本方案用于成像免疫突触的形成过程以及随后向免疫突触定向的分泌性物质运输。细胞 conjugates 由经超抗原刺激的 Raji 细胞（作为抗原呈递细胞）与 Jurkat 克隆细胞（作为效应辅助性 T 淋巴细胞）相互结合形成。
本文内容
摘要
摘要
本方法旨在生成免疫突触（IS），即由抗原呈递细胞（APC）与效应辅助性T淋巴细胞（Th细胞）形成的细胞间连接结构，并记录IS形成初期以及随后在APC和Th细胞中发生的运输事件的相应图像。这些事件最终将导致在免疫突触处发生极化分泌。在本实验方案中，采用经肠毒素E（SEE）脉冲致敏的Raji细胞刺激Jurkat细胞作为细胞突触模型，因为该实验系统更接近于生物学真实情况（即Th细胞与APC之间的突触连接）。本方法包括细胞间连接、时间序列图像采集、宽场荧光显微镜（WFFM）观察以及图像处理（采集后去卷积）。该流程可提高图像的信噪比（SNR），增强时间分辨率，实现对新生突触连接中多种荧光染料的同步采集，并减少荧光淬灭。此外，本方案与终点细胞固定方法（如多聚甲醛、丙酮或甲醇固定）高度兼容，便于后续进行免疫荧光染色与分析。该方案同样适用于激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）及其他先进显微成像技术。主要局限在于，只有那些沿Z轴方向与焦平面呈精确90°角的T细胞-APC边界（称为IS界面）才能被准确成像和分析。虽然存在其他可简化Z轴成像及后续图像分析的实验模型，但这些方法无法模拟APC复杂的不规则表面，可能导致IS中出现非生理性的相互作用。因此，本研究所采用的实验方法更适合再现并研究免疫突触中发生的一些生物学复杂性。
引言
该方法的主要目标是生成由经SEE超抗原刺激的抗原呈递细胞（APC）与效应性Th细胞形成的免疫突触（IS）细胞间共轭物，并记录免疫突触形成的初始阶段以及随后在APC和Th细胞中发生的囊泡运输事件的相应图像，这些过程最终将导致在免疫突触处的极化分泌。当T淋巴细胞的T细胞受体（TCR）与APC表面MHC-II分子所呈递的抗原结合后，免疫突触的建立构成了抗原特异性体液和细胞免疫应答中一个高度动态、可塑且至关重要的环节1,2。免疫突触的特征是形成一种特殊的超分子活化复合物（SMAC）结构，该结构伴随着肌动蛋白的重排过程3。当T淋巴细胞与APC形成免疫突触后，分泌性囊泡向免疫突触区域的极化现象被认为参与了突触间隙的极化分泌。这种定向的分泌机制似乎为免疫系统提供了一种高度调控的策略，既能增强T淋巴细胞关键分泌效应功能的效率，又能减少对旁观者细胞的非特异性细胞因子介导的激活、对无关靶细胞的杀伤，以及由活化诱导的细胞死亡（AICD）所导致的细胞自我凋亡4。
免疫突触（IS）的效应取决于T淋巴细胞和抗原提呈细胞（APC）的性质。辅助性T细胞（通常为CD4+细胞）与提呈MHC-II-抗原复合物的APC形成突触接触，可导致T细胞活化（如分泌细胞因子、增殖等），在某些情况下还可通过活化诱导的细胞死亡（AICD）4引发凋亡。而对于与提呈MHC-I-抗原复合物的APC相互作用的细胞毒性T淋巴细胞（CTLs，主要为CD8+细胞），其效应取决于CTL是否预先被抗原刺激。因此，初始CTL识别APC表面的抗原-MHC-I复合物后会被"致敏"，从而获得杀伤靶细胞和增殖的能力。致敏后的CTL还可与靶细胞（例如病毒感染细胞或肿瘤细胞）形成突触，介导抗原特异性的细胞清除5,6。
在免疫突触处外泌体的极性分泌是一个正在发展且具有挑战性的研究领域，涉及重要的免疫应答7。研究表明，在抗原刺激T细胞受体（TCR）后，携带腔内小泡（ILVs）的多泡体（MVB）会向免疫突触（IS）发生极性运输8,9（视频 1）。这些MVB与突触膜融合后发生脱颗粒，将ILVs以外泌体形式释放至突触间隙8,10。该过程已在Th型Jurkat细胞与经SEE超抗原包被的Raji细胞（作为抗原呈递细胞，APC）相互作用形成的免疫突触、TCR刺激的CD4+淋巴母细胞以及致敏的CTL中观察到11。因此，Jurkat细胞形成的突触是研究外泌体极性分泌运输的有价值模型。此外，数十年的研究表明，许多关于TCR信号转导的重要发现均来源于转化T细胞系的研究，其中最广为人知的模型系统便是Jurkat白血病T细胞系12。
完全成熟的免疫突触（IS）的形成会产生多种关键的生物学效应，包括激活Th细胞、激活初始细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）或由致敏CTLs杀伤靶细胞，此外还包括无能（anergy）或活化诱导的细胞死亡（AICD）5。因此，T淋巴细胞可建立两种主要类型的分泌性免疫突触，介导功能上高度不同但同样重要的免疫效应功能1,6,13。一方面，致敏的细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）形成的免疫突触可诱导裂解性颗粒（称为"分泌性溶酶体"）在数秒至数分钟内快速极化至免疫突触区域。裂解性颗粒脱颗粒后，将穿孔素和颗粒酶分泌至突触间隙14，这些分子具有促凋亡作用。分泌的穿孔素和颗粒酶随后诱导靶细胞死亡15,16。CTLs形成的突触是短暂的，仅持续数分钟，因为靶细胞很快即被杀伤3,17。这可能是因为CTL发挥最佳功能需要与多个靶细胞快速、短暂地接触，以尽可能多地传递致死性打击3,17。相比之下，Th淋巴细胞（如Jurkat细胞）则形成稳定且持久的免疫突触（持续10–30分钟甚至数小时），因为这种稳定性似乎对刺激性细胞因子的定向和持续分泌是必需的3,17。这些细胞因子也包裹在分泌性囊泡中，其中部分（如IL-2、IFN-γ）会极化运输至免疫突触并被分泌出去17。免疫突触的一个重要特征是T细胞与抗原呈递细胞（APC）之间形成探索性、弱且短暂的接触（视频1），当T细胞受体（TCR）识别相应的抗原-MHC复合物并建立适当的共刺激连接时，这些初始接触可能发展为更强的相互作用，并最终形成成熟的免疫突触5。初始接触的启动以及成熟且具有完全功能的免疫突触的建立，本质上都是随机、快速且不同步的过程5,18。此外，细胞间共轭结构（cell-to-cell conjugates）的形成频率较低19，这可能对成像技术构成挑战（详见结果与讨论部分）。
在研究T淋巴细胞中微管组织中心（MTOC）和分泌颗粒极化时，另一个主要挑战在于整个过程非常迅速（数秒至数分钟），尤其是在细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）中。鉴于这些特点，早期大多数研究采用终点分析策略：将抗原呈递细胞（APC）/靶细胞与T淋巴细胞混合后，通过低速离心促进细胞间形成共轭结构，孵育数分钟后固定样本，再评估MTOC和/或分泌囊泡向免疫突触（IS）的重定位情况20。该方法存在两个显著局限性：无法获得动态运输数据，且背景水平的MTOC/分泌颗粒极化程度较高，这可能是由于IS形成具有随机性所致18。此外，研究TCR刺激引发的早期信号事件（如胞内钙离子升高、肌动蛋白重组）与分泌囊泡极化之间的相关性也十分困难。因此，对活细胞中免疫突触进行适当成像的关键要求包括：增强细胞间共轭结构的形成、同步IS的生成，并在可能的情况下，确保细胞共轭结构在显微镜预设的XY平面和Z轴位置上稳定建立。为克服上述问题，已发展出多种策略。本文不拟详述这些方法及其优缺点，相关内容请参阅此前发表的综述文献1,4,5,21。
Th 淋巴细胞产生的免疫突触（IS）具有较长的持续时间，且在 Th 淋巴细胞中，微管组织中心（MTOC）、含淋巴因子的分泌颗粒以及多泡体（MVB）迁移并锚定到免疫突触所需时间从数分钟至数小时不等22，这使得 Th-抗原提呈细胞（APC）免疫突触成为采用本文所述方案进行成像的理想对象。
方案
1. 准备用于黏附Raji细胞的载玻片
- 向8孔塑料底培养板的每个孔中加入150 µL纤连蛋白（100 µg/mL），在37 °C孵育30分钟至1小时。该黏附基质可促进Raji细胞与孔底的结合（步骤2）、与Jurkat细胞形成活细胞共轭体（步骤4），以及进行延时显微成像（步骤6）；此外，该基质后续还可兼容可选的多聚甲醛（PFA）固定（步骤7）。
注意：若采用丙酮固定，请使用玻璃底培养板并以多聚-L-赖氨酸（20 µg/mL）替代纤连蛋白，因为丙酮会溶解塑料。8孔培养板（每孔面积1 cm2，最大体积300 µL）或同等规格的培养板是一种灵活且合适的选择。 - 使用200 μL移液器吸除纤连蛋白溶液，每孔加入200 µL PBS，在轻微振荡条件下洗涤2分钟，重复洗涤一次。此阶段的培养板可在4 °C用PBS保存1至2周。
2. Raji 细胞在载玻片上的黏附及7-氨基-4-氯甲基香豆素（CMAC）标记
- 将10 mL对数生长期的Raji细胞预培养液（浓度为1-2 × 106 个细胞/mL）转移至15 mL V型底离心管中，充分混匀后取10 µL，在血细胞计数板（如Neubauer计数室）或等效设备上进行细胞计数。
- 将剩余细胞在室温下以300 × g 离心5分钟，吸除并弃去上清液。
- 用预热的完全培养基（RPMI 1640，添加10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺、10 mM HEPES、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素）轻柔重悬细胞沉淀，调整细胞浓度至106 个细胞/mL。使用以下公式计算所需体积：
（[ ]初始 × V初始 = [ ]最终 × V最终），其中[ ]初始表示初始细胞浓度，V初始为细胞悬液初始体积，[ ]最终为最终细胞浓度，V最终为最终细胞悬液体积。
注意：根据起始培养物的细胞浓度，可能收集到超过所需数量的细胞，但必须将剩余细胞继续在37 °C条件下培养至实验结束，以避免潜在问题（参见步骤2.6）。 - 对标记Raji细胞以利于其在免疫突触共轭形成过程中的识别。本实验中，Raji细胞的标记在步骤2.4.2中使用7-氨基-4-氯甲基香豆素（CMAC）完成。
- 将所需数量的Raji细胞用培养基转移至2 mL离心管中。对于8孔腔室载玻片，共需1.6 mL细胞悬液（每孔200 µL）。
- 加入CMAC至终浓度为10 µM。由于CMAC对光敏感，需用铝箔包裹离心管以避光。每1 cm2孔需要含2 × 105 个Raji细胞的200 µL悬液。因此，若需准备8个孔，则共需1.6 × 106 个Raji细胞。
注意：使用细胞示踪染料蓝色（CMAC，紫外激发，蓝色发射）标记Raji细胞，可在形成突触共轭时将其与Th细胞区分开。该染料与多聚甲醛（PFA）和丙酮固定剂兼容，适用于后续免疫荧光操作。应尽量避免光照。将Raji细胞在CMAC溶液中批量标记后再重悬，并在接种至纤连蛋白包被的腔室载玻片前进行，可确保不同孔间Raji细胞的CMAC标记均匀一致。
- 重悬已标记CMAC的细胞，在完成步骤1.2中腔室载玻片的PBS洗涤后，将200 µL细胞悬液加入步骤1.1–1.2中制备好的纤连蛋白包被的腔室载玻片各孔中。将腔室载玻片置于37 °C、5% CO2条件下孵育30分钟至1小时。
注意：此步骤中细胞黏附与CMAC标记可同时完成，节省时间。请注意Raji细胞沉降较快，在接种前需小心维持细胞悬液的均匀性。此阶段无需通过离心洗涤去除CMAC，因为CMAC的洗涤可在步骤2.7中更方便地进行（此时标记的Raji细胞已黏附于腔室载玻片）。由于CMAC在细胞悬液中大量过量存在，背景蓝色荧光较强，难以分辨染色细胞。请在步骤2.7完成CMAC洗涤后再通过荧光显微镜检查细胞的CMAC荧光信号。 - 通过在显微镜下轻轻晃动腔室载玻片，确认Raji细胞已黏附于孔底。确保细胞之间存在间隙，未达到完全汇合状态（图1，中间图）。细胞汇合度在50–60%为宜。
- 若大多数细胞已有效黏附于腔室载玻片且未见细胞间隙，可用预热的完全培养基轻轻洗涤各孔，并用200 μL移液器吹打重悬以去除过多细胞。每次重悬后均需检查汇合度。
- 若细胞未充分黏附，可重复黏附步骤，并延长黏附时间和/或增加细胞数量。
注意：可在本步骤暂停，将腔室载玻片置于37 °C、5% CO2条件下过夜（O/N），次日继续实验流程。请在次日使用荧光显微镜确认Raji细胞仍保持黏附状态且CMAC标记有效。
- 再次用预热的含补充成分的RPMI培养基小心洗涤各孔，以去除多余的CMAC，并使用荧光显微镜观察蓝色荧光发射情况（图1）。
注意：为避免使用浸油（黏稠且易残留）及高数值孔径的油镜，可选用超长工作距离物镜（如20×或40×）通过荧光显微镜快速检查CMAC标记效果。
3. 使用葡萄球菌肠毒素E脉冲标记CMAC的Raji细胞
- 向每个孔中加入葡萄球菌肠毒素 E（SEE，1 µg/mL）。可将冷冻保存的 SEE 储液（1 mg/mL 溶于 PBS）用细胞培养基稀释至工作浓度（100 µg/mL），再使用。每 200 μL 微孔使用 2 μL 的 100 倍工作液。
注意：此步骤需佩戴手套操作，并将使用过的枪头丢弃至生物危害废物盒中。 - 将培养腔室载玻片置于 37 °C、5% CO2 条件下孵育至少 30 分钟。SEE 的作用可持续至少 3–4 小时。
备注：若计划进行不同的延时成像实验（步骤 5）和/或终点实验的起始时间点不同（步骤 6），可根据需要在不同时间点向孔中添加 SEE。
4. 准备Jurkat细胞
- 使用先前培养的Jurkat细胞（1-2 × 106 个细胞/mL）进行本实验。可采用标准培养瓶中的细胞，或按照前述方法23经标准电穿孔转染后的细胞。对Jurkat细胞进行转染可实现活细胞中分泌颗粒运输过程的延时成像观察。例如，当表达GFP-CD63（MVB的标记物）时，可记录GFP-CD63标记囊泡的运动轨迹（视频1）。
- 在相差显微镜下观察细胞。若发现大量死亡细胞（>20–30%），则在使用前采用标准方案24进行Ficoll密度梯度离心，以去除过多的死亡细胞（死亡细胞密度高于活细胞）（见讨论部分）。
- 将细胞转移至15 mL V型底离心管中，取10 µL用于血细胞计数板计数。
- 按照步骤2.2所述条件离心剩余细胞。弃去上清液，并用新鲜预温的培养基将细胞重悬至与Raji细胞相同的浓度（1 × 106/mL）。随后执行步骤2.2–2.3。
- 在等待步骤4期间，将Jurkat细胞继续置于培养条件下（37 °C，5% CO2）。
注意： 第二种方案（转染）中活细胞数量将显著低于第一种方案。因此，建议使用更大的起始培养体积，以确保实验所需细胞数量。每电穿孔杯使用10 × 106个Jurkat细胞进行转染后，48小时仅约有2–4 × 106个细胞存活，且部分细胞将在Ficoll分离步骤中丢失。因此，通常一个电穿孔杯所获得的转染Jurkat细胞足以用于刺激8个微孔中贴壁的SEE脉冲Raji细胞（需1.6 × 106个转染Jurkat细胞）。
5. Raji 细胞与 Jurkat 细胞的共接种
- 从第3.2步的培养箱中取出含有CMAC标记、SEE脉冲处理并已贴壁的Raji细胞的腔室载玻片。此阶段无需洗涤CMAC，因为该步骤已在第2.7步中完成。
- 使用自动200 μL移液器，从每个孔的一角开始，逐一小心吸除各孔中的培养基。注意不要让孔内的培养基完全干燥。
- 立即用200 µL在第4.5步中制备的重悬Jurkat细胞（细胞培养基中浓度为1 × 106/mL）替换原有培养基。若进行延时成像，请在此步骤后立即进入第6步，因为Jurkat细胞会迅速沉降并快速形成突触结合体。为方便起见，此阶段未接种Jurkat细胞的、含有SEE脉冲处理并已贴壁的Raji细胞微孔，应继续保留细胞培养基，直至后续与Jurkat细胞共培养。这将灵活支持后续进行额外的延时实验或反向动力学、终点分析等实验方案。
- 若计划进行延时成像，应迅速进入第6步。此步骤包括在显微镜载物台培养箱或等效设备中于37 °C、5% CO2条件下共培养1–2小时，以允许突触结合体形成，并同时进行图像采集。若仅进行终点分析而不进行延时成像，则应在共培养结束后先使用显微镜检查结合体形成情况（如图1所示），再进行细胞固定（第7步）。
6. 突触连接形成的延时成像
- 在成像前准备好显微镜和培养箱。对于视频1中所示的示例，详细的显微镜设置如下所示 图2.
注意： 如果计划进行延时成像实验，在将Jurkat细胞悬液加入已黏附Raji细胞的腔室载玻片之前，应预先设置并准备好所有显微镜参数及相关配套设备（如细胞培养环境控制腔室等）。以下步骤以某商用显微镜为例进行说明材料表然而，任何配备细胞培养孵育箱的倒置荧光显微镜均可使用。- 成像极化运输时，应使用配备60倍油镜、高数值孔径的显微镜。
- 确保自动聚焦系统已开启，并调节偏移量以聚焦于结合在底部表面的Raji细胞。请参考 图1, 视频 1 和 视频 2.
- 在步骤5.3将Jurkat细胞加入含有贴壁Raji细胞的各孔后，迅速将微孔腔室载玻片置于已预热（1–2小时）的显微镜载物台培养箱（如OKOlab）上，并使用显微镜选择若干XY位置，这些视野中可能记录到正在形成的免疫突触结构，例如一个转染的Jurkat细胞进入显微镜焦点时所形成的免疫突触。
- 使用预热的显微镜载物台培养箱，因为已观察到温度稳定的载物台可维持稳定的X、Y、Z位置。理想的XY视野应满足以下标准：Raji细胞聚焦清晰且未融合（即细胞间存在间隙），并可见转染的Jurkat细胞（可通过透射光与紫外光或GFP通道结合观察确认）。Jurkat细胞在腔室载玻片上沉降速度极快（数分钟内），随着时间推移，捕获正在形成的突触结构的几率将逐渐降低。图1可以在此预定时间结束后终止实验，或继续进行第7步，固定接合物以用于后续免疫荧光及分析。
注意： 最多可从4个不同的微孔中选择多达16个不同的显微镜视野，以适当的时序分辨率（每帧1-2分钟）同时进行多孔延时成像采集。该限制取决于待成像的不同荧光染料的数量及其强度（影响相机曝光），而荧光染料的数量又与表达的荧光蛋白种类数（除CMAC外）相关。提高帧率的一种方法是仅在每若干帧中对CMAC通道进行一次记录 "n" GFP 的时间帧（即 n = 8，如图所示） 图2），因为Raji细胞会贴附在孔底，不像Jurkat细胞那样容易移动。此外，这也有利于维持细胞活力，因为频繁的紫外光照射可能对细胞造成损伤。建议将时间帧速率调整为每1分钟或更短时间拍摄1帧（例如，每帧20秒）。 视频 1, 图2因为MVB的极化需要数分钟至数小时才能完成。进行多通道采集需要配备电动落射荧光物镜转盘和适当带通荧光滤光片或等效装置的显微镜。
7. 突触连接终末的形成与固定
- 如果仅计划进行终点实验（孵育1-2小时以允许免疫突触结合物形成即可），则将腔室载玻片在37 °C、5% CO2条件下孵育1-2小时。培养结束后检查结合物的形成情况（如图1所示），随后使用丙酮或PFA固定结合物（固定方法需根据后续免疫荧光实验所用的抗原和抗体进行选择）。此情况下无需使用显微镜载物台培养箱。示例请参见视频3。
- 固定细胞时，用不含FCS的温RPMI培养基（37 °C）轻轻振荡洗涤各孔（血清中的白蛋白可能在丙酮固定时发生沉淀）。吸去液体后，向每孔加入200 µL PFA或预冷的丙酮。分别在室温（RT）或冰上孵育20分钟。
注意：进行丙酮固定时，需将丙酮预先冷却至-20 °C，并将腔室载玻片预先冷却至4 °C。当使用丙酮固定在8孔玻璃底腔室载玻片中培养的细胞时，需移除塑料盖。 - 用PBS洗涤每孔两次，然后每孔加入200 µL封闭液（PBS，50 mM NH4Cl）。将腔室载玻片在4 °C孵育。
注意：在此阶段，腔室载玻片可在4 °C保存至少一个月后再进行免疫荧光实验，具体操作如文献8所述。盖子可防止溶液蒸发。
8. 图像处理
- 对延时序列和/或固定细胞的静态图像进行采集后图像去卷积处理（例如 Huygens 去卷积或等效方法，见材料表）。使用适当的软件（例如，在 Huygens 中选择“"宽场"光学选项）并输入正确的光学参数进行去卷积。去卷积过程需要对显微镜测得的点扩散函数（PSF）进行图像处理4。
- 或者，可使用软件通过自动加载显微镜文件元数据中包含的光学参数来计算理想化的 PSF。这些光学参数包括荧光染料波长、折射率、物镜数值孔径以及成像技术类型（共聚焦、宽场等）4。
- 随后，成像软件利用 PSF 和多种去卷积算法（例如 Huygens 软件中的 QMLE 和 CMLE），通过逐步累积的计算过程进行处理，其结果可由用户实时观察，并根据需要随时暂停或继续。在此阶段，用户可更改卷积次数和/或信噪比，然后恢复去卷积过程。该去卷积软件适用于延时序列（X,Y,T）（视频 2）和 Z 层切图像（X,Y,Z）（视频 3）。去卷积后的各通道随后与原始的 CMAC 通道合并，因为细胞质中弥散分布的荧光染料经去卷积处理后无明显改善4,9。
结果
我们已按照所述方案生成 Jurkat-Raji 免疫突触结合体，并对免疫突触（IS）形成的早期阶段进行准确成像。我们的目标是改进此前用于研究微管组织中心（MTOC）及分泌机制向免疫突触极化过程的早期方法20。这些早期方法基于终点检测策略，无法对免疫突触的形成过程或早期突触事件进行实时成像，因为这些策略中免疫突触的形成必须发生在混合细胞经离心后的沉淀物中，而非显微镜下进行。本方案旨在避免这一主要缺陷，其关键在于采用适当的细胞浓度（步骤 2 和步骤 3），以促进细胞间免疫突触结合体直接在显微镜载玻片腔室（8 孔腔室载玻片）上形成，该载玻片置于预热的显微镜载物台培养箱中（步骤 4）。该策略可实现在时间序列成像的同时诱导免疫突触的形成（视频 1）。
图1展示了按照本方案（步骤5.2）获得的Jurkat-Raji细胞突触连接结构。该图像来自一个代表性的时间延时实验的第一帧。将2 × 105个Raji细胞和2 × 105个Jurkat细胞加入到1 cm2的孔中。上图显示透射光通道图像，中图显示CMAC（蓝色）通道（Raji细胞），下图显示透射光与CMAC通道的合并图像。黄色箭头标记了一些典型的突触连接作为参考，绿色箭头指示由一个Jurkat细胞与多个Raji细胞形成的突触连接（复杂连接）。降低细胞浓度（在1 cm2孔中少于或等于105个细胞）可避免复杂细胞连接的形成，但可能导致后续极化运输分析所需的细胞连接数量不足，从而也降低了发现和成像新形成突触连接的概率。
图2 显示了在代表性延时实验（对应于视频1）中，使用适当软件（即 NIKON NIS-AR）同时捕获两种不同荧光染料（CMAC 和 GFP-CD63）成像参数的截图。
视频1（免疫突触，原始数据）展示了一个表达GFP-CD63（多泡体MVB的标记物，绿色囊泡）的Jurkat T淋巴细胞，以及一个Jurkat细胞与两个用CMAC标记（蓝色）的Raji细胞之间双突触的形成过程（其中一个Raji细胞正在被吞噬）。记录了MVB在Jurkat细胞内向突触区域同步移动的过程（GFP-CD63的采集帧率为每20秒1帧；视频回放速度为每秒2帧）。突触共轭结构的获取与成像遵循上述方案（步骤6.2），从而实现了新生突触的成像（视频1）。通过适当的软件（例如NIS-AR，材料表）同时采集GFP-CD63和CMAC荧光通道信号。该视频为一次代表性延时实验的原始数据。自动对焦系统相对于贴附于玻璃底表面的Raji细胞设置了适当的偏移量，以确保整个实验过程中对焦的稳定性。
视频 2（去卷积后的免疫突触图像）对应于视频 1，但对GFP-CD63荧光通道图像进行了去卷积处理，采用合适的去卷积软件（例如 Huygens），选择“宽场”光学选项及相应的光学参数（步骤 8）进行运算。随后，将去卷积处理后的通道与CMAC的原始通道合并。图像的信噪比和清晰度均有明显提升。去卷积处理是在图像采集完成后按上述方法进行的。有关去卷积软件的具体细节，请参见4。
视频 3（免疫突触，固定后经免疫荧光染色）展示了在实验步骤 6（丙酮固定）后一个固定的免疫突触（IS）共轭结构的 Z 轴层扫图像（Z 轴步长 = 0.8 µm，共 5 帧）。固定后，按照标准方案25进行免疫荧光染色，使用鬼笔环肽（Phalloidin）标记 F-肌动蛋白（绿色），抗 CD63 抗体标记多泡体（MVB，品红色），抗 γ-微管蛋白抗体标记微管组织中心（MTOC，红色）。CMAC（蓝色）用于标记 Raji 细胞。随后，使用落射荧光显微镜成像，并利用“宽场”光学选项及适当的光学参数对多个通道进行去卷积处理（步骤 7）。去卷积后的各通道图像随后与 CMAC 原始通道图像合并，如各图所示（CMAC 加透射光-TRANS、CMAC 加鬼笔环肽、CMAC 加抗 CD63 抗体、CMAC 加抗 γ-微管蛋白抗体）。白色箭头指示突触位置，绿色箭头指示多泡体（MVB），黄色箭头指示微管组织中心（MTOC）。MVB 和 MTOC 极化的详细定量分析已在其他文献中说明25。
本文所述方法涉及细胞间共轭物的形成，同时结合宽场荧光显微镜（WFFM）进行时间序列成像，并在图像采集后进行图像处理（采集后去卷积）。该策略提高了图像的信噪比（SNR），增强了时间分辨率，并实现了对新生突触共轭结构中多种荧光染料的同步采集4。此外，本方案与后续的终点细胞固定方法（如多聚甲醛、丙酮或甲醇）高度兼容，从而可进行进一步的免疫荧光染色与分析25（视频 3）。本方案同样适用于激光扫描共聚焦显微镜及其他先进显微技术。
图1：典型的双倍尺寸突触连接体显微图像视野。 该图像来自一项代表性的时间延时实验的第一帧，实验遵循本方案进行。上层面板显示透射光通道，中层面板为CMAC通道（Raji细胞），下层面板为两通道合并图像。黄色箭头标记了一些突触连接体作为参考。绿色箭头指示复杂的突触连接体（即一个Jurkat细胞与多个Raji细胞形成突触连接）。图像使用40倍EWD（0.6 NA）物镜拍摄。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：时间推移显微镜设置。 该图像对应于多个屏幕截图，展示了在代表性的时间推移实验中使用适当软件（例如 NIKON NIS_AR）同时采集两种不同荧光染料（CMAC 和 GFP-CD63）时所采用的成像参数，该实验对应于 视频1。GFP-CD63 通道的每一帧图像每隔 20 秒采集一次。为了在实验过程中维持细胞活力，每采集八帧 GFP 通道图像仅采集一帧紫外（UV）通道图像。请点击此处查看此图的放大版本。
视频 1：表达 GFP-CD63 的 Jurkat 细胞形成的免疫突触，原始数据。 使用细胞追踪染料蓝色（CMAC，蓝色）标记的 Raji B 细胞经 SEE 刺激 30 分钟后，与表达 GFP-CD638 的 Jurkat 细胞形成免疫突触。采集了对应于 GFP-CD63 和 CMAC 通道的时间序列图像（每帧 20 秒；视频播放速度为每秒 2 帧），此处展示一个代表性示例。图像使用 60 倍 PLAN APO（1.4 NA）物镜采集。 请点击此处观看该视频（右键可下载）。
视频 2：经去卷积处理后表达 GFP-CD63 的 Jurkat 细胞形成的免疫突触。 与视频 1相同，但图像使用去卷积软件进行了去卷积处理。由于去除了离焦荧光的干扰，信噪比明显提高，图像清晰度显著增强。请点击此处观看该视频（右键可下载）。
视频 3：固定并免疫染色的免疫突触。 该图像显示了在完成方案第7步及后续免疫荧光染色后的一个代表性固定突触共轭结构。CMAC（蓝色）标记Raji细胞，透射光（TRANS）用于显示突触共轭结构（白色箭头），鬼笔环肽标记F-肌动蛋白（绿色），抗CD63抗体标记多泡体（MVB，品红色，绿色箭头），抗γ-微管蛋白抗体标记微管组织中心（MTOC，红色，黄色箭头）。上述各通道通过落射荧光成像，经去卷积处理后按所示方式合并。视频包含一个Z轴层扫序列（Z步长 = 0.8 μm，共5帧）。白色箭头标记突触接触区域，绿色箭头标记MVB，黄色箭头标记MTOC。请点击此处观看视频（右键可下载）。
讨论
本方案的一个局限性在于，并非所有突触都能理想地垂直于光轴方向排列。使用该技术无法预测和/或影响免疫突触成像的理想取向。为解决这一问题，我们在后续分析中排除所有随机捕获但最终不符合理想标准的突触。幸运的是，这类突触并不常见。然而，也可通过多种实验方法来规避这一局限性4。
极化的CD63释放（脱颗粒）可通过其他互补技术进行定量，例如在步骤6之后，对活细胞（未固定且未透化）进行细胞表面CD63染色（CD63重定位至细胞表面），随后进行洗涤和固定，如先前研究所示8。此外，还可检测外泌体上的CD63释放8,9，并利用纳米颗粒追踪分析对外泌体进行定量9,25。只要在活细胞表面免疫荧光染色完成之后再进行固定，这些方法均可与本实验方案兼容。
我们已确定细胞的最佳数量（适用于1 cm2 8孔板中每孔的细胞数量为4 x 105 细胞（2 × 105 Raji 细胞和 2 x 105 Jurkat细胞），因为它们能有效地贴附于孔板底部。使用纤连蛋白包被的塑料表面或使用多聚赖氨酸包被的玻璃底小室载片时，细胞对这些材料的贴附效率通常不成问题。较高的细胞密度可使贴附细胞之间无间隙，从而形成复杂的突触样连接结构。图1）；而在需要对单个细胞间连接结构进行成像的情况下（例如在MTOC或分泌颗粒极化实验中），上述两种情况均不理想。细胞数量较少会降低发现连接结构的几率，尤其是在使用转染的Jurkat细胞与抗原呈递细胞（APC）共孵育以形成免疫突触时。请注意，我们观察到将温度控制的显微镜载物台培养箱安装在显微镜的X/Y载物台上 之前 在实验方案开始前（即提前1-2小时）启动系统以稳定载物台/显微镜装置，维持稳定的X、Y、Z参数，这对获得理想的成像效果至关重要。自动对焦系统最终可补偿微小的Z轴偏差。
当使用某些基因转导技术（如电穿孔）在Jurkat克隆中表达荧光嵌合蛋白（例如GFP-CD63）时视频 1)，在电穿孔后可能会有相当一部分细胞死亡。这会带来问题，因为尽管死细胞本身不会形成突触，但当其数量超过存活的转染细胞时，可能会干扰存活的Th细胞形成免疫突触。我们发现，在进行突触形成实验前，按照标准操作流程使用密度梯度介质仔细去除转染后培养物中的死细胞，确实能够提高成功成像免疫突触的几率。此外，转染效率较低（<20%）可能是一个重要的注意事项，因为这一因素与中等的偶联形成效率（约60%）相结合时25，将降低找到转染细胞形成共轭体的概率。当使用非转染细胞进行终点实验并随后固定以获取共轭体时，此问题不存在。8孔腔室载玻片适用于常规免疫荧光实验方案，从而提高了上述方案在不同应用中的灵活性。使用底部为塑料材质的腔室载玻片时，丙酮固定可能存在问题。然而，市面上有带玻璃底的8孔显微镜腔室载玻片，可兼容丙酮固定。当使用丙酮固定培养在带玻璃底8孔腔室载玻片中的细胞时，需移除塑料盖。
建议显微镜配备电动XY载物台、电动落射荧光物镜转盘和自动对焦系统（例如Perfect Focus System）或类似的辅助装置。当需要进行多孔采集时25，自动对焦系统将确保整个实验过程中焦点的稳定性。以往经验表明，通过在Raji细胞上建立适当的对焦偏移，可以补偿T细胞的运动（视频 1）以及在XY多点实验中显微镜载物台或载玻片腔室的移动。这对于多孔延时成像确实非常方便。
采用黑白全色冷却电荷耦合器件（CDD）相机，但更理想的选择是使用高灵敏度的科学级互补金属氧化物半导体（sCMOS）荧光相机，因为这可以缩短相机曝光时间并提高时间分辨率。我们所使用的较短曝光时间（范围为100毫秒至500毫秒），结合自动荧光快门，可在无明显荧光漂白和/或细胞活力损失的情况下，实现长时间延时成像（最长可达24小时），并具备足够的时间分辨率（每分钟1帧或更低，最多可覆盖16个XY位置）。电动载物台支持多点（XY）图像采集，不仅提高了在理想取向上观察和成像新生及发育中突触的概率，还可在需要同时对不同Jurkat克隆进行共轭时，用于多孔腔室载玻片的图像获取25。在分析分泌颗粒运输时，为获得最佳结果，必须使用高数值孔径的物镜（例如60倍，1.4）。
RAJI-SEE-Jurkat 构成了一个成熟的免疫突触模型，自首次被描述以来，已被众多研究人员广泛使用11。我们已将实验方案适应该模型，以准确成像免疫突触（IS）形成的早期阶段。我们的目标是改进此前用于研究微管组织中心（MTOC）和分泌机制向免疫突触极化的早期方法20。值得注意的是，采用本方案制备的细胞结合物可在突触处引发F-肌动蛋白的重排，同时伴随多泡体（MVB）的极化运输，形成典型的SMAC结构25。这些关键事件也已通过共聚焦显微镜进行了分析和验证25。
不同类型免疫突触（IS）中极化运输的动力学存在差异。例如，细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）中溶细胞颗粒的极化运输在数秒至数分钟内完成，而辅助性T淋巴细胞（Th淋巴细胞）中含细胞因子的囊泡则需要数分钟至数小时才能完成运输。这些时间上的差异必须在实验设计之初予以充分考虑，以便选择最佳策略以及最合适的实验和成像方法。对于某些成像策略（如激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）），时间可能成为限制因素，因为其图像采集时间远长于所需的时间分辨率（1分钟或更短）4。而采用上述方案中所述的宽场荧光显微镜（WFFM）则不存在此限制。由于在CTLs中，微管组织中心（MTOC）向免疫突触的极化过程仅持续数分钟3,6,17，因此在需要对多个显微视野（多点采集）进行成像时，必须采用本文所述方法之外的其他具有更高空间和时间分辨率的先进显微技术，才能有效观察这些突触26,27。尽管这些高分辨率的新方法也可用于成像Th淋巴细胞所形成的突触，但经济或后勤方面的因素（例如，某些成像技术所需的核心设备成本约为本文所述设备的6至7倍）可能会限制这些前沿成像技术的应用4。由于Th淋巴细胞形成的免疫突触持续时间较长，且在Th淋巴细胞中，MTOC、含淋巴因子的分泌囊泡以及多泡体（MVB）需要数分钟至数小时才能运输并锚定至免疫突触22，因此本方案成为成像Th-APC免疫突触的理想且经济可行的方法。
结合采集后图像去卷积的WFFM技术是一种颇具吸引力的方法，支持这一策略的不仅有经济方面的考量。通过使用采集后图像去卷积，可改善Z轴方向固有的较低分辨率（该技术最重要的局限性）。4 （比较 视频 1 与 视频 2）。去卷积采用基于计算的图像处理方法，可提高信噪比以及图像的分辨率和对比度27 最多2次，XY轴方向降至150-100 nm，Z轴方向降至500 nm4.
采用更高灵敏度、高速读出和宽动态范围的新型荧光sCMOS相机将提高图像质量，并减少荧光淬灭。本文所述的细胞间共轭协议具有灵活性，可将所述的细胞方法与多种先进的显微技术相结合，不仅适用于活细胞，也适用于固定细胞，预期结果将切实增进我们对免疫突触的理解。
尽管我们已通过使用易于操作且已建立的细胞系来实施并验证了该方案，但该方法的潜力在于，当使用原代T细胞和不同类型的抗原呈递细胞（如树突状细胞或巨噬细胞）时，可实现更接近生理状态的相互作用的可视化5。在此背景下，该方案还通过使用经超抗原（SEB）脉冲处理的小鼠EL-4细胞系作为抗原呈递细胞（APC），以刺激原代小鼠T淋巴母细胞，进一步拓展并验证了其适用性9。事实上，原代T淋巴细胞，尤其是细胞毒性T淋巴细胞（CTLs），所形成的突触接触更为短暂且动态（参见参考文献9中的补充视频8），与SEE-Raji和Jurkat模型中观察到的突触接触不同。在二维体外组织等效物中，原代T细胞与树突状细胞或B细胞相互作用时突触接触模式的多样性最为明显，而此类相互作用也可通过本方案进行记录和分析。此外，除超抗原外，该技术还可用于成像其他类型的免疫突触。例如，可在T细胞受体（TCR）转基因、抗原特异性的T细胞模型中应用，如使用卵清蛋白特异性的鼠源OT1/OT2系统，或通过将抗原特异性的T细胞受体转染至T细胞中实现。这为近期的实验研究开辟了大量可能性。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢实验室所有过去和现在的成员所做出的宝贵贡献。本工作得到了西班牙经济与竞争力部（MINECO）国家科学研究计划（SAF2016-77561-R，授予M.I.，部分资金来自欧盟区域发展基金FEDER-EC）的资助。我们感谢马德里自治大学医学院（UAM）及医学院视听部门在视频制作过程中提供的支持与设施。我们感谢NIKON-Europe持续且出色的技术与理论支持。本文的免费访问由尼康赞助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 尼康 DS-QI1MC 相机 | Nikon | MQA11550 | 制冷相机头 |
| CMAC | ThermoFisher Scientific | C2110 | 细胞示踪蓝色染料 |
| JURKAT 细胞 | ATCC | ATCC TIB-152 | 效应 T 淋巴细胞 |
| μ-Slide 8 孔 ibiTreat，μ-Slide 8 孔玻璃底板 | IBIDI | 货号：80826, 80827 | 细胞培养与细胞成像载体 |
| 尼康 Eclipse Ti-E 显微镜 | Nikon | NIKON Eclipse Ti-E | 配备完美聚焦系统（PFS）选项的宽场荧光全自动电动显微镜 |
| 带三通道手动气体混合器及气体鼓泡/湿度模块的显微镜载物台培养箱 | OKOLAB | H201-NIKON-TI-S-ER | 细胞培养环境控制装置 |
| Raji 细胞 | ATCC | ATCC CCL-86 | 抗原呈递细胞（APC） |
| RPMI 培养基 GIBCO | ThermoFisher Scientific | 21875034 | 细胞培养基 |
| 肠毒素 E（SEE） | Toxin Technology, Inc | EP404 | 细菌毒素 |
| Huygens Essential 软件 | SVI | Huygens Essential | 图像去卷积软件 |
| ImageJ 软件 | NIH | Image J | 图像处理软件 |
| Nikon NIS-AR 软件 | Nikon | NIS-Elements AR | 图像采集与分析软件 |
参考文献
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