本文介绍了一种通用的番茄根部转化方法，随后接种青枯劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum），以开展对细菌性萎蔫病的简单遗传学分析。
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本文内容
摘要
摘要
Ralstonia solanacearum 是一种破坏性极强的土传维管束病原体，可侵染多种植物物种，对农业生产构成重大威胁。然而， Ralstonia 与其他涉及植物病原细菌的模型相比，该模型的研究仍明显不足，例如 Pseudomonas syringae 在 拟南芥. 旨在研究相互作用的 Ralstonia 以及作物植物对于开发可持续防控青枯病的解决方案至关重要，但目前由于缺乏直接有效的实验方法来表征天然寄主植物中互作的各个组分，相关研究受到阻碍。在此背景下，我们建立了一种用于开展遗传学分析的方法 Ralstonia 番茄（一种天然寄主）的感染 Ralstonia. 该方法基于 根癌农杆菌介导的番茄根部转化，随后进行 Ralstonia 对获得的植株进行灌根接种，使其含有表达目标载体的转化根。根部转化检测方法具有较高的灵活性，可用于基因过表达或RNAi介导的基因沉默。作为概念验证，我们采用该方法证明了RNAi介导的基因沉默 SlCESA6 在番茄根部赋予抗性 Ralstonia在此，我们详细描述了该方法，使其能够在较短时间内，以较少的设备和植物生长空间需求，通过遗传学手段深入理解细菌性萎蔫病。
引言
Ralstonia solanacearum 是引起青枯病的病原菌，是一种具有全球分布的毁灭性土传维管束病原菌，可侵染多种植物物种，包括马铃薯、番茄、烟草、香蕉、辣椒和茄子等1,2。由 Ralstonia 引起的产量损失在番茄、马铃薯或香蕉中可高达总产量的80-90%，具体程度取决于品种、气候、土壤及其他因素3。然而，与涉及其他细菌性植物病原菌（如 Pseudomonas syringae 或 Xanthomonas spp）的研究模型相比，Ralstonia 模型的研究仍相对不足。此外，目前大多数植物-微生物互作研究集中于模式植物 Arabidopsis thaliana。尽管这些模型的研究极大地促进了我们对植物-细菌互作机制的理解，但它们未能满足当前迫切需要了解作物中此类互作的需求。针对 Ralstonia 与作物植物之间互作机制的研究对于开发可持续防控青枯病的策略至关重要，但目前受限于缺乏简便直接的实验方法来表征互作过程中的各个组分。特别是番茄，作为 Ralstonia 的天然寄主，是全球第二重要的蔬菜作物，易受多种病害影响4，其中包括青枯病。在本研究中，我们建立了一种简便....
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方案
注意：该方法的关键步骤涉及植物材料的体外操作，因此在整个操作过程中（包括 DsRed 荧光的观察）必须保持无菌条件。在转化过程的整个期间，番茄幼苗在 25−28 °C 及 16 小时光照/8 小时黑暗（光照强度为 130 µmol 光子 m-2s-1）条件下生长。培养皿使用 micropore 胶带密封，以利于气体交换和蒸腾作用。
1. 番茄植株和Agrobacterium rhizogenes的准备
- 用5%（v/v）次氯酸钠对番茄种子（Solanum lycopersicum cv. Moneymaker, LA2706, Tomato Genetics Resource Center, TGRC）进行表面灭菌5分钟。用无菌蒸馏水清洗4–5次，并将种子在无菌水中缓慢振荡过夜，以促进萌发。
- 将番茄种子转移至不含蔗糖的1/2强度Murashige和Skoog（1/2 MS）培养基（2.21 g/L MS，8% w/v 琼脂）中。在25−28 °C黑暗条件下培养三天（图1A）。
注意：每个构建体通常需要约40粒种子。 - 将8.5 cm2的方形滤纸进行高压灭菌。将滤纸放入含有1/....
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结果
图5展示了根部转化了空载体（EV）的番茄植株以及根部转化了靶向SlCESA6（Solyc02g072240）的RNAi构建体的番茄植株在病害症状上的发展情况。疾病指数数据（图5A）是根据0到4的任意评分标准，对同一实验单位（每株植物）随时间连续采集的，且不符合正态分布，因此不能采用针对参数数据的标准统计检验方法。此外，由于定植和感染过程的动力学特性，此类实验中植株间存在固有的个体差异。下文将探讨与Ralstonia感染相关的症状表现及统计分析的不同方法。
作为标准方法，采用Mann-Whitney双尾非参数检验来比较对照组（EV）和SlCESA6-RNAi的感染曲线。根据该分析，两条曲线中位数之间的差异似乎无统计学意义（P.......
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讨论
Ralstonia solanacearum 对农业生产构成重要威胁；然而，与其他细菌性病原体相比，其与重要农作物自然宿主之间的相互作用仍知之甚少，尤其是在作物植物种类中。大多数情况下，对宿主植物进行遗传改造所需的时间和成本限制了遗传学分析的开展。为解决这一问题并促进对R. solanacearum在番茄中侵染过程的遗传分析，我们开发了一种简便的方法，该方法基于Agrobacterium rhizogenes介导的番茄根部转化（图1），随后采用灌根接种方式（图3）。转化后的根系通过荧光报告基因（本方案中为DsRed）进行筛选（图1）。此外，我们还开发了一种基于抗生素筛选的替代方法，该方法不会损伤未转化的地上部分（图2）。
转化实验方案基于Ho-Plágaro等人
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Macho实验室所有成员在本研究期间提供的有益讨论，感谢Alvaro López-García提供的统计学建议，以及感谢Xinyu Jian在技术与行政方面给予的支持。感谢中国科学院植物逆境生物学研究中心细胞生物学核心设施在荧光成像方面提供的协助。本工作得到了中国科学院战略性先导科技专项（项目编号XDB27040204）、中国科学院上海植物逆境生物学研究中心以及中国千人计划项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 90 mm 方形培养皿 | |||
| 琼脂粉 | Sigma-Aldrich | ||
| Bacto蛋白胨 | BD（贝克顿和迪金森） | ||
| 酪蛋白氨基酸 | Sigma-Aldrich | ||
| 滤纸 | |||
| 活体植物成像系统 NightShade LB 985 | 贝托德科技 | ||
| 速生花盆 | Jiffy Products International A.S. | ||
| 微孔胶带 | 3M | ||
| Murashige和Skoog培养基（M519） | Phytotechlab | ||
| Pindstrup 培养基 | Pindstrup Mosebrug A/S | ||
| 手术刀和刀片 | |||
| 次氯酸钠 | Sigma-Aldrich | ||
| 无菌洁净工作台 | |||
| 镊子 | |||
| 沃特曼滤纸 | Wahtman International Ltd. Maldstone | ||
| 酵母提取物 | OXOID |
参考文献
- Jiang, G., et al. Bacterial Wilt in China: History, Current Status, and Future Perspectives. Frontiers in Plant Science. 11 (8), 1549(2017).
- Mansfield, J., et al. Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology.
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