试者的高质量组织。为实现这一目标，需重点关注以下关键环节。如上所述，该方案始于供体招募，这是第一个关键步骤。随后，必须确保供体持续参与随访计划，并在项目期间长期保持依从性，直至最终完成脑组织捐献。在供体死亡时，必须立即通知ABB工作人员，以便在24小时内召集尸检团队，这对保证组织质量至关重要。大脑半球的新鲜切片操作需要稳定的手法和专门的培训。为避免因缓慢冷冻导致的细胞损伤，并获得适用于冷冻切片机及组学分析的高质量切片，必须迅速进行冷冻处理。考虑到甲醛溶液的渗透速度（1 mm/小时），为保持组织的抗原性，单个切片的浸泡时间应尽可能缩短。

方法的故障排除
为了解决上述关键步骤，我们提出以下方法。供体招募与随访依从性：影响脑组织捐献的因素有多种，包括对死后身体形态、纯洁性和完整性可能受损的担忧，或担心死亡后仍可能感到疼痛。有些人甚至担心尸体解剖可能在他们尚未完全死亡时进行70,71。此外，还存在对葬礼安排被打扰以及经济负担的顾虑72。同时，医务人员对死后程序缺乏了解，无法有效回应潜在捐献者或其直系亲属（NOK）的疑虑，也可能阻碍登记。这些因素综合作用可能导致公众认知度低、注册参与者数量少，并随时间推移出现较高的捐献者流失率。因此，供体招募项目必须高效地普及相关知识，建立公众信任，并说服人们注册，同时保持较高的随访参与率。根据我们的经验，这需要对潜在捐献者进行谨慎筛选，并充分解释脑库（BB）的目的。我们开展教育活动，并以富有同理心的方式回应健康人群、神经退行性疾病患者及其家属的担忧与需求。我们发现，面对面沟通时，潜在捐献者更倾向于同意捐献。这种面对面的交流方式能够建立基于相互信任与尊重的关系，这对于实现较高的脑捐献注册率和随访评估参与率至关重要。一支训练有素且具备高度伦理意识的团队首先接触潜在捐献者，讨论死后捐献大脑的可能性，阐明人脑组织对神经科学研究的重要价值，并解答有关死后程序的任何疑问。良好的口碑传播同样重要。在脑组织采集后，应妥善处理并恢复遗体外观。以温和的方式对待遗体，体现对逝者的尊重与感激之情。数月之后，若家属提出要求，将安排一次会议，向其通报神经病理学分析的结果。

死亡时间与脑组织采集：当个人同意捐献后，将成为捐献者，并获得一张带有编号的身份证件，该编号可全天24小时、每周7天联系（即与我们相连的ASP Golgi-Redaelli老年病医院的接待电话）。此外，捐献者的亲属会收到一张粘贴标签，以备住院时使用。本地区的殡葬机构此前已被告知，需将遗体运送至ABB设施，以便召集尸体解剖团队。解剖团队由一名病理学家、一名神经学家和/或神经生物学家以及一名解剖室技术员组成，每日从早上6点至晚上11点待命；此外，常有受训学生在场协助并拍摄记录。

新鲜切片操作的精确性和一致性由两名操作者（一名神经科医生和一名病理学家）完成，他们共同开发了该方法，并在神经病理学领域拥有多年的实践经验。在冷冻切片时，将切片置于预冷的铝制托盘上，并用带互锁结构的铝板覆盖，以确保其保持平整。随后立即放入液氮中冷冻3分钟，之后储存在-80 °C条件下。需要固定的切片则需用纱布单独包裹，浸入10%磷酸盐缓冲甲醛溶液中，并在24小时后更换新鲜固定液。此后，切片在甲醛溶液中保存时间不超过额外5天；然而，考虑到甲醛溶液的渗透速度约为1 mm/天，我们希望进一步缩短浸泡时间。

方法的局限性
本文所描述的研究方法仅覆盖有限的地理区域，且参与捐献项目的个体特征并不能完全代表总体人群。尽管死后间隔时间在24小时以内已属可接受范围，但仍可能导致脑组织中某些蛋白质结构、酶和RNA发生改变。AFS和pH值的测定可能不足以完全准确地评估组织质量73 ，我们正在开发基于RNA完整性评估组织质量的其他验证方法。

关于切片机切片操作，尽管该方法在重建解剖结构关系方面非常有用，但需注意使用大体切片并不简单，且存在一些技术难点。我们的方法具有挑战性且耗时较长。成本相当高，资金支持并不总是容易获得。资金主要来源于公共机构（ASP Golgi-Redaelli 老年病医院）和私人资源（Golgi-Cenci 基金会）、私人捐赠、非营利组织（例如“Federazione Alzheimer Italia”）以及科研项目资助。

与现有/替代方法相比，ABB 方法的重要性
最初，我们的脑捐献项目针对的是参与 InveCe.Ab 纵向研究的个体。因此，所捐献的脑组织均附有多年来收集的详细临床、生物学和社会信息。ABB 的优势正源于这一独特的来源。事实上，研究一组在社会和基因上相关、共享生物学特征和环境暴露的人群，能够增强统计分析能力。此外，该项目还包括以下优势：1）关注并满足社区需求（“先给予，再索取”的理念）：参与者可免费接受定期健康检查，其全科医生会获知检查结果，我们秘书的联系电话可供咨询使用，对严重残疾者提供上门探访服务；2）通过组织定期研讨会（主题涉及脑健康、脑捐献及整体健康）以及策划专题课程（例如老年人使用信息技术设备），吸引参与者、担任公职者及全科医生参与教育活动；3）与民众面对面交流，采取直接互动的方式。上述所有要素构成了 ABB 项目的强大基础。此外，该项目还提升了参与医务人员的临床能力，使其在生前评估和死后神经病理学检查方面积累了丰富经验。在此，我们想特别提及“少数族裔老龄化研究”（The minority aging research study）这一非常独特的项目。该研究纳入了居住在芝加哥地区的一小部分经过筛选的非裔美国人（共1,357名符合条件的受试者中有784人参与，应答率为57%）。研究人员每年上门随访参与者，并邀请他们加入脑捐献项目。该研究采用了一种非传统的模式，与我们的方法有一定相似之处，在脑捐献项目中获得了较高的应答率（784名参与者中有352人登记捐献，占44%），但尸检率尚不理想（53%）74。与“少数族裔老龄化研究”类似，我们通过开展教育活动和富有同理心的沟通方式，取得了优异成果。具体而言，我们的应答率达到93%，登记参与率为28.7%，目前的尸检率为67%。这些数据表明，直接与民众建立联系的项目能够获得更高比例的脑组织捐献。相比之下，其他脑捐献项目若未能重视与潜在捐献者建立关系，其登记率通常较低，仅为10-15%或更低73,75。

既往以神经病理学分析为终点的队列研究较少。此外，大多数脑库和样本库均以疾病为中心，与“患病”脑组织相比，来自健康捐献者的“对照”脑组织极为稀缺。仅有少数脑库基于人群研究，同时纳入患病和正常个体，以研究衰老轨迹73,74,76,77,78,79,80。一些研究，例如美国的“少数民族老龄化研究”74 和芬兰的“Vantaa 85+研究”76 ，与我们的研究类似，但往往随着队列研究的结束而终止。相比之下，ABB的捐献项目预计将在未来长期持续，即使在InveCe.Ab纵向研究结束后，仍将继续招募潜在捐献者并安排随访。这一方法使我们的招募方式与"阳光健康研究所（Sun Health Research Institute, SHRI）脑捐献项目"相似，后者针对的是退休社区人群73。SHRI的脑组织捐献方案效率极高，其平均死后取材间隔时间（postmortem interval）为全球最短（3.92小时）。与全球最大的脑库类似，SHRI方案将大脑半球、小脑和脑干沿中线（矢状面）切开，其中一半新鲜解剖后冷冻，用于生化研究，另一半则用福尔马林固定，用于组织病理学评估。然而，SHRI解剖方案的一个优势在于对单个脑片进行分别固定，而非固定整个半球。事实上，整体固定半球并不理想，因为表面与核心之间的固定梯度存在差异。此外，皮层蛋白可能因长时间暴露于福尔马林溶液而受到影响。因此，我们决定对单个脑片进行分别固定。

固定或冷冻哪一侧脑组织的决定，取决于单一脑库（始终相同、随机分配，或根据解剖日期为奇数或偶数来分配）31,32,33,34,35。因此，对每个半球分别进行生化和组织病理学分析。由于许多神经系统疾病具有不对称性，我们的脑库（BB）提供了一种独特的切片新鲜标本方案：从脑干以及小脑和大脑的每个半球交替保留切片，分别作为固定或冷冻样本；一侧半球的固定切片对应另一侧半球的冷冻切片。该方法使我们能够对所有冷冻样本进行全面的组织学表征，并比较两侧所有区域的结果。如引言所述，该方法可使我们从脑组织中获取尽可能多的信息。此外，ABB 的方法可提供基础但完整的神经病理学特征描述，涵盖几乎所有已知的脑蛋白病变和血管病变。鉴于血管损伤在导致认知功能障碍中的作用尚存争议，我们决定对血管负荷采用双重评分标准30,53。

如实验方案所述，我们采用多学科交叉的方法。尽管这种方法耗时且工作量大，但我们认为其在科研中具有多项优势。例如，在之前的一项研究中，我们已证明高同型半胱氨酸血症（tHcy）本身，或MTHFR C677T TT基因型与APOE-ε4等位基因的联合，可能与执行功能障碍相关，而非记忆丧失81。因此，从神经病理学层面评估具有此类特定遗传特征的受试者可能具有重要意义。这正是通过对我们生物样本库中收集的生物材料进行研究，以验证新科研假设的实例之一。我们方法的另一优势体现在常规评估中纳入定量脑电图（QEEG），因其具有创新性且操作相对简便。实际上，脑电图（EEG）通过记录大脑皮层锥体神经元树突的电位活动，来检测突触功能82。QEEG可被视为评估与认知功能相关的皮层突触活动的生物标志物83。特别是，脑后部α节律减弱并伴随低频节律（theta和delta节律）普遍增强，已被认为与皮层连接中断相关。需要指出的是，大多数诊断相关性研究均基于临床诊断，而临床诊断仅为可能诊断，而非确定性诊断84,85,86,87。仅有极少数针对性研究将QEEG数据与神经病理学表现进行比对，以探讨QEEG与LTS变异型之间的相关性88,89，以及FTLD与AD之间的区别83。通过在本研究中最终确立神经病理学诊断，我们便能够准确解读脑电活动的观察结果。此外，通过对每位受试者进行系列QEEG检测，可追踪个体内部脑电波的动态轨迹及其与神经病理学表现的相关性。长期追踪个体皮层电活动的变化，有助于更深入理解其作为轻度痴呆早期生物标志物的意义。

该方法的未来应用与发展方向
实现组织分布是我们未来的主要目标之一。为此，我们刚刚成立了一个科学委员会，成员包括GC基金会（老年医学）主任、帕维亚大学神经学教授，以及两名分别来自GC基金会的神经科医生和病理科医生。 & 中国台湾老年病医院ASP Golgi-Redaelli。在分发脑组织、组织学切片及其他生物样本时，必须牢记捐赠者同意捐献的目的是用于科学研究。因此，样本的分发应谨慎进行，具体操作应严格遵循BNE行为准则中的相关规定。40任何申请材料的单位应注明所需样本的类型和数量，提供研究项目的描述以及样本将如何使用的说明，并在可能的情况下，提供以往发表成果的证明（转让协议详见 图9）。脑库不以营利为目的，因此研究人员支付的费用仅用于覆盖组织获取、处理、储存和分发的成本。

目前正在推进利用外显子组测序及组学技术（如蛋白质组学和转录组学）开展病例分析的计划。我们采用的替代取样方法将使得组学研究能够在组织学上明确定义的双侧半球组织上进行。通过该方法，可比较同一半球不同脑区以及对侧半球对应区域的基因激活模式，并能够将基因激活情况与组织病理学特征相关联。在这一领域，深度学习的应用将极具前景，包括组织学切片的计算机化分析，以及临床数据、组织学数据与组学数据之间的前沿性关联分析。此外，还可识别多种不同变量之间的其他相关性，并探索其他潜在的技术应用。双侧半球冷冻样本的可获取性，将有助于精确描绘基因激活和蛋白质分布的空间定位。即使在健康个体中，这一研究也具有特殊意义，因为大脑功能及某些疾病本身即具有不对称性。

此外，我们可以从特征明确的脑组织供体中获得细胞培养物。事实上，从获取的脑组织中分离出的软脑膜细胞可提供活细胞，结合诱导性多能干细胞（iPSCs）技术，将软脑膜成纤维细胞重编程并分化为神经细胞，用于构建高级模型，进一步研究疾病或衰老机制90。

随着大脑衰老，分子、细胞和组织水平上可能发生不同的变化特征。每一大脑都是独特的，各自以不同的方式应对内部和外部的应激因素；有些大脑能够抵抗损伤，而另一些则易受损害并表现出明显的病理改变。临床表现与神经病理学特征之间常存在差异，因为临床表现主要取决于病变的解剖分布，而非其分子本质。只有将临床综合征与神经病理学发现相结合，才能实现准确且明确的诊断，而神经病理学结果往往能提供重要的病因学线索，有助于揭示疾病的发病机制。在欧洲，人们正致力于建立神经病理学诊断的标准化方法。我们的诊断方案几乎完全遵循最近发表的脑库神经病理学诊断指南91。这将使我们能够收集并共享经过良好记录的脑组织，未来目标是建立首个意大利脑库。事实上，意大利目前虽有一些脑组织样本库，但尚无基于队列研究的脑库。我们的目标是开发一种可在意大利广泛实施的脑组织采集方法，建立一个采用统一操作流程并共享可比样本的协作网络。为此，未来的主要目标包括联合其他研究中心以及建立专门的网站。

创新技术正不断被用于分析神经退行性疾病的分子特征及生物标志物的鉴定。在此背景下，迫切需要获取伴随纵向研究所得认知与衰老轨迹信息的脑组织样本，这凸显了神经病理学验证的流行病学研究方法的重要性92。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们谨将本工作献给Michela Mangieri博士。在她不幸早逝之前，她构思并启动了Abbiategrasso脑库项目。

我们衷心感谢脑组织捐献者，他们慷慨地捐献了自己身体中最崇高的器官，为科学研究作出了贡献；没有他们的奉献，这项研究将无法进行。

我们感谢 Valeria Marzagalli 在 ABB 项目中所做的宝贵工作。

作者感谢 Johannes Attems 教授、Paolo Fociani 博士和 Giorgio Giaccone 博士提供的宝贵指导和睿智建议。

我们谨向 Alice Cirrincione 博士和 Giulia Bortone 女士在整个项目过程中提供的宝贵帮助表示感谢。
衷心感谢 Tere Cassani 女士的支持，以及“意大利阿尔茨海默病联合会”（Federazione Alzheimer Italia）的协作。
作者感谢帕维亚大学公共卫生、实验与法医学系的 Matteo Moretti 博士和 Antonio Marco Maria Osculati 教授。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
50ml 聚丙烯锥形管 30x115mmBD405253
抗 GFAP 抗体DakoZ0334多克隆一抗（抗兔）；稀释比例 = 1:1000
抗 NeuN (A60) 抗体ChemiconMAB377单克隆一抗（抗小鼠）；稀释比例 = 1:1000
抗磷酸化 TAU 抗体 (AT8)ThermoScientificMN1020单克隆一抗（抗小鼠）；稀释比例 = 1:200
抗磷酸化 TDP-43 抗体 (pS409/410-2)CosmoBioTIP-PTD-P02多克隆一抗（抗兔）；稀释比例 = 1:4000；预处理：在微波炉中分三步加热，分别为 2 分钟、1 分钟、2 分钟，使用 0.01M 柠檬酸缓冲液，pH 6
抗-α-SYN 抗体 (KM51)NovocastraNCL-L-ASYN单克隆一抗（抗小鼠）；稀释比例 = 1:500；预处理：1）在微波炉中分三步加热，分别为 2 分钟、1 分钟、2 分钟，使用 0.01M 柠檬酸缓冲液，pH 6；2）使用 70% 甲酸水溶液处理 10 分钟
抗-β淀粉样蛋白抗体 (4G8)BioLegend800703单克隆一抗（抗小鼠）；稀释比例 = 1:1000；预处理：使用 70% 甲酸水溶液处理 10 分钟
切片板BD352070
DMEM 高糖培养基Carlo ErbaFA30WL0101500培养基
带 5d 刀片的电动锯CEA06.06.14/06.00.16
12mm 表面 pH 电极CEA70064.250 HHH
pH 针状电极Fisher Scientific11796338
EnVision+ 系统-HRPDakoK4001二抗（抗小鼠）；稀释比例 1:2
EnVision+ 系统-HRPDakoK4003二抗（抗兔）；稀释比例 1:2
乙醚SMI8401530
Feather 安全修边刀片 14cmFisher Scientific11749798
胎牛血清Carlo ErbaFA30WS1810500培养基添加剂；稀释比例 = 20%
15cm 外科或解剖镊子Uvex500XG
手套CEA01.28.14
胶水Arcobaleno2624000800002
头部支撑器Lacor60456
L-谷氨酰胺 (100X)Carlo ErbaFA30WX0550100培养基添加剂；稀释比例 = 1%
卷尺CEABISCEATA34
非吸附性单丝黑色聚酰胺线UHU Bostik8000053131470
非必需氨基酸溶液 (100X)Life Technologies11140050培养基添加剂；稀释比例 = 1%
青霉素/链霉素溶液 (100X)Carlo ErbaFA30WL0022100培养基添加剂；稀释比例 = 1%
Quincke 型 20GA 3.50 英寸脊髓穿刺针 0.9x90mmCEA03.06.16
带 n°21 刀片的一次性手术刀
外科托盘Olcelli FarmaceuticaA930857255
外科锤和外科凿CEA79.68.88
手术剪CEA27.08.45/79.68.64
FeatherM130RC

参考文献

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