成像人类免疫学突触

摘要

该协议图像免疫突触形成和随后的极化分泌流量对免疫突触。细胞结合形成于超抗原脉冲拉吉细胞（作为抗原呈现细胞）和Jurkat克隆（作为效应帮助剂T淋巴细胞）之间。

摘要

该方法的目的是生成免疫突触 （IS），这是抗原呈现细胞 （APC） 和效应帮助器 T 淋巴细胞 （Th） 细胞形成的细胞到细胞结合的示例，并记录对应于IS 的形成和随后的贩运事件（在 APC 和 Th 细胞中发生）。这些事件最终将导致在IS的极化分泌。在此协议中，使用葡萄球菌肠毒素 E （SEE） 脉冲拉吉细胞作为细胞突触模型，由于该实验系统与生物现实（Th 细胞-APC 突触结合）的接近性，因此使用 Jurkat 细胞提出质疑。此处介绍的方法包括细胞与细胞结合、延时采集、广域荧光显微镜 （WFFM），然后是图像处理（采集后去卷积）。这提高了图像的信号噪声比 （SNR），提高了时间分辨率，允许在新兴的突触偶联物中同步采集多个荧光铬，并减少荧光漂白。此外，该协议与端点细胞固定方案（甲醛、丙酮或甲醇）完美匹配，从而允许进一步的免疫荧光染色和分析。该协议还与激光扫描共聚焦显微镜 （LSCM） 和其他最先进的显微镜技术兼容。作为主要警告，只有那些与 Z 轴对焦平面的 90° 角的 T 单元-APC 边界（称为 IS 接口）才能正确成像和分析。存在其他实验模型，可简化 Z 维度中的成像和以下图像分析，但这些方法不模拟 APC 的复杂、不规则表面，并可能促进 IS 中的非生理交互。因此，这里采用的实验方法适合复制和对抗IS发生的一些生物复杂性。

引言

该方法的主要目标是生成免疫突触 （IS） 细胞对细胞的偶联体，由与 SEE 超抗原和效应器 Th 细胞脉冲的抗原呈现细胞 （APC） 形成，并登记与免疫性突触形成的第一阶段和随后的贩运事件（在 APC 和 Th 细胞中发生）对应的图像，最终导致在 IS 中发生极化分泌。在APC上，T淋巴细胞结合其细胞受体（TCR）与与MHC-II结合的抗原，建立了IS，组织了一个极其动态、可塑性和关键性的实例，涉及抗原特异性、体液和细胞免疫反应^1、2。IS的定义是形成一种特殊的超分子活化复合物（SMAC）模式，其特征是行为恢复过程^3。当由T淋巴细胞与APC构建IS时，分泌囊泡对IS的极化似乎与突触间隙的极化分泌有关。这种集中的机械似乎明确地为免疫系统提供一个极好的调节策略，以提高T淋巴细胞的关键分泌作用的功效，同时减少旁观者细胞的非特异性细胞因子仲裁刺激，杀死不相关的靶细胞和通过活化诱导细胞死亡（AICD）4的凋亡自杀。

IS 的后果因 T 淋巴细胞和 APC 的性质而异。Th细胞（通常为CD4+细胞）与显示与MHC-II相关的抗原的APC的突触接触产生T细胞的激活（细胞因子分泌、增殖等），在某些情况下，通过AICD⁴凋亡。对于与呈现与MHC-I相关的抗原的APC相互作用的细胞毒性T淋巴细胞（CTLS）（主要是CD8+细胞），结果在抗原的CTL的前期刺激与否上有所不同。因此，在APC上识别抗原-MHC-I复合物的天真CTL被"注"摧毁目标细胞和分裂。引信CTL还与目标细胞（即受病毒或肿瘤细胞感染的细胞）建立突触，产生抗原特异性细胞灭绝^5、6。

免疫突触的外泌体极化分泌是相关免疫反应中一个不断发展和具有挑战性的研究领域^。已经证明，携带宫内囊泡（IV）的多面体（MVB）在TCR刺激下，在TCR刺激下，经历向IS^8、9（视频1）的极化运输。这些MVB在突触膜的融合诱导其脱粒和释放的IlVs作为外征体到突^{触裂8，10。}这发生在由Th型Jurkat细胞形成的IS中，这些细胞受到作为APC^11、TCR刺激^CD4+淋巴细胞和充注CTL的SEE超抗原涂层拉吉细胞的挑战。因此，Jurkat细胞的突触构成了研究外泌体极化分泌流量的宝贵模型。此外，几十年的研究表明，许多对TCR信号的基本见解来自与转化的T细胞系的研究，事实上，这些模型系统最广为人知的是Jurkat白血病T细胞系^12。

一个完全发达的IS的形成产生几个关键的生物结果，包括激活Th细胞，激活天真的CTL或目标细胞杀死由底质CTL，除了过敏或AICD^5。因此，有两种主要类型的分泌IS由T淋巴细胞建立，导致非常多样化，但同样关键的免疫效应功能^{1，6，13。}一方面，来自底质细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）的IS导致溶性颗粒（从秒到几分钟）的快速极化（从秒到几分钟）对IS。裂解颗粒的去颗粒诱导分泌穿孔和颗粒酶到突触裂^14，这是亲凋亡分子。分泌的穿孔和粒酶随后诱导杀死目标细胞^15，16。CTL开发临时突触，只持续几分钟，因为目标细胞被谋杀^3，17。这可能是由于最佳CTL任务需要快速和临时接触，以便向许多目标细胞^3，17分发尽可能多的致命打击。相反，像Jurkat细胞这样的淋巴细胞产生稳定，长期IS（从10-30分钟到小时），因为这似乎是必要的定向和不断分泌刺激细胞因子^3，17。细胞因子也封装在分泌囊泡中，其中一些（即IL-2，IFN-+）体验极化传输到IS¹⁷和分泌。IS 的一个基本特征是在 T 细胞和 APC（视频 1）之间形成探索性、弱性和瞬态接触，这些接触可能产生更强的相互作用，并建立成熟的 IS，前提是 TCR 识别共性抗原-MHC 复合物，并建立适当的共同激励连接⁵。初始接触的开始和成熟、完全高效的IS的建立，本质上都是随机的、快速的和异步的过程^5，18。此外，在创建细胞到细胞结合¹⁹时，频率很少，这可能对成像技术构成挑战（请参阅结果和讨论部分）。

在检查微管组织中心 （MTOC） 和 T 淋巴细胞中的分泌颗粒的极化时，另一个主要挑战是整个过程速度快（秒到分钟），特别是在 CTL 中。 考虑到这些事实，大多数早期方法都面临一个终点策略，其中APC/目标细胞和T淋巴细胞通过低速离心联合混合并收敛，以利于细胞对细胞结合的创造，孵育几分钟，固定，然后评估将MTOC和/或分泌囊泡移至^IS20。这种方法有两个重大的局限性:没有获得生动的贩运数据，并获得了高水平的背景MTOC/分泌颗粒极化，这可能是由于IS建立¹⁸的随机性质。此外，TCR刺激的初始信号事件（即细胞内钙升高、肌酸重组）和分泌囊泡极化之间的任何相关性都存在问题。因此，在活细胞中适当成像IS的强制性规定结合起来，加强细胞与细胞结合物化，同步IS的产生，并在可能的情况下，保证在定义的显微镜XY场和Z位置建立细胞结合。为了避免所有这些问题，已经制定了若干战略。解释这些方法及其优点和弱点是本文的职权范围。请参考先前发表的评论，处理这些要点^{1、4、5、21。}

由淋巴细胞制成的IS是寿命长的事实，并且在Th淋巴细胞中MTOC、含淋巴素的分泌颗粒和MVB需要几分钟到几个小时才能移动并停靠到IS^22，这使得Th-APC IS成为使用本文所述协议进行成像的理想候选者。

方案

1. 准备幻灯片以粘附拉吉细胞

1. 将每口井中150 μL的纤维素（100μg/mL）加入8微井室滑动（塑料底室滑动），并在37°C下孵育30分钟至1小时。这种粘附基板将允许Raji细胞结合到井底（步骤2），与Jurkat细胞（步骤4）细胞形成活体结合，以及延时显微镜捕获（步骤6），并在之后与可选的甲醛（PFA）固定（步骤7）兼容。
   注:对于丙酮固定，使用玻璃底室幻灯片和聚L-流水（20微克/mL），而不是纤维蛋白，因为丙酮溶解塑料。8 微井室滑动（1 厘米²井，最大体积 300 μL）或等效物是灵活和适当的格式。
2. 使用 200 μL 自动移液器吸气纤维化，用 200 μL 的 PBS 清洗每个井 2 分钟，轻轻摇动。再重复一次。在此阶段，腔室滑块可在 4°C 下与 PBS 一起存储 1-2 周。

2. 拉吉细胞粘附在室幻灯片和7-氨基-4-氯甲基胆素（CMAC）标签上

1. 将 Raji 细胞的预培养（1-2 x¹⁰ 6 细胞/mL）的 10 mL 转移到 15 mL V 底管中。混合良好，使用10μL计算Neubauer腔室或等效细胞。
2. 在室温下，在300 x g下将剩余的细胞离心5分钟。吸气并丢弃上清液。
3. 在暖完整培养基中轻轻重新悬浮细胞颗粒（RPMI 1640辅以10%FCS、2 mM谷氨酰胺、10 mM HEPES、100 U/mL青霉素和100μg/mL链霉素），浓度为10⁶细胞/mL。使用下面给出的公式:
   （* 起始_x V_初始= =₌最终的 x V_最终），其中 =_初始表示初始细胞浓度，V_初始= 细胞悬浮的初始体积，=_最终= 最终细胞浓度，V_最终= 细胞悬浮的最终体积。
   注:根据起始培养基的细胞浓度，可以收集超过所需细胞的细胞，但重要的是将培养基中剩余的细胞（37°C）保持到实验结束，以防止潜在的问题（参见步骤2.6）。
4. 标记 Raji 细胞，以便在突触结合形成期间进行识别。在本实验中，步骤2.4.2中执行7-氨基-4-氯甲基古马林（CMAC）标签。
   1. 将培养基中的拉吉细胞数量转移到 2 mL 管中。对于 8 微孔室滑动，总共需要 1.6 mL 的电池悬架（每孔 200 μL）。
   2. 将CMAC添加到10μM的最终浓度中。由于CMAC对光敏感，因此用铝箔覆盖管，使细胞保持在黑暗中。每 1 厘米²井需要包含 2 x 10⁵拉吉细胞的 200 μL。因此，如果需要准备8口井，则需要1.6 x 10⁶ Raji细胞。
      注:使用细胞跟踪器蓝色（CMAC、紫外线激发和蓝色发射）标记Raji细胞，在形成突触结合时，使其与Th细胞区别开来。这种染料与PFA和丙酮固定剂兼容，允许进一步的免疫荧光程序。尽量避免轻的阐述。在带有CMAC的池中标记Raji细胞，然后重新悬浮，然后将拉吉细胞粘附到纤维素涂层室幻灯片上，确保不同井间具有CMAC的Raji细胞的均质标记。
5. 重新悬浮CMAC染色细胞，并在从步骤1.2的腔室滑动中吸入PBS后，将200μL的细胞悬浮液转移到步骤1.1-1.2中制备的纤维素涂层腔室滑道的每个孔。在 37°C 下孵育腔室滑动，5% CO_2，30分钟-1 小时。
   注:粘附和 CMAC 标签将在此步骤中同时出现，从而节省时间。请注意，Raji 细胞会迅速沉淀，在播种前，需要谨慎，以保持细胞悬浮液中的均匀浓度。现阶段无需通过离心清洗 CMAC，因为 CMAC 洗涤在步骤 2.7 中更容易完成（当标记的 Raji 细胞已粘附在腔室幻灯片上时）。由于CMAC存在于细胞悬浮量中，过量存在，蓝色荧光背景过高，无法区分蓝染色细胞。在 CMAC 洗涤后检查步骤 2.7 中的细胞 CMAC 荧光。
6. 通过在显微镜上轻轻摇动腔室滑动，确保 Raji 细胞粘附在井底。确保单元格之间显示间隙且不汇合（图 1，中间面板）。50-60%的细胞汇合是适当的。
   1. 如果大多数细胞有效地粘附在腔室滑动上，并且没有观察到细胞间隙，则用暖完整的介质清洗每个孔，用200μL自动移液器重新悬浮介质以分离细胞过剩。在每个重新悬浮步骤后检查汇合。
   2. 如果细胞不粘附，重复粘附步骤，增加附着力时间和/或细胞数。
      注:可以在这里停止，在37°C，5%CO₂过夜（O/N）孵育腔室滑动，并在第二天继续执行协议。请在第二天确认Raji细胞保持粘附状态，并使用荧光显微镜贴上CMAC标签。
7. 再次用热补充 RPMI 小心清洗每个井，以消除多余的 CMAC，并使用荧光显微镜检查蓝色排放（图1）。
   注:为了避免使用浸入油（粘性和粘性）和高数值孔径油物，可以使用超长距离（即 20x 或 40x）物镜使用荧光显微镜快速检查 CMAC 标签。

3. CMAC的脉搏 – 贴有葡萄球菌肠毒素 E 的 Raji 细胞

1. 在每个井中添加葡萄球菌肠毒素E（SEE，1微克/mL）。SEE 可在细胞培养基（工作溶液在 100 μg/mL）中从 SEE 冷冻液（PBS 中为 1 mg/mL）中方便地稀释。每200μL微井使用100倍工作溶液的2μL。
   警告:此步骤使用手套，并将用过的尖端放入生物危害箱中。
2. 在 37°C、5% CO₂下孵育腔室滑动至少 30 分钟。SEE 效果至少持续 3-4 小时。
   注:如果需要，如果计划不同的延时设置（步骤 5）和/或根据结束点实验的开始时间点（步骤 6），可以在不同时间点将 SEE 添加到井中。

4. 朱尔卡特细胞的制备

1. 在此实验中，使用以前生长的Jurkat细胞培养（1-2 x 10⁶细胞/mL）。使用来自标准培养瓶的电池或以前根据标准电穿孔协议进行转染的细胞，如前^所述23。Jurkat细胞的转染将允许活细胞中分泌颗粒的分泌物流量的时移可视化。例如，当GFP-CD63（MVB的标记）表示GFP-CD63修饰囊泡的运动可以记录（视频1）。
2. 在相对比显微镜下观察细胞。如果死细胞过多（>20-30%）观察，使用标准协议²⁴执行Ficoll密度梯度离心，以消除死细胞（死细胞比活细胞密度更高）在使用前过剩（参见讨论）。
3. 将细胞转移到15 mL管V底管，并使用10 μL使用血细胞计进行计数。
4. 如步骤 2.2 所述，使剩余的细胞离心。使用新鲜、温暖的培养基，丢弃上清液并重新悬浮与Raji细胞（1 x 10⁶/mL）相同的浓度。按照步骤 2.2-2.3 操作。
5. 在等待步骤 4 时，在培养基中保持 Jurkat 细胞（37 °C，5% CO_2）。
   注:在第二个选项（转染）中，活细胞的数量将大大低于第一个选项。因此，考虑使用较高的起始细胞培养量，以便有足够的细胞进行实验。从 10 x 10⁶ Jurkat 细胞每个电穿孔和转染， 只有 2-4 x 10⁶ Jurkat 细胞将生存后 48 h 转染和其中一些细胞将丢失在 Ficoll 步骤.因此，一个电穿孔的二甲子通常足以挑战8个微孔（需要1.6 x 10⁶转染Jurkat细胞）的粘附的SEE脉冲拉吉细胞。

5. 拉吉和朱尔卡特细胞的共同播种

1. 从步骤 3.2 中，将包含 CMAC 标记、SEE 脉冲、粘附拉吉细胞的腔室幻灯片从培养箱中拿出来。在此阶段无需清洗 CMAC，因为以前在步骤 2.7 中这样做。
2. 使用自动 200 μL 移液器，从井的一角小心地吸出每口井的培养基。不要让井中的介质完全干燥。
3. 立即用步骤 4.5 中制备的细胞培养基 （1 x 10 6 /mL） 中重新悬浮的 Jurkat 细胞 （1 x 10⁶/mL） 替换该培养基。如果执行时差成像，请立即执行此步骤步骤 6，因为 Jurkat 细胞往往会沉淀并很快形成突触结合。为方便起见，含有SEE脉冲、粘附的Raji细胞的微孔在此阶段未接受Jurkat细胞的播种，应使用细胞培养基维持，直到随后对Jurkat细胞提出质疑。这将灵活地允许随后的挑战与Jurkat细胞额外的时间推移或反向动力学，终点实验方法。
4. 如果要执行时间间隔，请快速执行步骤 6。这涉及在显微镜阶段培养箱上共培养1-2小时，或在37°C，5%CO_2，允许突触共聚形成和同时图像采集。如果端点分析，但没有时间推移，则在固定细胞之前（步骤7）之前，使用显微镜（如图1）在共培养期后检查共培养形成。

6. 新兴突触偶联的时移成像

1. 在成像前准备显微镜和孵育室。对于视频 1 中显示的示例，详细的显微镜设置如图2 所示。
   注:如果计划进行时移实验，则应在将 Jurkat 悬架添加到带有粘附 Raji 细胞的腔室滑块之前，准备所有显微镜设置和补充（环境细胞培养室等）。商用显微镜（材料表）描述了以下步骤。然而，可以使用任何配备细胞培养箱的倒置荧光显微镜。
   1. 成像偏振流量时，使用具有 60 倍油浸、高数值孔径的显微镜。
   2. 确保自动对焦系统已打开并调整偏移以对连接到底部表面的 Raji 单元。请参阅图1、视频 1和视频 2。
2. 在 Jurkat 在步骤 5.3 中加入包含粘附的 Raji 细胞的每个井后，快速在预热的（1-2 h） 显微镜级培养箱（即 OKOlab）上定位微井室幻灯片，并选择一些 XY 位置，即其位于可能记录一个新兴的IS形成，例如，一个Jurkat转染的细胞落入显微镜焦点。
3. 使用预热显微镜级培养箱，因为观察到温度稳定阶段保持稳定的X，Y，Z位置。方便的 XY 字段的标准是:聚焦良好且未融合的 Raji 细胞（即，显示细胞之间的间隙）和转染的 Jurkat 细胞的存在（这可以通过结合透射和 UV 或 GFP 通道进行检查）。Jurkat细胞会非常迅速地（几分钟）沉积在腔室幻灯片上，并且图像出现突触的机会会随着时间而减少（图1）。有可能在规定的时间间隔后完成实验，或者继续步骤7，并修复结合物，以便进行后续的免疫荧光和分析。
   注:可以从多达 4 个不同的微井中选择多达 16 个不同的显微镜场，以适当的时间分辨率（每帧 1-2 分钟）进行同步多井延时采集。限制取决于要成像的各种荧光铬的数量和强度（影响相机的展示）（取决于表达的荧光蛋白的数量，除了CMAC）。提高帧速率的一种方法是记录 CMAC 通道在 GFP 的每个"n"时间帧中的一个（即 n = 8，如图2所示），因为 Raji 细胞粘附在井底，并且不会轻易作为 Jurkat 细胞移动。此外，这有利于细胞的生存能力，因为频繁的紫外线照射可能会损害细胞。尝试将时间帧速率调整到每 1 分钟或更少 1 帧（即视频 1中每帧 20 秒，图 2），因为 MVB 的极化需要几分钟到几小时才能完成。配备电动表氟炮塔和适当的带通荧光过滤器或等效器的显微镜是执行这种多通道捕获所必需的。

7. 突合和固定的终点形成

1. 如果只计划进行端点实验（1-2 小时孵育，允许突触结合形成是适当的），在 37°C 孵育腔室滑动，5% CO₂进行 1-2 小时。 在这种情况下，孵育不需要显微镜级培养箱。有关示例，请参阅视频 3。
2. 要修复细胞，请用不带FCS的温暖RPMI（37°C）介质轻轻摇动洗井（血清中的白蛋白可能沉淀丙酮固定）。吸气，并在每口井中加入200 μL的PFA或预冷却丙酮。分别在室温 （RT） 或冰上孵育室滑动 20 分钟。
   注:对于丙酮固定，在-20°C前冷却丙酮，在4°C时预冷室滑动。当丙酮用于固定 8 口井玻璃底室幻灯片中培养的细胞时，请取下塑料盖。
3. 用PBS清洗每口井两次，并加入200μL的淬火溶液（PBS，50 mM NH₄Cl）。在 4°C 下孵育造型室滑动。
   注:在此阶段，室滑块可在4°C下至少停留一个月，然后执行免疫荧光方案，如描述⁸所述。盖子防止蒸发。

8. 图像处理

1. 执行延时序列和/或固定单元的静止照片的采集后图像去卷积（即惠更斯去卷积或等效材料表）。通过采用适当的软件（即，在惠更斯中使用"广域"光学选项）和正确的光学参数来进行解说。去卷积需要显微镜⁴的测量点扩散函数（PSF）的图像处理。
2. 或者，使用该软件通过自动加载显微镜文件中的元数据中包含的光学参数来计算理想化的PSF。这些光学参数包括荧光铬波长、折射率、物位数值孔径和成像技术（共聚焦、宽场等）⁴.
3. 随后，成像软件在一步一步的累积计算过程中使用PSF和多种反卷积算法（即惠更斯软件中的QMLE和CMLE），其结果比用户需要时可以连续可视化和停止（或恢复）。在此阶段，用户可以更改卷积和/或信噪比的数量，并恢复反卷积。去卷积软件与时差系列 （X，Y，T） （视频 2）和 Z 堆栈 （X，Y，Z） （视频 3） 配合良好。脱脂通道随后被合并到CMAC，原始通道，因为细胞，漫射氟铬没有改善的去卷积^4，9。

结果

我们遵循了所述协议，以生成 Jurkat-Raji 免疫突触结合，并正确成像 IS 形成的早期阶段。我们的目标是改进先前所遵循的²⁰种早期方法，以研究MTOC和分泌机制对IS的两极分化。这些方法基于一个最终点策略，不允许对IS形成或早期突触事件进行成像，因为在这些策略中，IS的形成义务发生在混合、离心细胞的颗粒中，而不是显微镜上。我们的协议旨在避免这一主要警告，因为该方法基于使用适当的细胞浓度（步骤 2 和步骤 3），以利于在安装在预热显微镜阶段培养箱（步骤 4）的显微镜室幻灯片（8 微孔室幻灯片）上形成细胞对细胞 IS 结合。此策略诱导 IS 形成，同时到延时成像捕获 （视频1）。

图 1显示了按照协议（步骤 5.2）获得的突触 Jurkat-Raji 偶联体。图像表示具有代表性的延时实验的第一帧。2 x 10⁵拉吉细胞和 2 x 10⁵ Jurkat 细胞添加到 1 厘米²井中。上面板显示发射通道，中间面板由 CMAC（蓝色）通道（Raji 单元）组成，下面板显示两个透射通道加上 CMAC 合并通道。黄色箭头标记一些突触结合，作为参考，而绿色箭头表示由一个Jurkat细胞和几个拉吉细胞（复杂偶联体）制成的突触结合。降低细胞浓度（1 cm²孔中的10⁵或更少细胞）将绕过复杂细胞结合的形成，但可能没有足够的细胞偶联物用于后续的极化交通分析（见下文），这反过来也会减少发现和成像新出现的突触偶联体的机会。

图 2显示了与用于同时捕获两种不同荧光铬（CMAC 和 GFP-CD63）的成像参数对应的屏幕截图，这些屏幕截图是在与视频 1对应的代表性时间推移实验中使用适当的软件（即 NIKON NIS_AR）。

视频1（免疫突触，生）代表一个Jurkat T淋巴细胞表达GFP-CD63（多面体标记-MVB，绿色囊泡）和形成双突触之间的1Jurkat细胞和2个Raji细胞与CMAC标签，蓝色（其中一个经历吞没）。记录了MVB在Jurkat细胞内同时向突触区域移动（GFP-CD63每20秒捕获帧速率1帧;视频再现速度=每2帧）。突触结合得到并成像遵循上述协议（步骤6.2），允许对新出现的突触进行成像（视频1）。使用适当的软件（即 NIS-AR、材料表）同时捕获 GFP-CD63 和 CMAC 荧光通道。该视频表示来自代表性的延时实验的原始数据。自动对焦系统针对绑定到玻璃底部的 Raji 细胞进行了适当的偏移，以确保实验沿线有一个稳定的对焦。

视频 2（免疫突触，在去卷积后）对应于视频 1，但 GFP-CD63 荧光通道图像的去卷积是通过使用适当的去卷积软件（即惠更斯），使用"宽场"光学选项和适当的光学参数（步骤 8）执行的。此分散的通道随后被合并到 CMAC 原始通道。信号噪声比和图像锐度的改善是显而易见的。如上文所述，去卷积是在采集后进行的。有关去卷积软件的具体细节，请参阅⁴。

视频 3（免疫突触，修复后和免疫荧光染色）表示在协议步骤 6（丙酮固定）之后的固定 IS 结合的 Z 堆栈（z 步长大小 = 0.8 μm，5 帧）。固定后，免疫荧光按照标准协议²⁵执行，使用Phalloidin可视化F-actin（绿色），抗CD63可视化MVB（品红色），抗β-图布林可视化MTOC（红色）。CMAC（蓝色）标记拉吉细胞。随后，结合器通过显微荧光成像，并使用"广域"光学选项和适当的光学参数（步骤7）对多个通道进行解波。随后，分散的通道被合并到CMAC，原始通道，如不同面板所示（CMAC加透射-TRANS、CMAC加法洛丁、CMAC加抗CD63和CMAC加抗α-图布林）。白色箭头标记突触，而绿色箭头标记 MVB，黄色箭头标记 MTOC。MVB和MTOC极化的详细定量已解释在其他地方^25。

这里介绍的方法涉及形成细胞到细胞的偶联体，同时通过广场荧光显微镜（WFFM）进行延时采集，然后进行图像处理（采集后去卷积）。这种策略提高了图像的信号噪声比（SNR），提高了图像的时间分辨率，并允许在新兴的突触结合⁴中同步采集几个荧光铬。此外，该协议与后续的端点细胞固定方法（甲醛、丙酮或甲醇）完美匹配，这将允许进一步的免疫荧光染色和分析^25（视频3）。该协议还与激光扫描共聚焦显微镜和其他最先进的显微镜技术兼容。

图1:突触结合的代表性双尺寸显微镜领域。图像表示协议后具有代表性的延时实验的第一帧。上面板显示透射通道、中间面板 CMAC 通道（Raji 单元）和下面板均合并通道。黄色箭头标记一些突触结合，作为参考。绿色箭头表示复杂的突触结合（即，一个 Jurkat 细胞建立具有多个 Raji 细胞的突触）。以 40x EWD （0.6 NA） 目标捕获。请点击此处查看此图的较大版本。

图2:延时显微镜设置。图像对应于几个屏幕截图，对应于用于使用适当的软件（即 NIKON NIS_AR）同时捕获两种不同荧光铬（CMAC 和 GFP-CD63）的成像参数的屏幕截图，该实验与视频 1相对应的代表性时差实验。GFP-CD63 通道的每个帧每 20 s 捕获一次。在GFP通道的八帧中，只有一帧的UV通道被捕获，以保持实验沿线的细胞活力。请点击此处查看此图的较大版本。

视频1:由表达GFP-CD63的Jurkat细胞（原始数据）制作的免疫突触。用细胞追踪器蓝色（CMAC，蓝色）标记的Raji B细胞用SEE脉冲30分钟，形成表达GFP-CD63⁸的Jurkat细胞的突触。捕获了与 GFP-CD63 和 CMAC 通道对应的延时（每帧 20 秒;视频再现速度 = 2 帧/秒），并展示了一个代表性的示例。以 60 倍计划 APO （1.4 NA） 目标捕获。请点击此处查看此视频（右键单击下载）。

视频2:在去卷后由表达GFP-CD63的Jurkat细胞制作的免疫突触。与视频1相同，但图像使用反卷积软件进行解压缩。通过消除焦点荧光中的污染物，信号噪声比的改善和锐度增强。请点击此处查看此视频（右键单击下载）。

视频3:固定和免疫染色免疫突触。该图显示了《议定书》第7步和随后的免疫荧光后具有代表性的固定突触结合。CMAC（蓝色）标签raji细胞，透射（TRANS）显示突触结合（白色箭头），Phalloidin标签F-actin（绿色），抗CD63标签MVB（洋红色，绿色箭头）和反-图布林标签MTOC（红色，黄色箭头）。这些通道通过荧光成像，如所示，被解压缩和合并。该视频包括 Z 堆栈（z 步长大小 = 0.8 μm，5 帧）。白色箭头标记突触接触区域，而绿色箭头标记 MVB，黄色箭头标记 MTOC。请点击此处查看此视频（右键单击下载）。

讨论

该协议的一个限制是，并非所有突触都理想地垂直于光轴。使用这种技术，没有办法预测和/或影响免疫突触成像的理想方向。为了解决这个问题，我们从后续分析中排除了所有最终不符合理想条件的随机捕获的突触。这些突触，恰到而受，不是非常频繁。然而，可以使用几种实验方法⁴来规避这种限制。

极化CD63释放（去粒化）可以通过其他补充技术量化，如CD63（CD63重新定位到细胞表面）在活细胞（不固定，不渗透），步骤6后，以及后续的洗涤和固定，如前^所示8。此外，CD63释放在外体体^8，9和外体定量通过纳米粒子跟踪分析^9，25可以执行。这些方法当然与我们的协议兼容，前提是在活细胞的细胞表面免疫荧光后进行固定。

我们发现理想的细胞数量（对于 8 井室幻灯片中的 1 厘米²井）是 4 x 10⁵细胞（2 x 10⁵拉吉细胞和 2 x 10⁵ Jurkat 细胞），因为它们有效地粘附在井底。将效率与塑料（使用纤维奈丁）或玻璃底部（使用聚L-流水）微滑轨结合通常不是问题。较高的细胞数可能在粘附细胞之间产生间隙，随后产生复杂的突触结合（图1）;当单细胞与细胞结合需要在MTOC或分泌颗粒极化实验中成像时，这两种情况都是不可取的。细胞数量减少可能会降低发现偶联体的机会，特别是当转染的Jurkat细胞受到APC的挑战以产生突触时。请注意，我们观察到，在协议出现之前，显微镜X/Y级上的温度稳定级培养箱（即提前1-2小时稳定舞台/显微镜设置）保持稳定的X、Y、Z参数，这对正确的成像至关重要。自动对焦系统最终将补偿小 Z 变化。

当某些基因转导技术，如电穿孔用于表达荧光嵌合蛋白（即GFP-CD63）在Jurkat克隆（视频1），相当一部分细胞可能在电穿孔后死亡。这可能是一个问题，因为虽然死细胞不形成突触，但当它们超过活的，转染细胞，他们可能会干扰由活的Th细胞形成的结合的形成。我们发现，在结合形成步骤之前，按照标准协议使用密度梯度介质，仔细消除转染培养物中的死细胞，确实可以增加正确成像偶联的机会。此外，转染效率低（<20%）这可能是一个重要的警告，因为这，结合一个适度的结合形成效率（约^60%）25，将减少发现由转染细胞制成的偶联体的概率。当非转染细胞用于在端点实验和随后的固定中获得偶联物时，这不是问题。8 微井室幻灯片与传统的免疫荧光方案兼容。这提高了上述协议的灵活性，目的也不同。使用带塑料底井的室滑梯时，使用丙酮固定可能是一个需要考虑的问题。然而，有市售的8个微井显微镜室幻灯片，含有玻璃底部，与丙酮固定兼容。当丙酮用于固定在 8 微井玻璃底室幻灯片中培养的细胞时，请取下塑料盖。

建议显微镜配备电动 XY 级、电动外荧光炮塔和自动对焦系统（例如，完美对焦系统）或等效补充剂。当需要多井采集^时，自动对焦系统将确保整个实验的对焦稳定。以往的经验表明，通过在Raji细胞上建立适当的焦点偏移，可以补偿XY多点实验中T细胞的运动（视频1）和显微镜级/室滑动运动。对于多井延时捕获来说，这确实很方便。

使用了黑白、全色和冷却带电耦合器件 （CDD） 摄像机，但灵敏度更高，荧光科学互补金属氧化物半导体 （sCMOS） 摄像机是可取的，因为这将减少摄像机的曝光时间，并增强时间分辨率。我们使用的短相机曝光时间（排名形式 100 ms 到 500 ms）与自动荧光快门相结合，允许长时间捕捉时间（高达 24 小时），具有足够的时间分辨率（每分钟 1 帧或更少，最多 16 个 XY 位置），而不会显著出现荧光漂白和/或细胞活力损失。电动级允许多点（XY）捕获，并增加了在理想方向上发现和成像正在出现和发育的突触的机会，但也允许在多孔腔室幻灯片中采集图像，当不同的Jurkat克隆需要同时结合²⁵时。为了在分析分泌颗粒的流量时获得最佳结果，目标（即60倍，1.4）的高数值孔径是必要的。

RAJI-SEE-Jurkat是一个成熟的免疫突触模型，自最初描述¹¹以来，已被无数的研究人员使用。我们已经根据这个模型调整了我们的协议，以便正确描绘IS形成的早期阶段。我们的目标是改进先前所遵循的²⁰种早期方法，以研究MTOC和分泌机制对IS的两极分化。值得注意的是，与该协议的偶联在突触产生F-actin重组，配置一个规范的SMAC，并伴随MVB极化流量^25。这些关键事件也分析和验证由共聚焦显微镜^25。

不同类型的IS之间存在极化交通的动力学差异。例如，来自 CTL 的溶酶颗粒的极化传输在几秒钟或非常几分钟内发生，而来自 Th 淋巴细胞的几种含细胞因子的囊泡需要几分钟到几个小时才能完成。为了设计最佳策略和选择最合适的实验和成像方法，必须事先考虑这些时间差异，因为对于某些成像策略（即激光扫描共聚焦显微镜 （LSCM）），时间可能是一个限制因素，因为捕获时间远远高于适当的时间分辨率（1 分钟或更少）⁴。当使用宽场荧光显微镜 （WFFM） 时，这不是一个限制，如上文协议所述。由于在CTL中，MTOC对突触的极化只持续几分钟^{3，6，17，}不同的特定状态的显微方法不同于这里描述的（但具有更高的空间和时间分辨率）是必要的，以正确成像这些突触26，27，主要是当几个显微镜场（多点捕获）被成像。这些高分辨率的新方法也可用于成像由Th淋巴细胞的突触，虽然经济和/或后勤原因（即，其中一些成像技术所需的核心设备成本比这里描述的6-7倍以上）肯定构成这些最先进的成像方法⁴的限制。事实上，由淋巴细胞产生的IS是长寿的，并且在Th淋巴细胞中MTOC，含淋巴素的分泌囊泡和MVB需要几分钟到几个小时，运输和停靠到IS^22，使该协议成为成像Th-APC IS的理想，负担得起的方法。

WFFM 与采集后图像反卷积相结合是一种有趣的方法，而不仅仅是支持此战略的经济原因。通过使用采集后图像反卷积^4（将视频 1与视频 2进行比较），可以改进 Z 轴中固有的差分辨率（该技术最重要的警告）。反卷积采用基于计算的图像处理方法，可以提高信噪比和图像分辨率，对比度²⁷倍到2倍，XY轴为150-100nm，Z轴⁴为500nm。

使用高灵敏度、高读出速度和宽动态范围的新型荧光 sCMOS 摄像机将提高图像质量，并减少荧光漂白。此处描述的细胞与细胞结合协议提供的灵活性允许将所述细胞方法与多种最先进的显微镜技术相结合，无论是在活细胞中，还是在固定细胞中，以及预期结果确实会提高我们对免疫突触的认识。

尽管我们已经使用易于处理、成熟的细胞系实现并验证了该协议，但当使用初生T细胞和不同类型的抗原呈现细胞（如巨噬细胞的树突状细胞）时，这种方法可能允许更多的生理相互作用可视化^。在此背景下，该协议也进行了扩展和验证，使用超抗原（SEB）脉冲小鼠EL-4细胞系用作APC，以挑战原虫T淋巴细胞^9。事实上，初级T淋巴细胞，特别是CTL，呈现了更短寿命和动态突触接触（参见参考⁹的补充视频8）那些看到与SEE-Raji和Jurkat模型。对于在二维体外组织等价物中与树突状细胞或B细胞的初级T细胞相互作用，可以最好地看到突触接触模式的变异性，也可以使用该协议进行记录和分析。此外，除了超抗原，该技术还可用于成像其他类型的突触。例如，它可用于TCR转基因、抗原特异性T细胞模型，例如使用奥巴平特异性鼠OT1/OT2系统，或通过转染具有抗原特异性T细胞受体的T细胞。这为近期的未来提供了无数的实验可能性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
相机 尼康 DS-QI1MC	尼康	MQA11550	冷却相机头
CMAC	ThermoFisher Scientific	C2110	细胞追踪器蓝色
JURKAT 细胞	ATCC	ATCC TIB-152	效应器 T 淋巴细胞
μ-玻片 8 孔 ibiTreat， μ-玻片 8 孔玻璃底	IBIDI	Cat.No：80826、80827	细胞培养和细胞成像支持
显微镜 NIKON Eclipse Ti-E	尼康 NIKON	Eclipse Ti-E	宽视场荧光，配备完美聚焦系统（PFS）选项
物台培养箱，带3通道手动气体混合器和气体起泡器/湿度模块	OKOLAB	H201-NIKON-TI-S-ER	细胞培养气氛
Raji 细胞	ATCC	ATCC CCL-86	APC
RPMI 培养基 GIBCO	ThermoFisher Scientific	21875034	培养基
链球菌肠毒素 E （SEE）	Toxin Technology， Inc	EP404	细菌毒素
软件 Huygens Essential	SVI	Huygens Essential	Image Deconvolution 软件
ImageJ	NIH	Image J	Image 软件
Nikon NIS-AR	Nikon	NIS-Elements AR	图像捕获和分析软件