本文介绍了一种通用的番茄根部转化方法，随后接种青枯劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum），以开展对细菌性萎蔫病的简单遗传学分析。
本文内容
摘要
摘要
Ralstonia solanacearum 是一种破坏性极强的土传维管束病原体，可侵染多种植物物种，对农业生产构成重大威胁。然而， Ralstonia 与其他涉及植物病原细菌的模型相比，该模型的研究仍明显不足，例如 Pseudomonas syringae 在 拟南芥. 旨在研究相互作用的 Ralstonia 以及作物植物对于开发可持续防控青枯病的解决方案至关重要，但目前由于缺乏直接有效的实验方法来表征天然寄主植物中互作的各个组分，相关研究受到阻碍。在此背景下，我们建立了一种用于开展遗传学分析的方法 Ralstonia 番茄（一种天然寄主）的感染 Ralstonia. 该方法基于 根癌农杆菌介导的番茄根部转化，随后进行 Ralstonia 对获得的植株进行灌根接种，使其含有表达目标载体的转化根。根部转化检测方法具有较高的灵活性，可用于基因过表达或RNAi介导的基因沉默。作为概念验证，我们采用该方法证明了RNAi介导的基因沉默 SlCESA6 在番茄根部赋予抗性 Ralstonia在此，我们详细描述了该方法，使其能够在较短时间内，以较少的设备和植物生长空间需求，通过遗传学手段深入理解细菌性萎蔫病。
引言
Ralstonia solanacearum 是引起青枯病的病原菌，是一种具有全球分布的毁灭性土传维管束病原菌，可侵染多种植物物种，包括马铃薯、番茄、烟草、香蕉、辣椒和茄子等1,2。由 Ralstonia 引起的产量损失在番茄、马铃薯或香蕉中可高达总产量的80-90%，具体程度取决于品种、气候、土壤及其他因素3。然而，与涉及其他细菌性植物病原菌（如 Pseudomonas syringae 或 Xanthomonas spp）的研究模型相比，Ralstonia 模型的研究仍相对不足。此外，目前大多数植物-微生物互作研究集中于模式植物 Arabidopsis thaliana。尽管这些模型的研究极大地促进了我们对植物-细菌互作机制的理解，但它们未能满足当前迫切需要了解作物中此类互作的需求。针对 Ralstonia 与作物植物之间互作机制的研究对于开发可持续防控青枯病的策略至关重要，但目前受限于缺乏简便直接的实验方法来表征互作过程中的各个组分。特别是番茄，作为 Ralstonia 的天然寄主，是全球第二重要的蔬菜作物，易受多种病害影响4，其中包括青枯病。在本研究中，我们建立了一种简便的方法，用于对 Ralstonia 侵染番茄的过程进行遗传分析。该方法基于利用 DsRed 荧光作为筛选标记，通过 Agrobacterium rhizogenes 介导的番茄根部转化5，随后对含有表达目标构建物的转化根的植株进行 Ralstonia 土壤浇灌接种。该根部转化实验具有良好的灵活性，可用于基因过表达或RNAi介导的基因沉默研究。
该方法的一个潜在局限性在于非转化根可能存在残余生长。当所使用的质粒缺乏可用于筛选转化根的报告基因时，这一问题尤为突出。为解决此问题，我们开发了一种基于抗生素筛选的替代方法，该方法可抑制非转化根的生长，同时允许健康且具有抗生素抗性的转化根正常生长。由于A. rhizogenes不会诱导地上部分（茎叶）的转化，因此这些未转化的植株对抗生素敏感，必须使其与含抗生素的培养基保持分离。
尽管植物对Ralstonia的抗性机制尚未完全阐明，但已有若干研究报道细胞壁的改变与对青枯病抗性的增强相关6,7,8,9。有研究提出，这些细胞壁的改变可能影响维管组织的发育，而维管系统对Ralstonia在植物体内的生存至关重要10。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，编码纤维素合酶的基因CESA4、CESA7和CESA8发生突变已被证明会破坏次生细胞壁的完整性，从而增强对Ralstonia的抗性，且该抗性似乎与ABA信号通路相关8。因此，为验证本方法的可行性，我们对SlCESA6（Solyc02g072240）基因进行了RNAi介导的基因沉默，该基因为次生细胞壁纤维素合酶基因，是AtCESA8（At4g18780）的同源基因。随后通过土壤浇灌法接种Ralstonia，结果显示沉默SlCESA6可增强植株对青枯病症状的抗性，表明细胞壁介导的抗Ralstonia机制在番茄中可能具有保守性，同时也验证了本方法可用于番茄根部青枯病抗性的遗传学分析。本文将详细描述该方法，使其能够在较短时间内，以较少的仪器设备和植物生长空间，开展针对青枯病的遗传学研究。
方案
注意：该方法的关键步骤涉及植物材料的体外操作，因此在整个操作过程中（包括 DsRed 荧光的观察）必须保持无菌条件。在转化过程的整个期间，番茄幼苗在 25−28 °C 及 16 小时光照/8 小时黑暗（光照强度为 130 µmol 光子 m-2s-1）条件下生长。培养皿使用 micropore 胶带密封，以利于气体交换和蒸腾作用。
1. 番茄植株和Agrobacterium rhizogenes的准备
- 用5%（v/v）次氯酸钠对番茄种子（Solanum lycopersicum cv. Moneymaker, LA2706, Tomato Genetics Resource Center, TGRC）进行表面灭菌5分钟。用无菌蒸馏水清洗4–5次，并将种子在无菌水中缓慢振荡过夜，以促进萌发。
- 将番茄种子转移至不含蔗糖的1/2强度Murashige和Skoog（1/2 MS）培养基（2.21 g/L MS，8% w/v 琼脂）中。在25−28 °C黑暗条件下培养三天（图1A）。
注意：每个构建体通常需要约40粒种子。 - 将8.5 cm2的方形滤纸进行高压灭菌。将滤纸放入含有1/2 MS培养基的9 cm2方形培养皿中（将滤纸置于琼脂表面），每皿放置6粒已萌发的番茄种子（图1B）。用微孔胶带密封培养皿，并在25−28 °C下培养萌发的种子3−4天。
- 在植物转化前两天，于28 °C在固体LB培养基（含适当抗生素）中培养Agrobacterium rhizogenes MSU440。
注意：A. rhizogenes由西班牙格拉纳达EEZ-CSIC的Juan Antonio López Ráez博士提供。本研究所用的A. rhizogenes菌株携带pK7GWIWG2_II-RedRoot::CESA6或空载体作为对照。pK7GWIWG2_II-RedRoot含有一个由Arabidopsis thaliana泛素启动子（pAtUBQ10）驱动的报告基因DsRed，并赋予壮观霉素抗性（50 µg/mL）。也可使用其他载体进行基因过表达，如先前报道5。本研究中，通过逆转录（RT）PCR从番茄（S. lycopersicum cv. Moneymaker）RNA中扩增出SlCESA6沉默的特异性片段，并连接至p-ENTR/D-TOPO载体（表1）。随后，将SlCESA6-RNAi片段克隆至pK7GWIWG2_II-RedRoot双元载体中。
2. 植物转化与筛选
- 使用无菌手术刀切去番茄幼苗的胚根和下胚轴底部（图1C,D）。
- 用塑料枪头或手术刀片从LB培养基表面收集A. rhizogenes菌体，并将切口处的番茄幼苗小心浸入菌体中（图1E）。
- 接种A. rhizogenes后，用一张2 cm × 4 cm的半圆形滤纸覆盖番茄幼苗（图1F），以保持高湿度，促进幼苗存活及新根发育。
- 将转化后的番茄幼苗培养6–7天。随后使用无菌手术刀切除新长出的毛状根（图1G,H；此阶段的根尚未完成转化），并让幼苗继续产生新的毛状根。
- 当第二代新毛状根出现时（图1I），移除覆盖在幼苗上方的滤纸，并再次用微孔胶带密封培养皿。
注意：此时转化载体中的DsRed荧光标记可用于观察新根中的转化效率。 - 为观察DsRed荧光，可使用体视显微镜或其他植物活体成像设备（图1J）。标记呈阳性（显示红色荧光）的转化根，并使用无菌手术刀切除无红色荧光的阴性非转化根。
- 将显示红色荧光的幼苗转移至含有1/2 MS培养基的新培养皿中，以促进转化根发育为主根（图1K）。将未显示红色荧光的幼苗保留在原培养皿中，以便在后续时间点观察是否有荧光根出现（图1L）。
- 基于抗生素筛选的替代方法
- 作为步骤2.5的替代方法，准备盛有含适当抗生素的1/2 MS培养基的半满9 cm2方形培养皿。在制备过程中将培养皿倾斜约5°，以形成无培养基的空白区域（图2A），使幼苗地上部分生长时避免接触抗生素。
- 作为步骤2.6的替代方法，在切除第一轮长出的非转化毛状根（步骤2.4）后，将无根幼苗通过适当尺寸的滤纸转移至半满培养皿中（图2B）。
注意：建议使用携带相同抗生素抗性基因和报告基因的质粒（本实验方案中为pK7GWIWG2_II-RedRoot；卡那霉素50 µg/mL）转化若干幼苗作为阳性对照。 - 作为步骤2.7的替代方法，让幼苗发育出新的毛状根，并切除那些未直接接触滤纸夹层表面的根，因为这些根可能逃避抗生素筛选。
注意：由于抗生素的作用，根的发育可能比无抗生素培养皿中更缓慢。在将无根幼苗转移至半满培养皿（步骤2.8.2）后14–18天内，可观察到新的转化毛状根（图2C-E）。
- 用一张2 cm × 4 cm的半圆形滤纸覆盖幼苗，密封培养皿，并将幼苗置于培养条件下使其发育出新的毛状根。
注意：无需使用抗生素清除A. rhizogenes。覆盖在MS培养基上的滤纸以及培养基中缺乏蔗糖可抑制A. rhizogenes在培养皿中的扩散5。 - 首次根筛选后5至7天，重复筛选过程，选择新出现的转化根并去除非转化根。将含有转化根的幼苗转移至含有1/2 MS培养基的新培养皿中。
3. 转移至接种盆
- 准备用于接种的育苗钵，使根部表面能够暴露于细菌接种液中：用清水浸泡接种育苗钵，倒去多余的水分，并将其放入塑料种植托盘中。使用镊子将已转化根系的筛选幼苗转移至接种育苗钵中（图3A）。
- 用保鲜膜或透明盖子覆盖托盘，并置于25−28 °C、65%湿度条件下培养（光照周期为16小时光照/8小时黑暗，光照强度为130 µmol photons m-2s-1），以维持高湿度环境（图3B）。五到六天后移除覆盖物。
注意：转化后的番茄植株在移栽至土壤后两到三周即可进行接种（图3C）。在土壤生长期间，番茄植株可能产生未转化的新根。为评估该现象的程度，对三周龄转化番茄植株根部的红色荧光进行了观察。大多数根系（80%–100%）显示出红色荧光，表明其确实已成功转化（图3D,E）。
4. 土壤灌注接种
- 在轨道摇床（200 rpm）中，于28 °C条件下，在phi液体培养基（表211）中培养R. solancearum（本方案中使用菌株GMI1000），直至进入稳定生长期。
- 通过测定菌液在600 nm处的光密度（OD600）来确定细菌数量。用蒸馏水将菌液稀释至OD600为0.1（在此实验条件下，相当于约108菌落形成单位[CFU]/mL）。
- 将16−20个含有转基因番茄植株的接种盆放置于一个接种托盘（29 cm × 20 cm；图4A）中。
- 向装有接种盆的托盘中加入300 mL（每株约15 mL）细菌接种液（OD600为0.1），使植株浸泡在接种液中20分钟（图4B）。
- 准备一个新的托盘，并铺上一层栽培土。将已接种的盆移入新托盘中（图4C），然后将托盘置于生长室中，保持75%湿度、26−28 °C温度，以及12小时光照/12小时黑暗的光周期（光照强度为130 µmol photons m-2s-1）。
5. 感染参数的测定与统计分析
- 在接种雷尔氏菌（Ralstonia）后的两周内，每天按照先前所述方法12,13，采用0（无症状）至4（完全萎蔫）的评分标准对病害症状进行评分（图4D-H）。
注意：病害指数数据是在一段时间内从同一实验单位（每株植物）收集的。
6. 基因表达分析
注意：转基因的表达或靶基因的沉默可通过RT-PCR或定量RT-PCR（qRT-PCR）进行检测。
- 采集样品，并从转化根系的代表性部位（用于评估目标基因的效应）以及叶片（作为内参对照）中提取RNA。
- 使用1 µg经DNase处理的总RNA合成cDNA。
- 通过qRT-PCR分析目标基因的表达水平，采用2-ΔΔCT法14计算相对转录水平，以SlEFα-1作为看家基因15。
注意：引物序列见表1。
结果
图5展示了根部转化了空载体（EV）的番茄植株以及根部转化了靶向SlCESA6（Solyc02g072240）的RNAi构建体的番茄植株在病害症状上的发展情况。疾病指数数据（图5A）是根据0到4的任意评分标准，对同一实验单位（每株植物）随时间连续采集的，且不符合正态分布，因此不能采用针对参数数据的标准统计检验方法。此外，由于定植和感染过程的动力学特性，此类实验中植株间存在固有的个体差异。下文将探讨与Ralstonia感染相关的症状表现及统计分析的不同方法。
作为标准方法，采用Mann-Whitney双尾非参数检验来比较对照组（EV）和SlCESA6-RNAi的感染曲线。根据该分析，两条曲线中位数之间的差异似乎无统计学意义（P = 0.16）。
还可以量化病害发展曲线下面积（AUDPC），从而将病害发展的多次观测结果合并为一个单一数值。在感染过程结束时，对照植株（EV；28.75 ± 4.75）的 AUDPC 值高于 SlCESA6-RNAi 植株（21.01 ± 4.74），表明与对照植株相比，SlCES6 沉默植株对 Ralstonia 感染具有更强的抗性（图 5B）。
置信区间（CI）提供了一种以高概率估计某变量总体值（或参数）所在范围的方法。如图5C所示，对照组（EV）和SlCESA6-RNAi感染曲线的95%置信区间范围表明，当SlCESA6基因沉默时，植物具有更高的抗性概率。
可将病害指数值转换为二元数据，其中病害指数低于2记为“0”，病害指数大于或等于2记为“1”12。该转换方法可用于表示接种青枯菌（Ralstonia）后的植株存活曲线。此转换依据如下观察结果：一旦植株开始出现明显症状（病害指数为2），即被视为“已感染”，并会因该感染而死亡。根据Gehan-Breslow-Wilcoxon统计检验，EV植株与SlCESA6-RNAi植株之间的存活率差异无统计学显著性（P = 0.13）（图5D）。
除了进行统计分析之外，无论获得的 P 值如何，都应基于不同重复样本中观察到的趋势的可重复性来解读这些数据（补充图1）。与此观点一致，近年来越来越多的科学家指出，过度依赖严格的统计阈值（例如常用的 P ≤ 0.05）存在风险16。
SlCESA6 的表达在接种前对两个随机选择的转化根进行了分析，结果显示对Ralstonia的增强抗性与SlCESA6表达水平降低相关（图5E）。采用该方法，经过两轮筛选后可获得35−40%的转化率（图5F）。通过增加额外的筛选轮次，该数值可进一步提高5。
图1：植物准备、转化与筛选。（A）番茄种子在半倍强度MS（1/2）培养基中的萌发。（B）将已萌发的番茄种子置于含有1/2 MS培养基的培养皿中的滤纸上。（C）和（D）分别为切除胚根和下胚轴底部前后的番茄幼苗。（E）通过浸入菌体生物量中进行番茄幼苗转化。（F）用滤纸覆盖转化后的番茄幼苗以保持湿度。（G）和（H）新长出的（非转化）毛状根的出现与去除。（I）已转化的根。（J）通过DsRed荧光可视化筛选转化的番茄毛状根。红色箭头指示表达DsRed荧光的阳性转化根。（K）转化根发育为主根。（L）在成熟转化根中观察DsRed荧光。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：基于抗生素筛选的替代方法。 (A) 半满 含1/2 MS培养基的方形培养皿。B将幼苗切下并置于含有抗生素的1/2 MS培养基上的滤纸上，去除第一批未转化的毛状根后进行。C) 根部覆盖额外的滤纸。D在含抗生素的1/2 MS培养基上生长的番茄转化根。E) 转化了pK7GWIWG2_II-RedRoot（卡那霉素 50 µg/mL），表达 DsRed，作为阳性对照。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图3：转化后番茄植株转移至接种盆。（A）将根部转化的番茄植株转移至充分浸湿的接种盆中。（B）接种盆中的转化番茄植株覆盖塑料盖，以维持高湿度环境。（C）转移至接种盆后2至3周龄的根部转化番茄植株，已准备进行接种。（D）去除土壤后的3周龄番茄植株。（E）3周龄转化番茄植株根部的DsRed荧光。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：拉尔施通氏菌土壤灌注接种。 (A所需材料 R. solanacearum GMI1000 接种。B) 用浸根法将转化番茄植株接种于接种盆中的土壤中 R. solanacearum GMI1000 接种物。C接种后的番茄放置在一层盆栽土壤上。D-H) Ralstonia 病害症状等级，范围从0（无症状）到4（完全萎蔫）。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图 5：SlCESA6 沉默增强对R. solanacearum的抗性。（A）经R. solanacearum接种后，通过RNAi介导的SlCESA6沉默（CESA6-RNAi）及空载体（EV）根转化番茄植株的发病症状。数值代表8株植物的平均值±标准误（SE）。（B）A图所示植株的病害进展曲线下面积。（C）A图所示植株的95%置信区间。（D）A图所示植株的存活百分比。（E）通过qRT-PCR分析RNAi介导的SlCESA6沉默（CESA6i）及空载体（EV）根转化番茄植株在根部（1,2）和茎部（S）的基因表达。数值代表三次技术重复的平均值±标准误（SE）。（F）两次独立实验中EV和CESA6-RNAi根转化番茄植株的转化率。数值为经过两轮筛选后的平均值±标准误（SE）。请点击此处查看该图的放大版本。
| 引物名称 | 引物序列 (5'-3') |
| EFα-1-F | GGTGGCGAGCATGATTTTGA |
| EFα-1-R | CGAGCCAACCATGGAAAACAA |
| qCESA6-F | GATCTGGTTCGCTTTCTCGT |
| qCESA6-R | TCCCTCCCTTTCATACCTTG |
| CESA6-RNAi-F | CACCGGCGAACAAGTGGGGTTAG |
| CESA6-RNAi-R | TTTGAGACTTTGGCACTGGA |
表1：引物序列。
| 成分 | 配制 1 L 用量 |
| Bacto peptone | 10 g |
| Yeast extract | 1 g |
| Casamino acids | 1 g |
表2：Phi (Ø) 培养基成分。
补充图1：图5A所示结果的可重复性。 经R. solanacearum接种后，通过RNAi介导的SlCESA6基因沉默（CESA6-RNAi）及空载体（EV）根转化番茄植株的病害症状。数值表示8株植物的平均值±标准误。通过qRT-PCR对RNAi介导的SlCESA6基因沉默（CESA6i）和空载体（EV）根转化番茄植株的根部（1,2）和地上部分（S）进行基因表达分析。数值表示三次技术重复的平均值±标准误。请点击此处下载该图。
讨论
Ralstonia solanacearum 对农业生产构成重要威胁；然而，与其他细菌性病原体相比，其与重要农作物自然宿主之间的相互作用仍知之甚少，尤其是在作物植物种类中。大多数情况下，对宿主植物进行遗传改造所需的时间和成本限制了遗传学分析的开展。为解决这一问题并促进对R. solanacearum在番茄中侵染过程的遗传分析，我们开发了一种简便的方法，该方法基于Agrobacterium rhizogenes介导的番茄根部转化（图1），随后采用灌根接种方式（图3）。转化后的根系通过荧光报告基因（本方案中为DsRed）进行筛选（图1）。此外，我们还开发了一种基于抗生素筛选的替代方法，该方法不会损伤未转化的地上部分（图2）。
转化实验方案基于Ho-Plágaro等人5所述方法，并进行了若干修改。该方法的多功能性使得可在转化根中进行多种附加实验，例如用于分析植物生理、对化学处理的响应，以及对不同生物和非生物胁迫的响应等。
将转化植株移栽至土壤后，我们考虑到植株可能发育出新的、未转化的根系。为了验证这一可能性，我们在植株移栽至土壤两周后（接种Ralstonia之前）观察了转化植株根系中DsRed的荧光信号。结果显示，大多数根系均表现出红色荧光（图3D）。
T-DNA 转移通过 农杆菌 以随机方式整合到宿主基因组中，因此该方法产生的番茄植株群体在目标基因的表达水平上具有异质性。 R. solanacearum 感染通常会导致植株死亡，从而阻碍实验结束后采集根部样品以分析每株植物的基因表达。为在实验过程中分析目标基因的表达水平，我们在接种步骤之前选取两到三株根部转化的植株，作为将要接种的植株群体的代表性样本。 图5 表明番茄植株病害症状的减轻与防治效率相关 SlCESA6 接种前的基因沉默。因此，尽管该方案存在一些局限性，但我们的代表性结果清楚地表明，该方法是研究参与抗性或感病性候选基因的有力工具 R. solanacearum 在番茄中。本文所示示例使我们能够确定，通过敲低 SlCESA6，一种与次生细胞壁相关的纤维素合酶，可增强对感染的抗性 R. solanacearum，类似于先前使用其直系同源物所观察到的结果 AtCESA8 (At4g18780）来自 拟南芥8.
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Macho实验室所有成员在本研究期间提供的有益讨论，感谢Alvaro López-García提供的统计学建议，以及感谢Xinyu Jian在技术与行政方面给予的支持。感谢中国科学院植物逆境生物学研究中心细胞生物学核心设施在荧光成像方面提供的协助。本工作得到了中国科学院战略性先导科技专项（项目编号XDB27040204）、中国科学院上海植物逆境生物学研究中心以及中国千人计划项目的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 90 mm 方形培养皿 | |||
| 琼脂粉 | Sigma-Aldrich | ||
| Bacto蛋白胨 | BD（贝克顿和迪金森） | ||
| 酪蛋白氨基酸 | Sigma-Aldrich | ||
| 滤纸 | |||
| 活体植物成像系统 NightShade LB 985 | 贝托德科技 | ||
| 速生花盆 | Jiffy Products International A.S. | ||
| 微孔胶带 | 3M | ||
| Murashige和Skoog培养基（M519） | Phytotechlab | ||
| Pindstrup 培养基 | Pindstrup Mosebrug A/S | ||
| 手术刀和刀片 | |||
| 次氯酸钠 | Sigma-Aldrich | ||
| 无菌洁净工作台 | |||
| 镊子 | |||
| 沃特曼滤纸 | Wahtman International Ltd. Maldstone | ||
| 酵母提取物 | OXOID |
参考文献
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