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比较在小鼠肾脏和鸡绒毛尿囊膜上建立的转移性透明细胞肾细胞癌模型

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DOI：

10.3791/60314

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2020年2月8日

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1Department of Molecular and Medical Pharmacology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2Department of Molecular, Cell, and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, 3Department of Bioengineering, Hanyang University, 4Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of California, Los Angeles, 5Department of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of California, Los Angeles, 6School of Life Sciences, Beijing Normal University, 7Department of Urology, West China Hospital, Sichuan University, 8Department of Urology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

转移性透明细胞肾细胞癌是一种尚无全面动物模型用于深入临床前研究的疾病。本方案介绍了该疾病的两种新型动物模型：原位移植小鼠模型和鸡绒毛尿囊膜模型，这两种模型均能表现出类似临床病例的肺转移。

摘要

转移性透明细胞肾细胞癌（ccRCC）是肾癌最常见的亚型。局限性ccRCC的手术治疗效果良好。然而，约三分之一的ccRCC患者会发展为肺转移，这与患者的极差预后密切相关。遗憾的是，由于转移的分子机制尚不清楚，目前尚无针对这一致命阶段的有效疗法。已知25年来，Von Hippel-Lindau（VHL）肿瘤抑制基因功能的丧失是ccRCC的特征性病理标志。然而，至今尚未建立具有临床相关性的ccRCC转基因小鼠模型。本实验方案的目的是介绍并比较两种新建立的转移性ccRCC动物模型。第一种为小鼠肾内植入模型。在本实验室中，利用CRISPR基因编辑系统在多种RCC细胞系中敲除VHL基因。将异质性ccRCC细胞群体原位植入小鼠肾包膜，成功建立了可在免疫健全小鼠中产生显著肺转移的新ccRCC模型。第二种模型为鸡绒毛尿囊膜（CAM）系统。与小鼠模型相比，该模型在时间、人力和成本方面更具效率。该模型同样支持显著的肿瘤形成和肿瘤细胞入血（intravasation）。由于CAM模型中肿瘤生长周期较短（仅10天），在收集的胚胎组织中通过免疫组织化学（IHC）未观察到明显转移。然而，当在孵化出的鸡体内将肿瘤生长时间延长两周后，可通过IHC在肺组织中检测到微转移性ccRCC病灶。这两种新型临床前模型将有助于进一步研究转移的分子机制，并可用于建立新的患者来源异种移植模型（PDXs），从而推动针对转移性ccRCC的新型治疗方法的开发。

引言

肾细胞癌（RCC）是第7th 美国最常见的癌症。每年约有74,000名美国人被新诊断出该病，导致超过14,000人死亡（肾透明细胞癌（clear-cell histological subtype, ccRCC）是最常见的亚型，约占肾细胞癌（RCC）病例的80%。局限性恶性肿瘤患者接受肾切除术治疗，5年生存率良好，达73%1然而，25%至30%的患者会出现远处转移，累及肺等重要器官，导致中位生存期仅为13个月，5年生存率仅11%1,2,3. 要改善转移性ccRCC的致命预后，仍需进一步深入理解其转移机制。

VHL 抑癌基因的缺失是大多数人类 ccRCC 病例中观察到的标志性遗传损伤4,5,6,7。然而，VHL 缺失在 ccRCC 中确切的致癌机制尚不清楚。此外，VHL 的表达状态并不能预测 ccRCC 的预后8。值得注意的是，尽管已多次尝试针对肾上皮细胞特异性敲除 VHL 基因，科学家仍未能在小鼠中诱导出超出癌前囊性病变范围的肾脏异常9，即使同时敲除其他抑癌基因（如 PTEN 和 p53）亦未能实现10。这些发现表明，仅 VHL 缺失不足以引发肿瘤发生或后续的自发性转移。

近期，我们的实验室利用CRISPR/Cas9技术在小鼠VHL阳性ccRCC细胞系（RENCA，或称VHL-WT）中敲除VHL基因，成功构建了一种新的VHL基因敲除（VHL-KO）细胞系11,12。我们发现，VHL-KO细胞不仅具有间充质表型，还能促进VHL-WT细胞发生上皮-间充质转化（EMT）12。已知EMT在转移过程中发挥重要作用13。我们的研究进一步表明，仅当VHL-KO细胞与VHL-WT细胞共同植入肾脏时，才会出现远端肺转移，提示存在一种协同性的转移机制。重要的是，我们建立的原位植入VHL-KO与VHL-WT细胞的小鼠模型能够稳定产生肺转移，较好地模拟了临床ccRCC病例。该自发性转移性ccRCC模型弥补了转基因转移性小鼠模型的缺乏，尤其有助于新型抗转移药物的研发。本实验方案详细描述了将遗传工程改造的RENCA细胞所形成的异质性细胞群体植入肾包膜的技术流程。

鸡胚尿囊膜（CAM）模型因其诸多优势，在血管生成和肿瘤生物学研究中具有悠久的历史，如表114,15,16,17,18所总结。简而言之，CAM肿瘤生长的时间窗口较短，最长可持续11天，之后随着鸡胚孵化，CAM即被破坏16。尽管生长时间较短，但鸡胚丰富的营养供应及其免疫缺陷状态使得肿瘤移植效率非常高16,19,20,21。最后，每枚受精卵的成本约为1美元，而SCID小鼠的成本则超过100美元。综上所述，与小鼠模型相比，CAM模型可作为建立新型患者来源异种移植模型（PDX）的一种极具成本和时间效益的替代性动物模型。在本实验方案中，我们评估了该模型是否能够重现小鼠原位模型中观察到的转移性透明细胞肾细胞癌（ccRCC）的生物学特性。

重症联合免疫缺陷（SCID）小鼠CAM注意
成本>每个100美元每个约1美元存活率范围为50-75%
需要屏障环境饲养是无进一步降低成本 & 简化肿瘤的系列监测
肿瘤直接可见无是图3A
首次植入时间（RENCA）2 周2-4 天参考文献 14、15
生长终点（RENCA）3-6 周10 天参考文献 14、15
观察到转移（RENCA）是是的，在雏鸡中图3D
连续传代是是参考文献 16-18
小鼠传代（RENCA）是是胡，J.，等，待审（2019）
维持肿瘤异质性是是Hu, J. 等，待审稿（2019）

表1：小鼠模型与CAM模型的优点与局限性。 本表从所需时间、成本、劳动强度以及生物学特性等方面，比较了这两种模型各自的优点与局限性。CAM模型在效率方面具有优势，但由于鸟类与哺乳类在形态学上的差异，该模型也存在其独特的局限性。因此，确认该模型能否保持异种移植组织的生物学特性至关重要。

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方案

本文所述所有方法均已获得机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，该委员会指定为加州大学洛杉矶分校校长动物研究委员会（ARC）（ARC 2002-049-53 和 ARC 2017-102-01A）。2002-049-53 方案优化用于将 ccRCC 肿瘤细胞植入裸鼠或 BALB/c 小鼠的肾包膜内。在孵化前于受精鸡胚中进行的肿瘤植入实验无需 IACUC 批准。为延长肺转移形成的观察时间，允许带有 CAM 肿瘤的胚胎孵化并发育为雏鸡。2017-102-01A 方案涵盖此类动物实验。

1. 小鼠原位肿瘤研究

注意：本实验的时间线如图1A所示。这些实验步骤改编自先前的文献11,12。

  1. 准备用于移植的单细胞悬液
    1. 使用胰蛋白酶/EDTA将RENCA VHL-WT和VHL-KO细胞从培养皿中消化下来。
    2. 用血细胞计数板计数细胞，并将细胞重悬于预冷的PBS与细胞外基质溶液1:1混合液中，浓度为1 × 105 个细胞/µL。
      注意：异质性移植使用VHL-WT与VHL-KO细胞按1:4的比例混合，同质性移植则仅使用VHL-WT细胞。
    3. 将重悬的细胞转移至1.5 mL微量离心管中，置于冰上保存，直至进行移植。
  2. 肾包膜移植
    1. 麻醉：将加热垫预热至37 °C，并覆盖一层厚的无菌手术单。通过诱导舱吸入异氟烷，或腹腔注射（IP）1%戊巴比妥钠（剂量为10 mL/kg）对小鼠进行麻醉。
    2. 剃除手术区域的毛发。裸鼠可省略此步骤。
    3. 消毒与手术铺巾：用聚维酮碘对小鼠背部全面消毒3次，再用70%乙醇消毒1次，随后用无菌棉签擦干。然后依次放置三块无菌医用敷料，覆盖整个背部，以建立无菌手术区域并固定小鼠。
    4. 切口与肾脏外置：手术前用聚维酮碘消毒操作者手指，或佩戴无菌手套。将小鼠置于俯卧位，用手指定位左侧肋腹部下方的左肾。使用钝头镊子和剪刀在指定位置切开皮肤及肌肉层。用无菌棉签和镊子将左肾部分从腹腔中牵出。
    5. 肿瘤细胞移植：将步骤1.1中制备的细胞悬液装入胰岛素注射器或定制的哈密尔顿注射器（详见材料表中的规格）。将20 µL细胞悬液注射至肾包膜下。
      注意：成功注射的标志是肾脏表面形成一个半透明的隆起。若误将细胞注入肾实质，会导致出血，并因注射部位发生致命性出血而导致术后死亡率高达90%。
    6. 缓慢拔出针头，使细胞外基质溶液得以凝固，防止出血或肿瘤细胞泄漏。然后用无菌棉签将肾脏推回腹腔内。
    7. 伤口缝合：使用5-0涂层VICTRYL缝线缝合肌肉层。用聚维酮碘对皮肤消毒一次，随后使用伤口自动夹闭器关闭皮肤切口。
    8. 术后恢复：将小鼠置于加热垫上直至苏醒。若采用吸入麻醉，需撤除异氟烷，并继续将小鼠留在加热垫上直至完全清醒。
  3. 生物发光成像（BLI）与组织采集
    1. 肿瘤移植后六周，进行基于萤火虫荧光素酶的生物发光成像（BLI）。随后通过吸入异氟烷麻醉并实施颈椎脱位法处死小鼠。
    2. 采集血液，用于通过流式细胞术检测循环肿瘤细胞（CTC）。
    3. 采用无菌组织采集技术获取肿瘤及目标器官（肾脏、肺、肝、肠和脾）22。将组织在4%多聚甲醛中固定过夜，用于石蜡包埋。

2. CAM 肿瘤异种移植模型

注意：这些步骤改编并修改自先前已发表的方案23,24。本实验流程的时间线见图1B。本文仅介绍简化的实验方案。如需详细方案，请参阅我们课题组发表的另一篇 JoVE 文章25。

  1. 预孵育：将新鲜受精的鸡卵置于37 °C、55–65%湿度的旋转式孵卵器中孵育7天。
  2. 落下CAM并打开窗（发育第7天）：
    1. 定位并标记气囊和静脉。
      注意：通常有10–15%的卵因未受精或在受精后7天内死亡而被淘汰。
    2. 在已标记的静脉上方创建一个新的气囊。
    3. 标记新气室，贴上封箱胶带，然后将鸡蛋放回孵化箱。
      注意：此处可暂停操作。建议于同一天内继续进行后续步骤，因为气囊可能发生移位。
    4. 打开窗口：使用一对弯头显微解剖剪和一对尖头镊子，在蛋壳上剪出一个直径1.5 × 1.5 cm的圆形窗口。
      注意：CAM 的破坏表现为切下的壳片上有血液和一块 CAM 存在。
    5. 用透明医用敷料封住孔洞，并将卵置于37 °C、55%-65%湿度的静止培养箱中孵化。
      注意：使用与步骤 2.1 相同的卵孵化箱。关闭旋转装置，使其保持静止。
  3. 健康检查（发育第9天）：移除死亡的卵，然后将剩余的卵随机分组用于肿瘤细胞移植。
    注意：理想情况下，此时的存活率约为发育第0天的80%。
  4. 将肿瘤细胞移植到新暴露的绒毛尿囊膜上（发育第10天）
    1. 将细胞外基质溶液用预冷的 RPMI 1640（含 L-谷氨酰胺）稀释至两倍体积。消化 RENCA 细胞并重悬于上述溶液中，调整细胞浓度至 2 x 104 细胞/µL
      注意：异质移植使用 VHL-WT 与 VHL-KO 细胞按 1:1 比例混合，同质移植则仅使用 VHL-WT 细胞。
    2. 为使细胞悬液预先凝固，将每种细胞混合物各取 100 µL 加入 200 µL 移液枪头中，置于细胞培养箱内孵育 15 分钟。
    3. 通过窗口将每枚鸡蛋的100 µL细胞悬液接种于CAM表面。
      注意：某些实验方案要求在植入前对CAM进行划痕处理23对于RENCA细胞而言，此步骤并非必需，因为它们增殖非常迅速。
  5. 在CAM上培养细胞10天，每2天拍摄一次照片。
  6. 处死动物并采集肿瘤、血液和器官。
    1. 在发育第20天（肿瘤接种后第10天），使用含肝素的10 mL注射器经尿囊绒毛膜静脉采集血液。
    2. 将胚胎置于冰上15分钟以处死。
    3. 收获并称量肿瘤。采用与小鼠相似的无菌组织收获技术解剖肺和肝22.
      注意：鸡的肝脏有两个叶，是腹腔内首先可见的器官。不要将肝脏与肺脏混淆。鸡的肺脏位于心脏和膈膜下方。26通过暴露的肋骨可确认肺脏采集成功。
    4. 将肿瘤和解剖所得器官置于4%多聚甲醛中固定过夜，用于石蜡包埋。
  7. 孵化小鸡。
    1. 为允许肿瘤更长时间生长，继续孵育至第21天，并在37 °C、至少60%湿度条件下使鸡胚孵化。
      注意：鸡通常在第21天开始自然孵化，整个过程持续约24小时，但有时会难以自行破壳。此时，适当敲裂蛋壳可提供帮助。雏鸡必须在24小时内完成出雏过程，否则会因营养耗竭而死亡。
    2. 在动物实验设施（2017-102-01A）中饲养鸡2周。
    3. 在发育第34天（肿瘤第24天），通过吸入异氟烷实施安乐死，随后进行颈椎脱位。
    4. 使用类似于小鼠组织采集的无菌技术解剖肺脏22然后，用4%多聚甲醛在4℃固定过夜，用于石蜡包埋。

3. 免疫组织化学

注意：所有组织切片和苏木精-伊红（H&E）染色均由加州大学洛杉矶分校转化病理学核心实验室（Translational Pathology Core Laboratory, TPCL）完成。

  1. 将切片在 65 °C 下烘烤 20 分钟，然后使用二甲苯脱蜡 3 次，并从 100% 乙醇逐级水化至水。
  2. 在蔬菜蒸锅中用柠檬酸缓冲液煮沸 25 分钟进行抗原修复。
  3. 用 1% BSA 进行封闭，然后加入以 PBS 按 1:200 稀释比例配制的一抗（抗-VHL、抗-HA、抗-flag），在 4 °C 下孵育过夜。
  4. 用 TBST 洗涤 3 次（每次 7 分钟）后，加入按 1:200 稀释的二抗孵育，再用 TBST 洗涤 3 次（每次 7 分钟），随后加入 DAB 试剂，最后进行苏木精复染。

4. 流式细胞术

  1. 根据制造商的说明书，使用红细胞（RBC）裂解缓冲液处理小鼠或鸡的血液。
    注意：在分析CAM血液时，充分的红细胞裂解尤为重要，因为鸡的红细胞含有细胞核，无法通过流式细胞术中的前向散射和侧向散射轻易区分。
  2. 对血液裂解液进行流式细胞术检测，并分析mStrawberry和EGFP的表达情况。
  3. 根据前向散射和侧向散射设置初始门控，排除碎片、死亡细胞以及未裂解的红细胞。
  4. 根据未染色样本和单染对照设置荧光门控。分别使用经VHL-WT、VHL-KO或未标记的RENCA细胞预处理的血液裂解液作为单染对照和未染色对照。

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结果

每个实验至少重复3次，除非另有说明。数据以均值 ± 标准差（SD）表示。当比较两组时，采用配对的Student T检验确定显著性；当比较三组或更多组时，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。显著性阈值设为p值小于0.05。

通过生物发光成像（BLI）和苏木精-伊红（H&E）染色证实，原位移植的RENCA细胞在小鼠肾脏上成功生长（图2A-B）。尽管原发肿瘤生长无明显差异，但仅异质性转移性肿瘤表现出明显的肺转移，表现为强烈的BLI信号以及H&E染色中可见的转移性结节；而均质性非转移性肿瘤则未向远端器官发生转移。携带转移性肿瘤的小鼠循环肿瘤细胞（CTC）计数高于携带非转移性肿瘤的小鼠（图2C-D）。

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讨论

对于许多上皮性恶性肿瘤患者而言，转移至重要器官是导致死亡的主要原因。因此，寻找转移性疾病的潜在机制并开发新的治疗途径至关重要。然而，目前缺乏与转移性透明细胞肾细胞癌（ccRCC）相关的动物模型。这一挑战在很大程度上源于尽管已构建了多种靶向肾上皮细胞的VHL基因敲除转基因小鼠模型，但仍难以在小鼠中成功模拟ccRCC9,10。本文展示了在两种动物系统——小鼠和鸡胚尿囊膜（CAM）中建立可移植性转移性ccRCC肿瘤的方法。这些结果在两种不同的环境中验证了肿瘤的转移行为，从而为深入研究转移的分子机制提供了独特的机会。在第一种模型中，将异质性的RENCA细胞群体原位植入免疫功能健全小鼠的肾包膜下。6周后，这些小鼠出现广泛的肺转移。与小鼠模型一致，将异质性RENCA细胞接种于CAM后，肿瘤成功生长并侵入鸡胚血液循环。通过将肿瘤生长时间延长至孵化后2周，可在雏鸡中观察到与小鼠模型相似的肺转移病灶。

对于这两种模型，仔细关注每一步的技术细节并进行技术技能的练习，对于提高动物存活率以...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由加州大学洛杉矶分校琼森综合癌症中心（UCLA JCCC）种子基金、加州大学洛杉矶分校3R基金、加州大学洛杉矶分校临床与转化科学研究所（UCLA CTSI）以及加州大学烟草相关疾病研究项目（UC TRDRP）（LW）资助。我们感谢克兰普研究所的临床前成像设施、TPCL以及加州大学洛杉矶分校实验动物医学系（DLAM）在实验方法方面提供的帮助。流式细胞术在加州大学洛杉矶分校琼森综合癌症中心（JCCC）和艾滋病研究中心流式细胞术核心设施完成，该设施得到美国国立卫生研究院（NIH）资助项目P30 CA016042和5P30 AI028697，以及JCCC、加州大学洛杉矶分校艾滋病研究所、加州大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院、加州大学洛杉矶分校校长办公室和副校长研究办公室的支持。统计咨询与数据分析服务由加州大学洛杉矶分校临床与转化科学研究所（CTSI）生物统计学、流行病学与研究设计（BERD）项目提供，该项目受美国国立卫生研究院/国家转化科学促进中心资助，项目编号为UL1TR001881。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
不含钙、镁和碳酸氢钠的HBSS中的0.25%胰蛋白酶和0.1%EDTA康宁25053CI
8050-N/18 微型 8V 最大工具包Dremel8050-N/18
抗VHL抗体Abcamab135576
BD Lo-Dose U-100 胰岛素注射器BD 生物科学14-826-79
BD Pharm LyseBD 生物科学555899
BD通用型与精密滑动皮下注射针头Fisher Scientific14-826-5D
DAB显色试剂盒Biocare MedicalDB801R
D-荧光素酶底物，萤火虫，钾盐GoldbioLUCK-1G
不含钙和镁的DPBSGibcoLS14190250
DYKDDDDK标签单克隆抗体（FG4R）eBioscience14-6681-82
乙醇 200 证明圆柱体管理43196-11在水中配制70%的溶液
胎牛血清，经鉴定，美国农业部批准地区Fisher Scientific10-437-028
Fisherbrand 尖头解剖剪Fisher Scientific08-940
Fisherbrand 无菌棉球Fisher Scientific22-456-885
Fisherbrand 高精度直头超细尖镊子/钳子Fisher Scientific12-000-122
Fisherbrand Premium 微量离心管：1.5 mLFisher Scientific05-408-129
4% 甲醛溶液（缓冲液，pH 6.9，约10%福尔马林溶液），用于组织学MilliporeSigma1.00496.5000
汉密尔顿定制注射器Hamilton8040825 µL，型号 702 SN，规格：30，针尖类型：4，角度：30，针头长度：17 mm
HA-探针 抗体 (Y-11)Santa Cruz Biotechnologysc805
血细胞计数板豪泽科学3100
Hovabator Genesis 1588 豪华型孵蛋器组合套装培养箱仓库HB1588D
异氟烷（Isothesia）溶液Henry Schein 动物健康1169567762
IVIS Lumina II 活体成像系统Perkin Elmer
Matrigel GFR 基底膜基质康宁C354230
Medline 外科器械罩巾，透明粘性，24" ×18"Medex SupplyMED-DYNJSD2158
OmniPur BSA，第五组分［牛血清白蛋白］热休克分离MilliporeSigma2910-25GM
青霉素-链霉素溶液，100倍浓缩液，10,000 IU 青霉素，10,000 μg/mL 链霉素Fisher ScientificMT-30-002-CI
戊巴比妥钠Sigma Aldrich57-33-0用生理盐水配制1%溶液
辣根过氧化物酶标记的AffiniPure山羊抗小鼠IgG（H+L）杰克逊免疫研究实验室115-035-062
辣根过氧化物酶标记的AffiniPure山羊抗兔IgG（H+L）杰克逊免疫研究实验室111-035-045
聚维酮碘溶液 USP，10% (w/v)，含有效碘 1% (w/v)，用于实验室用途Ricca Chemical395516
pSicoRAddgene11579
嘌呤霉素二盐酸盐水合物，99%，ACROS OrganicsFisher ScientificAC227420500
RencaATCCCRL-2947
含L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基（改良型），1×康宁10040CV
科学级96孔无裙边平顶板Fisher ScientificAB-0700
SHARP 精密屏障吸头，适用于 P-200，200 个 µ升，960（10个架子，每个96个）托马斯科学公司1159M40
多功能封箱胶带，1.89" 6卷装，每卷109.4码，棕色Office Depot220717
缝合EthiconJ385H
Tegaderm 透明敷料 原装边框式 2 3/8" 2 3/4 倍"摩尔医学1634
Thermo-Chicken 加热垫K&安和制造1000
Tygon 透明实验室管路 - 1/4 英寸 × 3/8 英寸 × 1/16 英寸壁厚（50 英尺）TygonAACUN017
VHL-KOCRISPR/Cas9 介导的 VHL 敲除，随后通过慢病毒标记 Flag 标签的 EGFP &和萤火虫荧光素酶
VHL-WT慢病毒标记的HA标签mStrawberry荧光蛋白 && 萤火虫荧光素酶
World Precision Instrument FORCEPS IRIS 10CM CVD SERRFisher Scientific50-822-331
伤口自闭合夹具套装Braintree Scientific, Inc.ACS KIT
二甲苯（组织学用），Fisher ChemicalFisher ScientificX3S-4

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