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解剖 黑腹果蝇 用于组学研究的飞行肌

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DOI：

10.3791/60309

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2019年10月17日

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1Biomedical Center, Department of Physiological Chemistry, Ludwig-Maximilians-University Munich, 2Center for Integrated Protein Science Munich (CIPSM), Department of Chemistry, Ludwig-Maximilians-University Munich

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

Drosophila 飞行肌是研究转录调控、选择性剪接、代谢以及机械生物学的有力模型。本文介绍一种从活体蛹中解剖荧光标记飞行肌的实验方案，可获得高度富集的样品，适用于蛋白质组学和深度测序分析。这些样品有助于深入理解肌肉发育的多种分子机制。

摘要

Drosophila 飞行肌是研究多种生物学过程的有力模型，这些过程包括转录调控、选择性剪接、代谢以及机械生物学，它们均影响肌肉发育和肌原纤维形成。组学数据（例如质谱或深度测序所产生的数据）可为理解这些生物学过程提供重要的机制性见解。在开展此类研究时，分析组织特异性样本有助于提高组学特征图谱的选择性和特异性。本文介绍了一种从活体蛹中解剖荧光标记飞行肌的实验方案，以获得高度富集的肌肉样本用于组学研究。我们首先描述了如何在蛹早期阶段（蛹壳形成后 [APF] <48 小时）解剖飞行肌，此时肌肉可通过绿色荧光蛋白（GFP）标记进行识别。随后，我们描述了如何在蛹晚期（APF >48 小时）或成虫阶段解剖肌肉，此时可在解剖显微镜下清晰分辨肌肉结构。随附的视频方案将使这些技术要求较高的解剖操作更广泛地被肌肉研究和 Drosophila 研究领域所采用。对于RNA相关应用，我们检测了在不同时间点及不同操作方法下所能提取RNA的数量和质量。我们进一步证明，Bruno1（Bru1）对于肌球蛋白重链（Mhc）剪接的时间转换是必需的，表明所获取的解剖肌肉可用于mRNA-Seq、质谱分析以及逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）等实验。该解剖方案将有助于推动组织特异性的组学分析，并可广泛应用于肌生成多个生物学方面的研究。

引言

现代组学技术为研究肌肉发育以及人类肌肉疾病机制提供了重要见解。例如，通过结合动物模型中的遗传学和生化验证手段对转录组学数据进行分析，揭示了剪接因子 RBM20 的缺失会导致扩张型心肌病，这是因为它调控着一个包含 30 多个与心脏疾病相关的肌节基因的目标网络，其中包括肌联蛋白1,2,3。

在第二个例子中，细胞培养、动物模型及人类患者的研究表明，强直性肌营养不良是由于RNA调控紊乱所致，其机制为肌肉盲样蛋白（MBNL）被隔离以及CELF1上调4,5MBNL 与 CELF1（也称为 CUGBP1 或 Bruno-Like 2）之间的交叉调控和时间动态有助于 解释强直性肌营养不良症患者中持续存在的胚胎剪接模式。此外，这一庞大的失调靶点网络有助于阐明该疾病的复杂性4,6,7,8大多数此类研究利用模式生物中的组学方法来解析人类肌肉疾病的潜在机制。此外，这些研究强调，首先需要了解健康肌肉中时间特异性和组织类型特异性的基因表达、蛋白质修饰以及代谢模式，才能阐明病变或衰老肌肉中的异常变化。

Drosophila melanogaster 是另一种广泛应用的遗传学模式生物。从果蝇到脊椎动物，肌节的结构及其各个组分均高度保守4,9,10，而间接飞行肌（IFMs）已成为研究肌肉发育多个方面的有力模型11,12。首先，纤维状飞行肌在功能和形态上均不同于管状体壁肌11,13，这使得研究人员能够探究肌肉类型特异性的发育机制。包括 Spalt major（Salm）14、Extradenticle（Exd）和 Homothorax（Hth）15 在内的转录因子已被鉴定为纤维状肌肉命运的调控因子。此外，在 Salm 的下游，CELF1 的同源物 Bruno1（Bru1, Aret）可调控纤维状肌肉特异的剪接程序16,17。

其次，间接飞行肌（IFMs）是研究肌发生过程本身的重要模型，涵盖从成肌细胞融合、肌管附着到肌原纤维形成及肌节成熟的各个阶段。9,18,19第三， 果蝇 遗传学方法能够研究单个蛋白质、蛋白质结构域及蛋白质异构体在肌节形成、功能及其生物物理特性中的作用20,21,22,23最后，IFM模型已被开发用于研究多种人类肌肉疾病，如强直性肌营养不良、肌原纤维肌病、肌肉变性性疾病、肌动蛋白病等。24,25,26,27，并为疾病机制和潜在治疗方法提供了重要见解28,29,30因此， 果蝇 是研究肌生成领域诸多未解问题的有用模型，包括肌肉类型特异性转录、剪接及染色质调控机制，以及代谢在肌肉发育中的作用。现代组学技术的应用，特别是与该模型中已有的多种遗传学、生物化学和细胞生物学检测方法相结合， 黑腹果蝇有望极大地推动对肌肉发育、衰老及疾病机制的理解。

间接飞行肌（IFMs）是果蝇中最大的肌肉，在成虫体内横跨胸部全长，长度接近 1 mm31,32。然而，由于其体积微小，难以获取足够的组织样本，从而为在 Drosophila 中以组织特异性方式应用组学技术带来了挑战。此外，IFMs 属于在蛹期发育形成的成虫肌肉系统。成肌细胞融合形成肌管，约在蛹壳形成后 24 小时（APF）附着于肌腱，并在约 30 小时 APF 经历必要的压缩过程，以启动肌原纤维生成（图 1A-D）18,33,34。

随后，肌纤维生长至贯穿整个胸部，肌原纤维经历一个以增加肌节为主的初始生长期，直至约48 h APF，之后转入成熟阶段，在此阶段肌节在长度和宽度上继续生长，并经过重塑，于72 h APF时建立牵张激活能力（图1A-D）32,35。纤维成熟的起始至少部分受Salm和E2F调控32,36,37，且在此阶段会整合多种由Bru1调控其剪接的间接飞行肌特异性肌节蛋白异构体16,17。成熟果蝇于90–100 h APF期间羽化。这意味着，若要研究肌肉发育，必须从多个蛹期时间点分离出足量、高质量且高纯度的间接飞行肌，以支持采用组学方法进行分析。

已有多种关于间接飞行肌（IFM）解剖的实验方案发表。尽管这些方案在各自预期的应用中效果良好，但没有一种方案完全适用于组学研究。一些方案专注于保留蛹期和成虫期IFM的形态以进行免疫荧光分析19，另一些用于分离IFM纤维以进行力学性能评估31，或采用从冷冻切片中显微解剖蛹期IFM的方法38，这些方法过于专一，且耗时耗力，难以合理地获得足够量的IFM组织用于组学研究。此外，已有针对成虫IFM快速解剖的方案被开发出来38,39，但这些方案不适用于蛹期，并且所使用的缓冲液可能不适合甚至与某些组学应用（例如RNA提取）不兼容。因此，亟需建立新的方法以分离蛹期IFM，用于生物化学或组学研究。

本文介绍了一种在蛹期解剖间接飞行肌（IFM）的实验方案，该方案可用于研究 已成功用于从16小时成蛹后至成虫阶段的mRNA-Seq分析16,32该方案采用绿色荧光蛋白（GFP）标记，在蛹期和成虫发育的各个阶段识别间接飞行肌（IFMs），从而可在荧光体视显微镜下进行活体解剖。该方法比现有的IFM解剖方案更省时省力，通量更高。这使得样品能够快速分离并冷冻保存，经过数轮解剖后可获得足量材料，适用于组学研究以及标准的逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）或蛋白质印迹（western blotting）。

本方案分为两部分，分别演示如何在48小时成蛹前（APF）（早期变态阶段，此时间接飞行肌（IFM）附着较不稳定）和48小时成蛹后（APF）（此时蛹体结构和IFM附着已清晰明确）快速解剖间接飞行肌。我们证明，可在各个时间点从解剖获得的IFM中提取高质量RNA，并提供了不同RNA提取与反转录方法的数据。最后，我们以CELF1同源基因Bruno1为例，展示该解剖方案在mRNA-Seq、质谱分析和RT-PCR中的应用。我们通过Bruno1突变体IFM的蛋白质组学数据揭示了肌原纤维蛋白异构体的异常表达，并分析了Bruno1对肌球蛋白重链（Mhc）C端剪接事件的调控作用。这些结果说明，组学数据可深入揭示生物学现象，与遗传学和生物化学实验相互补充。

方案

1. 蛹的分期

  1. 在培养瓶中饲养所需基因型的果蝇（图1E）。可直接翻新解剖用果蝇品系，或设置杂交，至少使用20只雌性处女蝇。持续培养至果蝇开始化蛹。
  2. 用湿润的画笔收集未成熟蛹，并转移至60 mm培养皿中的湿润滤纸上（图1F）。
  3. 对蛹进行性别鉴定，收集实验所需的性别个体（图1G）。雄性蛹可通过其体内精巢识别，精巢在不透明的蛹体中呈现为透明球状结构。
  4. 在培养皿上标注时间、日期和基因型，随后将蛹培养至所需发育阶段（图1H）。
    注意：杂交组合/品系的维持及蛹的培养应在温度可控的培养箱中进行（例如，RNAi杂交使用25 °C或27 °C，因较高温度下Gal4活性增强，可提高基因敲低效率40）。确保湿度足够高，以防在多天培养过程中蛹体干燥。

2. 48 h APF 前的 IFM 解剖

  1. 准备必要的设备，包括两把#5生物级镊子、移液器、移液器吸头、干冰，以及（针对RNA样本）裂解试剂（见材料表）。此外，将黑色解剖皿（见材料表）、1x磷酸盐缓冲液（PBS）和1.5 mL微量离心管置于冰上预冷。
  2. 使用湿润的画笔将处于特定发育阶段的蛹转移至装有约三分之二冷1x PBS的黑色解剖皿中（图2A,B）。然后移至荧光解剖显微镜下进行操作。
    注意：转移的蛹数量应控制在30分钟内可完成解剖的范围内。根据操作经验，通常为3–15只蛹。有关黑色解剖皿的替代方案，请参见补充方法。
  3. 使用#5镊子将其中一只蛹推至黑色解剖皿底部，并调节显微镜的变焦和焦距，以清晰观察蛹体（图2C）。
  4. 用一把镊子夹住蛹的前端（图2D），再用另一把镊子的单侧尖端在腹部略微偏离中心的位置、紧靠胸部后方刺入，以固定蛹体，防止间接飞行肌（IFMs）移入腹部（图2E）。
    注意：从此时起开始计时解剖持续时间，即一旦蛹体完整性被破坏即开始计时。采用固定的解剖时长（例如20–30分钟），以尽量减少肌肉死亡及其相关的转录组和蛋白质组变化。在此时间段内尽可能多地完成解剖。
  5. 使用第一把镊子移除蛹壳的前半部分（图2F）。
  6. 使用同一把镊子在胸部后方夹住暴露的蛹体，并将腹部与胸部分离（图2G）。
  7. 用镊子轻轻挤压胸部前部（对于<35小时APF的样本），或撕开胸腔以暴露荧光标记的间接飞行肌（IFMs）（图2H）。由于早期时间点肌腱连接较脆弱，IFMs会容易从表皮脱离。使用镊子将剩余的残余组织推至解剖皿的另一侧并丢弃。
  8. 重复步骤2.3–2.7，继续解剖其他蛹。
  9. 用镊子收集IFM纤维，并将其整理成堆置于黑色解剖皿底部（图2I,J）。使用镊子将杂质推出视野范围以清除残留物。
    注意：经过练习后，镊子尖端可在不相互接触的情况下靠近。该技术可用于松散抓取IFMs而不造成损伤。其他可选方法包括用单侧尖端或完全闭合的镊子轻轻推动或提起IFMs，或连同部分脂肪或其他组织一并夹取IFMs，并在步骤2.10中所述方法去除脂肪。
  10. 使用镊子对IFM肌肉样本进行质量控制，去除样本中的非IFM肌肉、脂肪、几丁质外壳等杂质（图2K,L）。
    注意：使用Mef2-Gal4驱动时，在早期时间点IFM的荧光标记强度高于其他类型的肌肉（图2K,K'），因此可根据荧光强度和肌肉形态去除跳跃肌和幼虫肌肉。脂肪和几丁质组织外观不同，且不会被肌肉特异性荧光标记所标记（图2K,K'）。有关其他可标记IFM的Gal4品系，请参见讨论部分。
  11. 使用剪去尖端的移液器吸头，将成堆的IFMs转移至含有250 μL预冷1x PBS的1.5 mL微量离心管中（图2M-O）。随后立即进入第4节操作。
    注意：IFM样本可能因粘附在移液器吸头壁上而丢失。在收集IFMs前，将缓冲液反复吹打数次可降低普通吸头的粘附性；使用硅化处理或全氟烷氧基（PFA）吸头（见材料表），因其表面张力较低，有助于防止样本损失。

3. 48 h APF 后的 IFM 解剖

  1. 准备必要的设备，包括两把#5生物级镊子、精细剪刀、标准玻璃显微镜载玻片、双面胶带、移液器、移液器吸头、干冰，以及（用于RNA实验的）裂解试剂（见材料表）。将1×PBS和微量离心管置于冰上预冷。
  2. 使用略微湿润的画笔，将发育阶段明确的蛹转移至固定在显微镜载玻片上的双面胶带条上（图3A）。将蛹按相同方向排成一行（腹面朝下，前端朝向载玻片底部）。
    注意：注意不要在画笔或滤纸上使用过多水分，否则蛹无法牢固粘附。若蛹粘附不牢，可先将其转移至干燥的滤纸或纸巾上进行干燥处理。每次固定蛹的数量应控制在30分钟内可完成解剖的范围内，理想数量约为10只蛹。
  3. 将蛹从蛹壳中取出。用镊子轻轻分离并打开位于前气门上方的蛹壳（图3B）。
  4. 将一对镊子从背侧向后端轻轻滑动，随着镊子移动剪开蛹壳（图3B'）。注意避免刺破下方的蛹体。将蛹从打开的蛹壳中取出，并立即转移至另一张载玻片上的1×PBS液滴中（图3B",C）。
  5. 对排列好的所有蛹重复步骤3.3和3.4，然后将带有双面胶的载玻片暂时放置一旁。
  6. 使用精细剪刀将蛹的腹部从胸部切下，并推至一旁形成单独的堆（图3D,D'）。对剩余的蛹重复此操作。
    注意：从步骤3.6开始计时解剖持续时间，因为一旦蛹体完整性被破坏即应开始计时。应在20–30分钟内尽可能多地完成果蝇解剖，以防止细胞死亡及其相关的转录组和蛋白质组变化。在解剖1日龄成虫或>90小时蛹时，为便于后续操作，通常可额外使用精细剪刀去除头部。
  7. 用纸巾吸除大部分1×PBS（通常因悬浮脂肪而呈浑浊状）以及腹部组织堆（图3E）。向剩余的胸部组织中加入一滴新鲜且预冷的1×PBS。
  8. 使用剪刀沿身体纵轴从头部向下一次性将胸部纵向剪成两半（图3F,F'）。或者，若头部已被移除，可先将剪刀插入原头部连接处，沿IFM之间纵向剪开胸部上半部分，然后在同一方向进行第二次剪切，切开胸部腹侧。
  9. 对所有待解剖的蛹重复步骤3.7和3.8，在载玻片中央附近形成一堆胸部半切组织。确保载玻片上有足够的预冷1×PBS，以防止半切组织干燥。
    注意：在蛹发育48小时后（APF），间接飞行肌（IFMs）已足够大，经训练的观察者可在标准解剖显微镜下清晰识别。在此步骤中，若肌肉带有荧光标记，可将其转移至荧光解剖显微镜下以辅助IFM识别或用于培训目的，但此操作并非必需。
  10. 从胸部组织中解剖出间接飞行肌（IFMs）。使用#5镊子夹取其中一个半切胸部组织（图3G,H）。将一把镊子的尖端轻轻插入IFMs中段的上方和下方（图3G',H'）。保持第一把镊子不动，使用精细剪刀将IFM的一端从表皮和肌腱上剪下，然后将另一端也从表皮上剪离（图3G'',H''）。
    注意：根据首次切割后胸部的朝向，可将胸部旋转180°，以便更方便地进行第二次IFM切割。
  11. 用镊子将IFM束从胸部组织中取出（图3G''',H'''），转移至PBS液滴边缘，利用表面张力将其固定（图3I）。将残余组织推至载玻片的另一侧。对剩余的胸部半切组织重复此操作，收集解剖得到的IFMs。
    注意：若IFMs无法整齐堆叠，可用纸巾吸除部分1×PBS。注意避免PBS完全蒸发，并确保解剖后的IFMs和半胸部组织始终被缓冲液覆盖。
  12. 完成所有IFMs解剖后，迅速进行质量控制。使用#5镊子去除可能混入样本中的跳跃肌或表皮碎片（图3J-K''）。
    注意：跳跃肌在形态上与IFM不同。若在荧光下解剖Mef2-Gal4标记的肌肉，跳跃肌荧光较弱，且形状和质地不同；在普通光线下，其呈近乎透明状，而IFMs则为不透明的乳黄色（图3J-J'',K）。
  13. 利用液体表面张力，用一对镊子夹住解剖得到的IFMs（但不要压碎）（图3L）。将IFMs转移至预先装有250 μL预冷1×PBS的1.5 mL微量离心管中（图3M）。立即进入第4节操作。
    注意：当镊子尖端靠近并从缓冲液中提起时，液面张力会使缓冲液在镊尖间形成液泡。若IFMs位于该液泡中，则可随液泡被提起并轻松转移至另一个盛有缓冲液的容器中。操作时应轻压镊子使尖端接近但不接触，以避免压碎液泡中的组织。

4. 收集并保存 IFM 样本

  1. 将1.5 mL微量离心管在台式离心机中以2,000 × g离心3–5分钟，沉淀IFMs（图4A,B）。
  2. 使用移液器吸头吸除上清液（图4C）。
  3. 如用于RNA实验，将IFM沉淀重悬于50–100 μL所需的RNA提取缓冲液中（见材料表，图4D）。否则，进入步骤4.4。
    注意：IFMs可在步骤4.2后直接冷冻干燥，用于质谱分析或使用商业试剂盒提取RNA（见代表性结果）。对于RNA实验，立即将IFM沉淀重悬于提取缓冲液中并速冻，可获得更佳效果。
  4. 将样品置于干冰上或在液氮中快速冷冻（图4E）。随后于-80 °C保存，直至进行后续样品制备步骤。
    注意：冷冻保存后，样品可在数月内保持稳定，适合后续分析处理。

结果

上述解剖方案可用于从蛹壳形成后16小时（APF）至成虫阶段获取富含间接飞行肌（IFM）的样品。解剖所得的飞行肌样品可用于多种实验应用，目前已成功用于RT-PCR4,17、RNA-Seq16,32、ChIP36,37、Western blotting14,41以及质谱分析实验（见下文）。为了帮助潜在用户开展基于RNA的应用实验，我们首先展示我们的研究结果，重点说明从IFM中分离RNA时需特别注意的关键因素。为进一步展示本解剖方案的广泛适用性，我们随后以RNA结合蛋白Bruno1的研究数据为例，说明其在多种组学（-omics）研究中的可能应用。

IFM 解剖方案可获得高质量 RNA

预先确定需要解剖的果蝇数量非常重要，因为编码mRNA估计仅占总RNA的1–5%42。我们从1日龄成虫的间接飞行肌（IFM）中平均获得24 ± 9 ng的总RNA（图4F 和 补充图1A），且随着操作经验的积累，产量通常会有所提高。每只果蝇IFM所获得的总RNA产量相对恒定，在16小时APF、24小时APF、30小时APF、48小时APF、72小时APF和90小时APF时解剖的IFM中，RNA产量均在约25 ng范围内波动（图4F 和 补充图1B,D,E）。这些观察结果也可能反映了来自污染的脂肪、肌腱、气管或其他细胞类型的RNA，而这些污染物在较早时间点分离的样品中可能含量更高。因此，我们从50只果蝇的IFM中获得了>1 μg的总RNA，通常需解剖100−150只果蝇的IFM以获得>3 μg的总RNA用于RNA-Seq样本制备。

RNA 提取方法会影响所获得 RNA 的产量和质量，我们建议用户验证其提取方法。例如，使用方法 1 从 50 只 1 日龄成年果蝇的间接飞行肌（IFM）中平均可获得 1143 ± 465 ng 总 RNA，而使用不同商业试剂盒提取时，总 RNA 产量则在 186 ± 8 ng 至 1261 ± 355 ng 之间不等（图 4G 和 补充图 1C）。商业试剂盒提取的 RNA 通常质量良好（图 4H 和 补充图 1F），但产量较低表明 RNA 可能未能从柱子上有效洗脱。此外，如方法 2 所用的试剂盒可能导致 RNA 完整性受损（图 4H，第二个图），这可能与缓冲液成分和加热处理有关，导致严重的 RNA 断裂，从而影响后续实验。

在分离和处理RNA样本时，遵循无RNase污染的技术规范也非常重要。尽管冻融循环和4小时室温孵育对RNA完整性影响不大，但即使微量的RNase也会导致RNA迅速降解（图4I 和 补充方法）。建议操作过程中保持样本置于冰上，并尽量减少冻融次数，以防止RNA发生水解和断裂。虽然本实验中未观察到此类情况，但使用带滤芯的吸头和DEPC处理的缓冲液来避免RNase污染至关重要。

逆转录的效率也会影响下游应用的成功与否。在测试的三种商业逆转录试剂盒中，我们使用其中两种获得了可靠的结果，这两种试剂盒均能对核糖体基因rp49扩增出清晰的RT-PCR条带（图4J）。然而，RT试剂盒#2在检测低表达转录本时可能更为敏感，因为在所有三个生物学重复中，RNA结合蛋白bru1的扩增条带均更强（图4J）。综上所述，这些结果表明，采用本实验方案解剖分离的间接飞行肌（IFMs）能够获得高质量的RNA。

分离的间接飞行肌可产生高质量的 mRNA-Seq 和蛋白质组学数据

利用上述方案在30 h APF、72 h APF以及1日龄成虫果蝇中分离的IFM，我们先前已证明RNA结合蛋白及CELF1同源物Bruno1（Bru1, Arrest, Aret）在转录因子Spalt major（Salm）的下游调控一条IFM特异性的剪接通路16. 来自无功能突变体以及肌肉特异性突变体果蝇的IFMs bruno1 RNAi（bru1-IR表现出肌节生长缺陷、肌球蛋白活性失调，最终导致过度收缩和肌纤维丧失16,17下文我们展示了分离的间接飞行肌（IFMs）在全蛋白质组质谱分析中的应用价值，并证明在RNA水平上观察到的多种表达变化在蛋白质水平上同样显著。我们进一步强调了一个特定的发育相关剪接事件 Mhc 该结果表明，通过解剖分离的间接飞行肌（IFMs）进行mRNA-Seq和RT-PCR分析，可用于验证Bruno1对选择性剪接事件的调控作用。

根据文库的质量和测序深度，mRNA-Seq 数据可在基因单位水平（对一个基因的所有外显子的读段数进行平均）、单个外显子水平或剪接位点水平上进行分析。bru1-IR 飞行肌（IFMs）与野生型相比的 mRNA-Seq 数据显示，在基因单位水平上的表达变化较弱16（图5A）。在出蛹后72小时（72 h APF），一些对正常肌肉发育至关重要的肌节基因，如肌肉LIM蛋白60A [Mlp60A]、肌动蛋白57B [Act57B]、肌肉特异性蛋白300 kDa [Msp300] 或 Stretchin-Mlck [Strn-Mlck]，在 bru1-IR 肌肉中已呈现下调趋势（图5A 和 补充表1）。然而，我们先前已证明，在单个外显子水平上，特定肌节基因的同工型表现出更显著的下调16，提示Bruno1的主要功能是调控选择性剪接（补充表1）。

通过对分离的间接飞行肌（IFM）进行全蛋白质组质谱分析，我们可以在蛋白质水平上观察到类似的调控现象（图5B 和 补充表2）。在检测到的1,895个肽段组中，有524个（28%）在1日龄成虫的Bru1M2突变体IFM中出现表达失调（补充表2）。Strn-Mlck和Mlp60A蛋白的下调也得到观察，这与我们在mRNA-Seq数据中转录水平的结果一致。尽管数据库中能够比对到特定蛋白异构体的肽段数量有限（分析细节见补充方法），但对于肌节蛋白Tropomyosin 1（Tm1）、upheld（up/TnT）、Mhc、bent（bt/projectin）和Paramyosin（Prm），我们观察到某一异构体来源的肽段上调，而另一异构体来源的肽段下调（图5B），这证实了我们此前在RNA水平上观察到的类似调控模式16。上述结果表明，分离的IFM适用于mRNA-Seq和蛋白质组学研究。

为了进一步说明组学数据如何补充传统方法以增强和拓展生物学认知，我们选择聚焦于Mhc基因C末端的剪接现象。一条先前已表征的蛋白捕获品系weeP26插入在Mhc基因最后一个内含子中43,44（精确位置见补充方法）。weeP26含有一个强剪接受体，可被整合到几乎所有Mhc转录本中（图5C）。然而，在间接飞行肌（IFM）中，GFP标记的蛋白在M线两侧形成两个“点状”结构，而在腿部肌肉中，该蛋白则均匀分布于M线，并在粗肌丝上呈弱信号分布（图5E）。Orfanos和Sparrow的研究表明，IFM中的这些“点状”结构源于发育过程中的Mhc同工型转换：在48小时成蛹前（APF）表达的Mhc同工型会被GFP标记，因为weeP26外显子插入开放阅读框内；而在48小时APF之后表达的Mhc同工型则无标记，因为此时weeP26外显子位于3'-非翻译区（3'-UTR）的终止密码子下游44。

我们的 mRNA-Seq 数据使我们能够更详细地表征 Mhc C 末端亚型的表达。尽管已有研究报道了两种不同的 Mhc 终止方式43,44，但我们的 mRNA-Seq 数据及当前 Flybase 注释（FB2019_02）表明，Mhc C 末端实际上存在三种可能的可变剪接事件（外显子 34-35、34-36 或 34-37）（图 5C），该结果通过 RT-PCR 得到验证（图 5D）。weeP26 GFP 插入在外显子 36 与 37 之间的内含子中；因此，由于外显子 34-35 和外显子 34-36 亚型均含有终止密码子，GFP 仅能在外显子 34-37 亚型中翻译表达（形成外显子 34-GFP-37 融合产物）。我们进一步观察到所有 Mhc 亚型在时间和空间上的调控模式。在间接飞行肌（IFM）中，在 27 °C 条件下，我们发现 Mhc 亚型在 30 h APF 至 48 h APF 之间由外显子 34-37 转变为外显子 34-35（图 5C,D,F），尽管在 48 h APF 时免疫荧光尚未能检测到该变化（图 5E）。腿部在 30 h APF 时已表达外显子 34-37 与外显子 34-35 的混合物，并在 72 h APF 时表达全部三种 Mhc 亚型（图 5D,F）。成体跳跃肌（TDT）同样表达全部三种 Mhc 亚型（图 5F），提示管状体壁肌普遍存在此类表达模式。因此，我们的 mRNA-Seq 数据通过缩小 IFM 中 Mhc 亚型转换的时间窗口，并系统刻画管状肌肉中 Mhc 亚型的使用情况，拓展了先前的研究发现。

Mhc 亚型调控在 沙门菌 和 bru1 随后检测了突变体IFM，两种情况下均观察到失调现象 weeP26. 沙门菌 突变的间接飞行肌未能完成发育过程中的转换 Mhc 异构体表达并在后期阶段模拟腿部剪接模式，包括获得第34-36外显子事件（图5F这与先前的研究结果一致，即Salm的缺失会导致间接飞行肌几乎完全转化为管状肌。16. Bru1-IR 和 bru1 突变型 IFM，类似于 沙门菌-/- IFM 在成体阶段仍保留外显子 34-37 的剪接事件（图5E，F），从而产生一个 weeP26 GFP标记模式类似于腿部肌肉，但未获得外显子34-36事件。这表明Bruno1在间接飞行肌（IFM）中至少部分调控发育转换是必需的 Mhc 选择性剪接，但表明其他剪接因子在此过程中也存在异常调控 沙门菌属（Salmonella）-/- 此外，该实例说明了从分离的IFM中获得的RT-PCR和mRNA-Seq数据在深入理解发育过程中的剪接机制及所观察到的形态学缺陷方面具有重要价值。

IFM发育阶段示意图；GFP、肌动蛋白分析；果蝇蛹期阶段确定流程。
图1：间接飞行肌发育及蛹期阶段确定。（A）间接飞行肌（IFM）在羽化后24小时（APF）、32小时、48小时、72小时以及成虫1天时的发育示意图，显示飞行肌（绿色）在约32小时APF时开始致密化，随后肌纤维生长以填充整个胸部。肌腱呈深灰色。（B）固定后的IFM共聚焦图像，样本来自“摊开书本”式解剖（24小时、32小时、48小时）19 或胸部半切（72小时、1天），经鬼笔环肽-罗丹明染色标记肌动蛋白（品红色）和GFP（绿色）。（C,D）活体蛹中GFP荧光图像，显示解剖果蝇品系中完整的IFM形态，分别在背侧（C）或侧向（D）平面观察。星号（*）标示IFM位置。（E）为准备解剖，果蝇品系应提前3–4天翻瓶或设置杂交。（F）通过白色外观（黄色箭头）挑选前蛹，并用湿润的画笔分离（F'，F''）。（G）应对前蛹进行性别鉴定，依据是否存在精巢（表现为位于后端的透明球状结构，黄色星号）来区分雌雄。（H）将蛹置于湿润滤纸上，于60 mm培养皿中培养。比例尺 = 100 µm（B），1 cm（C,D,E,H），1 mm（F,F'',G）。请点击此处查看该图的放大版本。

IFM 解剖过程、GFP 成像、分步示意图、在 48 小时 APF 时分离并转移 IFM。
图 2：48 小时 APF 前 IFM 的解剖。（A）使用移液管向黑色解剖皿中加入 1× PBS 缓冲液。（B）使用画笔转移处于特定发育阶段的蛹。（C）在荧光解剖显微镜下观察 GFP，用 #5 镊子（灰色轮廓标示）轻轻将蛹推至解剖皿底部。“X”在圆圈中表示向图像内部的运动。（D,E）从前部夹住蛹（D），然后在胸部后方穿刺蛹体（E）。圆圈中的虚线表示无运动。（F,G）用前部的镊子牵拉（箭头所示），以去除蛹壳（F），随后去除腹部（G）。（H）对多个蛹重复步骤 C–G。黄色虚线框编号表示对应的蛹。（I, J）使用镊子（I）从周围组织中分离 IFM（J）。圆圈中的点表示运动方向朝向页面外。（K,L）去除包括脂肪组织和跳跃（TDT）肌肉在内的污染物（K），以获得干净的 IFM 样本（L）。TDT 肌肉的 GFP 表达水平低于 IFM 纤维，且形态不同（K'）。（M,N,O）使用剪切过的移液管头（M）收集已解剖的 IFM（N），并将其转移至微量离心管中（O）。比例尺 = 1 cm（A,B,M,O）、1 mm（C–G）、500 µm（H–L,N）。请点击此处查看该图的放大版本。

果蝇间接飞行肌（IFM）解剖，逐步分析流程。
图 3：羽化后 48 小时（APF）IFM 的解剖。（A）将蛹固定在双面胶带上。（B）通过从前端打开（B）、沿背侧剪开蛹壳（B'），并将蛹体取出（B''）。圆圈符号的含义与图 2相同。（C）将蛹转移至缓冲液中。（D）用剪刀剪除腹部（黄色双箭头）（D），并将腹部与胸部分离（D'）。（E, F）加入洁净缓冲液（E），然后沿纵轴将胸部切为两半（F, F'）。（G, H）解剖可在白光（G）或荧光下进行，以观察 GFP 信号（H）；先切开一侧的 IFM（G'），再切开另一侧（G''）；用镊子夹起胸部（灰色轮廓标示）（G'''）。（I, J, K）将 IFM 收集至缓冲液中（I），去除污染的腹神经索（VNC）、肠道和跳跃肌（TDT）（J），从而获得纯净的 IFM 样本（K）。TDT 的 GFP 表达水平较低，且形态与 IFM 肌纤维不同（J'', K'）。（L, M）使用镊子将 IFM 转移（L）至微量离心管中（M）。比例尺 = 1 cm（A, E, M），1 mm（B–D', F–L）。请点击此处查看该图的放大版本。

沉淀物保存与RNA提取；IFM解剖；离心、重悬、冷冻方法；RNA得率数据。
图4：IFM保存与RNA提取细节。（A）通过在2000 × g 条件下离心5分钟收集IFM沉淀。（B）IFM沉淀（箭头所示）及其在荧光下的图像（B'）。（C）使用移液器吸头完全去除所有缓冲液。（D）进行RNA提取时，将沉淀重悬于裂解缓冲液中。此步骤可跳过，以直接对解剖得到的IFM进行冻干冷冻保存。（E）将样品在液氮或干冰中速冻后，于-80 °C保存。比例尺 = 10 cm（A）、1 mm（B, B’）、1 cm（C, D, E）。（F）在16 h APF、24 h APF、30 h APF、48 h APF、72 h APF、90 h APF以及1日龄成虫阶段，每只果蝇解剖所得IFM的总RNA产量（纳克，ng）。误差线表示标准差（SD）。（G）使用不同提取方法从50只1日龄成虫果蝇解剖获得的IFM中提取的总RNA量。误差线表示标准差（SD）。（H）采用不同提取方法后检测RNA完整性的代表性电泳图谱。核糖体RNA条带位于2000个核苷酸（nt）略下方，标记物条带位于25 nt。更多图谱见补充图1。（I）新鲜提取RNA样品（上图）、在干冰上反复冻融25次的样品（第二幅图）、室温放置4小时的样品（第三幅图）以及经RNase A处理的样品（最下图）的代表性图谱。注意加入RNase A后RNA完全降解。（J）使用不同试剂盒进行RT-PCR的凝胶电泳结果，目标基因为bru1和rp49。下方图为bru1条带强度相对于rp49的归一化结果。误差线表示标准误（SEM）（非配对t检验，p = 0.0119）。请点击此处查看该图的放大版本。

mRNA测序与质谱数据比较、基因转录示意图、剪接事件结果。
图5：利用间接飞行肌（IFM）解剖研究Bruno1在选择性剪接中的功能。（A）在羽化后72小时（72 h APF）解剖获得的IFM中mRNA-Seq数据（基因单位）的火山图。在bru1-IR与野生型IFM之间显著差异表达的基因（padj < 0.05，abs(log2FC) >1.5）以蓝色显示，无显著差异的基因以灰色显示。肌节蛋白以红色突出显示，并对部分基因进行了标注。（B）来自1日龄成虫IFM的全蛋白质组质谱结果的火山图。在bruM2突变体与野生型之间显著差异的蛋白质（FDR < 0.05）以蓝色显示，无显著差异的蛋白质以灰色显示。肌节相关蛋白以红色突出显示。对应于（A）中基因的肽段以红色标注。映射到同一蛋白不同异构体的肽段组以相同颜色标注。（C）Mhc基因C末端结构示意图，展示不同的转录本异构体及weeP26基因捕获插入位点（插入位点详见补充方法）。RT-PCR引物以上方黑色线条表示。mRNA-Seq数据中每千碱基每百万碱基的读段数（RPKM）显示如下：野生型在30 h APF（橙色）和72 h APF（红色）解剖的IFM、bru1-IR（蓝色）和salm-/-（青色）在72 h APF解剖的IFM，以及72 h APF整条腿组织（绿色）。（D）针对Mhc基因的RT-PCR结果显示IFM在30 h APF与后续时间点之间的异构体转换。Exon 34-35剪接事件在bruM3突变体IFM或成虫腿部肌肉中仅微弱出现。（E）在48 h APF和90 h APF的野生型IFM肌节中以及90 h APF腿部肌肉中观察weeP26 GFP定位的共聚焦图像。比例尺 = 1 µm。（F）根据所标注的基因型和时间点，由mRNA-Seq数据得出的剪接位点定量结果。剪接连接读段表示为特定剪接事件（Exon 34至35为灰色，34至36为紫色，34至37为绿色）与共享Exon 34剪接供体的所有剪接事件总数的比值。请点击此处查看该图的放大版本。

RNA quantification and extraction chart; shows timepoint, method analysis, total RNA per fly.
补充图1： (A,B,C) 同一周内由同一研究人员分离的相同基因型样品的RNA得率。所有样品分离后，于同一天提取并测定RNA。（A）每只1天成年果蝇IFM分离组织获得的总RNA量（纳克，ng）。误差线＝标准误（SEM）。（B）在30 h APF、48 h APF、72 h APF及1天成年阶段，每只果蝇IFM分离组织获得的总RNA量。（C）从50只1天成年果蝇IFM组织分离后，采用不同提取方法获得的总RNA量。D) 每只果蝇分离得到的腿部、跳跃肌（TDT）和间接飞行肌（IFM）中的总RNA浓度。从体积较大的IFM中可获得更多的RNA。误差线 = 标准差（SD）。E) 对照组与RNAi或突变体样品在30小时APF、72小时APF及成虫1天时解剖获得的间接飞行肌（IFM）中每只果蝇的总RNA浓度。对于突变体，w1118 用作野生型对照。突变体数据汇总自 bru1-IR, 沙门菌属（Salmonella）-/- 以及另一种RNA结合蛋白突变体。需要注意的是，由于肌肉萎缩和组织丢失，这些操作在1天成虫中的RNA得率会降低，因此需要解剖更多的果蝇以获得组学分析所需的足够数量。误差线 = 标准差（SD）。F）其他电泳条带显示了所示RNA分离方法的RNA完整性 图4G 以及在 补充图1C. 请点击此处以查看此图的放大版本。

果蝇饲养与GFP分析；荧光显微镜、培养条件、实验步骤。
补充方法：本文中所使用方法与试剂的详细说明，特别是用于生成图1A-D、图4F-K、图5、补充表1以及补充表2中所示数据的方法。这些数据为解剖方案的设计提供了依据，并展示了该方案在RNA提取、mRNA测序、RT-PCR及蛋白质组学研究中的实用性。请点击此处下载该文件。

与正文图5及相关段落相关
标签名称数据摘要
Sarcomere ProteinsSpletter 等人发表于 Elife 2018 的研究中列出的肌节基因；此处列出了当前的 FBgn 编号和基因名称。
SP gene units_DESeq2_72h基于 Spletter 等人发表于 EMBO Rep 2015 的数据，我们重点分析了在 72 h APF 时点的 mRNA-Seq 数据中的肌节基因。该分析使用 DESeq2 方法检测对照组（Mef2-Gal4, UAS-GFM-Gma 与 w1118 杂交）与实验组（Mef2-Gal4, UAS-GFM-Gma × Bruno1-IR）之间在基因单位水平上的差异表达。以黄色高亮的行表示显著上调或下调的基因（log2FC 绝对值超过 1.5 的阈值）。这些数据对应于图5A中的红色圆点叠加。对于每个肌节基因，我们提供了标识符信息、DESeq2 得到的 log2FC 值、P 值和校正后的 P 值，以及 DESeq2 标准化的表达计数。
SP exon_DEXSeq_72h基于 Spletter 等人发表于 EMBO Rep 2015 的数据，我们重点分析了在 72 h APF 时点的 mRNA-Seq 数据中肌节基因的外显子使用情况。该分析使用 DEXSeq 方法检测对照组（Mef2-Gal4, UAS-GFM-Gma 与 w1118 杂交）与实验组（Mef2-Gal4, UAS-GFM-Gma × Bruno1-IR）之间的外显子使用差异。以黄色高亮的行表示显著上调或下调的外显子（log2FC 绝对值超过 1.5 的阈值）。我们提供了外显子和基因的标识符信息、DEXSeq 得到的 log2FC 值、P 值和校正后的 P 值，以及相关转录本的列表。
请注意，在 DEXSeq 分析中，许多基因显示出一个或多个外显子的调控，通常具有较高的 log2FC 值和较低的 P 值/校正 P 值，而在 72 h APF 时仅有少数基因在整体表达水平上发生变化。这表明 Bruno 缺失对选择性剪接的调控具有显著影响。

补充表1：72小时成虫前体期（APF）肌节蛋白mRNA-Seq数据表，用于鉴定差异表达基因 (通过 DESeq2) 和外显子 (通过 DEXSeq) 在 bru1-IR 与野生型间接飞行肌。

与正文图5B及相关段落相关
标签名称数据摘要
Perseus 输出此为一份经处理的数据表格，展示了用于生成图5B的质谱数据。IFM样本来源于1天成年对照（w1118）和突变体（bruno1-M2）果蝇。重要列包括每个样本4个重复的转换后强度值、t检验统计量及显著性、肽段ID及其对应的基因名称和Flybase ID。显著性使用Perseus中的标准设置计算（FDR<.05）。共检测到1859种蛋白质/肽段，其中524种（28%）在样本间存在显著差异。
下调这些是来自Perseus输出中在bruno1-M2突变体IFM中下调的全部252种蛋白质/肽段。由于原始Flybase ID和基因名称已过时，我们额外提供了当前的Flybase基因ID和基因名称。
上调这些是来自Perseus输出中在bruno1-M2突变体IFM中上调的全部272种蛋白质/肽段。由于原始Flybase ID和基因名称已过时，我们额外提供了当前的Flybase基因ID和基因名称。
请注意，图5B中以红色突出显示的肌节蛋白存在于上述列表中。属于肌节的基因列表可在补充表1的一个标签页中找到。

补充表2：来自1天成虫的全蛋白质组质谱数据表，用于鉴定差异表达的蛋白质及蛋白质异构体 bruM2 突变体 与野生型间接飞行肌。

讨论

在本实验方案中，我们介绍了从早期和晚期蛹中解剖Drosophila间接飞行肌（IFM）的基本技术，以用于后续分离蛋白质、DNA、RNA或其他大分子。该方案可轻松调整，用于成年果蝇IFM的解剖。我们展示了本解剖方案在mRNA-Seq、蛋白质组学和RT-PCR应用中的实用性。随着组学技术的不断进步，使得对起始材料更少、输入浓度更低的样本进行分析成为可能，此类解剖操作未来可能在更多研究领域中发挥重要价值。由于IFM是研究人类肌病4,24和肌肉类型特异性发育9,12的成熟模型，我们预期该技术可进一步应用于IFM富集的代谢组学分析、通过3C或4C技术研究染色质构象、通过CLiP相互作用评估剪接网络，或肌原纤维生成过程中的磷酸化蛋白质组学研究。

需要注意的是，这些解剖操作所获得的样品富含间接飞行肌（IFM），而非纯的间接飞行肌样品。由于运动神经元的支配、肌腱附着以及气管对肌纤维的侵入，这种情况不可避免。可以利用生物信息学分析来鉴定在IFM中富集的基因或蛋白质，但仍需进一步实验以证明其确实为IFM特异性表达。样品纯度可通过已发表的组织特异性标志物进行检测，例如Stripe45（肌腱）、Act79B4,44（管状肌）、Act88F15（IFM）或syb46（神经元特异性）。或许可利用这些标志物对数据集进行标准化处理，以校正IFM特异性成分的含量差异，但需注意，用于标准化的基因（例如IFM特异性基因或微管蛋白基因）在不同时间点的表达变化可能会影响该方法的准确性。

近年来已开发出多种基于基因编码的组织特异性标记方法，例如用于分离RNA的EC标记法47,48或PABP标记法49,50，这些方法有助于获得真正具有组织特异性的RNA样本。然而，EC标记法需要持续饲喂果蝇47，因此无法应用于蛹期阶段。PABP标记转录组的灵敏度和完整性可能存在一定局限性51。由于间接飞行肌（IFMs）细胞体积大且具有合胞体特性，采用FACS方法分离单个肌纤维较为复杂。类似INTACT52,53的技术可用于从IFMs中分离特定的亚细胞结构，这可能有助于纯化IFM细胞核或线粒体群体。目前，手工解剖仍是大多数下游应用中获取完整IFM组织的常规标准方法。

样品质量取决于解剖过程中的多个关键步骤。解剖操作在技术上具有较高要求，随着经验积累，解剖速度和样品纯度会逐步提高。在无去垢剂的预冷缓冲液中进行较短时间（20–30 分钟）的解剖，并立即冷冻样品，有助于保持样品完整性，这一点在此前的小鼠肌腱分离研究中已有报道54。在去除沉淀中所有缓冲液后，可成功对间接飞行肌（IFM）进行干冻保存；但若专门用于RNA提取，将样品在裂解缓冲液中冷冻通常可获得更优结果。在进行RNA或蛋白质提取前，可合并最多20次独立解剖所获得的IFM样品，从而实现样本扩增，即使对于早期时间点或突变体样本，也能收集到足够的材料用于后续分析16,32。

对于RNA相关应用，最关键的步骤可能是RNA本身的分离。硫氰酸胍-苯酚-氯仿法（上述方法1）的性能优于大多数经过测试的商业试剂盒，且如前所述，成本显著更低55。商业试剂盒在RNA提取得率上表现出的变异性，与以往的研究结果一致56,57。我们在异丙醇沉淀步骤中进一步加入糖原，以帮助回收全部RNA。除了RNA得率外，验证RNA完整性也十分重要，以确保样本在解剖和提取过程中未发生片段化或降解。此外，必须在无RNase的环境中操作。最后，逆转录（RT）试剂盒的选择会影响逆转录过程的灵敏度。尽管这些因素并不总是被详细讨论，但它们均会影响IFM样本的质量以及下游应用所获得数据的可靠性。

本方案与现有的间接飞行肌（IFM）解剖方案相比，具有几项重要改进。尽管已有详细的IFM免疫荧光解剖方案19，但本方案采用了一种不同的蛹期解剖方法，可更快速地分离IFM组织。这使得在较短的解剖时间内相对高效地收集大量IFM组织成为可能，从而避免蛋白质组或转录组发生改变。其他方案描述了成虫IFM的解剖，用于观察单个肌原纤维中的GFP染色39，或幼虫体壁肌的染色58，但并未涉及蛹期阶段的解剖，也未针对RNA或蛋白质的提取进行优化。本方法也不同于现有的从冷冻切片中显微解剖蛹期IFM的方案38，后者可能获得更纯净的IFM样本，但操作更为耗时且产量较低。与其他快速成虫IFM解剖方案38,39相比，本方法在不含去垢剂的PBS缓冲液中分离IFM，以限制应激反应的诱导及其他显著的表达变化。

本方案的关键改进在于引入了活体荧光报告基因，使得能够在蛹发育早期阶段分离间接飞行肌（IFM）。我们通常使用Mef2-GAL459驱动UAS-CD8::GFP或UAS-GFP::Gma60。这种方法可实现IFM的差异标记（飞行肌的标记强度更高，形态也与其他蛹期肌肉不同），并可用于开展基于GAL4-UAS系统的遗传操作，例如基因挽救或RNAi实验。此外，也可将Mef2-GAL4 与tub-GAL80ts联用，以避免RNAi导致的早期致死，或与UAS-Dcr2联用以提高RNAi效率40。

另有其他GAL4驱动子或GFP标记品系可供选择，其在肌肉类型特异性、时间表达模式和驱动强度方面各不相同19,61，可替代Mef2-GAL4使用。例如，Act88F-GAL4在羽化后约24小时（APF）才开始表达，因此不能用于更早的时间点；然而，它对间接飞行肌（IFM）具有强标记能力，可能有助于避免RNAi相关的早期致死效应。Him-GFP或Act88F-GFP也可标记IFM，但同样存在时间限制，其优势在于标记表达不依赖GAL4系统，因此在与感兴趣的突变背景联用时可能更具优势。其他潜在标记品系的列表已有报道19。还应注意，使用转基因和GAL4/UAS系统可能导致基因表达的人为假象，因此必须设置适当的对照，例如将驱动子品系与野生型背景品系杂交，以确保所有样本中此类假象保持一致。

通过配套视频，本详细方案旨在使蛹期间接飞行肌（IFM）解剖技术更易于掌握，推动组学方法在肌肉发育研究中的应用。结合强大的 果蝇 通过分离的间接飞行肌（IFM）可开展遗传学、细胞生物学以及生物化学和组学检测，这有望促进对肌发生机制和肌肉功能的深入理解。未来将转录组和蛋白质组调控的系统水平观测与代谢及功能输出相关联的研究，将有助于更深入地理解肌肉类型特异性发育以及肌肉疾病的发病机制。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢Andreas Ladurner和Frank Schnorrer提供的大力支持。感谢Sandra Esser提供的出色技术协助，以及Akanksha Roy在生成质谱数据方面的贡献。我们感谢布卢明顿和维也纳果蝇资源中心提供果蝇品系。感谢慕尼黑大学生物医学中心（LMU Biomedical Center，Martinsried，德国）的生物成像核心设施在共聚焦显微成像方面的帮助，以及蛋白质分析中心实验室（Zentrallabor für Proteinanalytik）对质谱样品的分析。本研究得到了德国研究基金会（Deutsche Forschungs Gemeinschaft，MLS，项目编号SP 1662/3-1）、慕尼黑路德维希-马克西米利安大学的整合蛋白质科学中心（CIPSM，MLS）、Frederich-Bauer基金会（MLS）以及国际马克斯·普朗克研究学院（EN）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5x 高保真（HF）缓冲液赛默飞世尔科技F518L
60 mm 培养皿Sigma-AldrichZ643084-600EAGreiner 培养皿，60 mm × 15 mm，带透气孔
黑色解剖皿（玻璃）奥古斯塔劳动力需求42021010骨盆，黑色玻璃，4 cm × 4 cm
黑硅解剖皿：活性炭粉Sigma-AldrichC9157也可在大多数药店购买到
黑硅解剖皿：Sylgard 184Sigma-Aldrich761036将Sylgard（约50 g）与活性炭粉末（200 mg）混合，倒入培养皿中（约4个60 mm培养皿），固化成盘。
蓝色研钵杵Sigma-AldrichZ359947-100EA任何可灭菌的研钵研杵，也可与电机驱动的研磨器配合使用
手机摄像头，三星 Galaxy S9三星SM-G960F/DS用于非显微镜下拍摄的照片
氯仿PanReac AppliChemA3691,0500
共聚焦显微镜，Leica SP8X 直立式共聚焦显微镜Leicawww.leica-microsystems.com
共聚焦显微镜，蔡司 LSM 780 倒置共聚焦显微镜Zeisswww.zeiss.com
双面胶带Scotch/3M3M ID 70005108587双面胶带，大多数办公用品供应商均有售
Dumont #5 镊子Fine Science Tools11252-20Inox 直头尖端 11 厘米镊子，生物级，尖端尺寸 0.05 毫米 × 0.02 毫米
乙醇（100%，RNase free）Sigma-Aldrich32205-M
荧光解剖显微镜相机，Leica DFC310 FX 相机Leicawww.leica-microsystems.com
荧光解剖显微镜软件，Leica Application Suite (LAS) 版本 4.0.0Leicawww.leica-microsystems.com
荧光解剖显微镜，Leica M165 FCLeicawww.leica-microsystems.com
果蝇：Bru1[M2]果蝇品系；本文
果蝇：Bru1[M3]果蝇品系；本文
果蝇：Mef2-GAL4布卢明顿果蝇资源中心BDSC:27390果蝇品系
果蝇：salm[1]布卢明顿果蝇资源中心3274果蝇品系
果蝇：salm[FRT]果蝇品系；参见 Spletter 等，Elife，2018
果蝇：UAS-Bru1IR维也纳果蝇研究中心GD41568果蝇品系，RNAi发夹结构
果蝇：UAS-GFP::Gma布卢明顿果蝇资源中心BDSC:31776果蝇品系
果蝇：UAS-mCD8a::GFP布卢明顿果蝇资源中心BDSC:5130果蝇品系
果蝇：w[1118]布卢明顿果蝇资源中心3605果蝇品系
果蝇：weeP26果蝇品系；参见 Clyne 等，Genetics，2003
GFP检测试剂，GFP-BoosterChromoTekgba488-100
糖原Invitrogen10814-010
图像处理软件，Photoshop CS6Adobewww.adobe.com
异丙醇Sigma-AldrichI9516-25ML2-丙醇
方法1（RNA提取）：TRIzolLife Technologies15596018异硫氰酸胍和苯酚单相溶液
方法2（RNA提取）：方法1 + TURBO DNA-free试剂盒InvitrogenAM1907TRIzol 提取后使用试剂盒去除 DNA
方法3（RNA提取）：Direct-zol RNA Miniprep Plus试剂盒Zymo ResearchR2070S使用TRIzol提取RNA，但采用商用柱法而非相分离法。建议使用Monarch DNase I在Monarch DNase I反应缓冲液中进行DNase处理。
方法4（RNA提取）：RNeasy Plus Mini KitQiagen74134我们采用了提供的DNase处理方法。按照动物组织的建议，将IFM沉淀在RTL缓冲液中进行匀浆。
方法5（RNA提取）：ReliaPrep RNA组织微量提取系统PromegaZ6110我们应用了该方案以 ‘从纤维组织中纯化RNA’.
方法6（RNA提取）：Monarch总RNA小量提取试剂盒新英格兰生物实验室T2010G我们采用了适用于组织/白细胞的方案，并在300中进行裂解 μRNA保护剂L
微量离心管赛默飞世尔科技AM12400无RNase的微量离心管，1.5 mL
显微镜载玻片赛默飞世尔科技12342108标准载玻片，未带电，1 毫米
切片机刀片PFM Medical207500003C35 羽毛 80 毫米
Monarch DNase INew England BiolabsT2004-21
Monarch DNase I 反应缓冲液New England BiolabsT2005-21
正常山羊血清赛默飞世尔科技16210072
OneTaq 聚合酶New England BiolabsM0480X
画笔马腊布1910000000Marabu Fino 圆头 0 号画笔，或任何美术用品品牌的类似画笔
多聚甲醛Sigma-Aldrich158127
PBS缓冲液（1×）Sigma-AldrichP4417用于配制1 L溶液的磷酸盐缓冲液片剂，pH 7.4
PFA PureTip 吸头Elemental ScientificES-7000-0101可选替代标准移液器吸头以减少样品损失；100 mL，0.8 mm 孔径
Phusion高保真聚合酶赛默飞世尔科技F-530XL
移液器吸头Sigma-AldrichP5161通用 200 mL 吸头
Preomics iST 8x 试剂盒PreomicsP.O.00001用于质谱分析的多肽制备试剂盒
Q Exactive 质谱仪赛默飞世尔科技725500质谱分析在慕尼黑大学生物医学中心蛋白质分析单元进行
Qubit RNA 定量检测试剂盒Life TechnologiesQ32855
罗丹明-鬼笔环肽Invitrogen，Molecular Probes10063052
RNA浓度 方法1 & RNA 完整性检测，Bioanalyzer安捷伦科技G2939BA
RNA浓度测定方法2：Nanodrop赛默飞世尔科技ND-2000
RNA浓度测定方法3：Qubit 4荧光计InvitrogenQ33238
RNA Pico 芯片安捷伦科技5067-1513
RNase APromegaA7937
无RNase水，焦碳酸二乙酯（DEPC）Sigma-AldrichD5758DEPC 处理水过夜，然后高压灭菌，以去除所有 RNase。
RT试剂盒#1：Super Script III反转录酶试剂盒Invitrogen18080-044逆转录试剂盒
RT试剂盒 #2：LunaScriptNew England BiolabsE3010S逆转录试剂盒
RT试剂盒#3：QuantiNova反转录试剂盒Qiagen205410逆转录试剂盒
封片缓冲液，VectashieldVector LaboratoriesH-1200含 DAPI
统计分析软件：GraphPad PrismGraphPad Prismwww.graphpad.com
统计软件：Microscoft Excel微软作为 Office Home 套餐的一部分购买 & 学生 2019
台式离心机Eppendorf5405000760Eppendorf Centrifuge 5425 或同等型号离心机
组织/吸水纸Sigma-AldrichZ188956标准组织擦拭纸
移液管Sigma-AldrichZ350796塑料移液管
Triton-X100Sigma-AldrichT9284-500ML
万纳斯弹簧剪Fine Science Tools15000-003 mm 切割刃，尖端直径 0.05 mm，长度 8 cm
沃特曼滤纸Sigma-Aldrich1004-070滤纸圆片，4号，70 mm

参考文献

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