转移性透明细胞肾细胞癌是一种尚无全面动物模型用于深入临床前研究的疾病。本方案介绍了该疾病的两种新型动物模型：原位移植小鼠模型和鸡绒毛尿囊膜模型，这两种模型均能表现出类似临床病例的肺转移。
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方法文章
比较在小鼠肾脏和鸡绒毛尿囊膜上建立的转移性透明细胞肾细胞癌模型
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
转移性透明细胞肾细胞癌（ccRCC）是肾癌最常见的亚型。局限性ccRCC的手术治疗效果良好。然而，约三分之一的ccRCC患者会发展为肺转移，这与患者的极差预后密切相关。遗憾的是，由于转移的分子机制尚不清楚，目前尚无针对这一致命阶段的有效疗法。已知25年来，Von Hippel-Lindau（VHL）肿瘤抑制基因功能的丧失是ccRCC的特征性病理标志。然而，至今尚未建立具有临床相关性的ccRCC转基因小鼠模型。本实验方案的目的是介绍并比较两种新建立的转移性ccRCC动物模型。第一种为小鼠肾内植入模型。在本实验室中，利用CRISPR基因编辑系统在多种RCC细胞系中敲除VHL基因。将异质性ccRCC细胞群体原位植入小鼠肾包膜，成功建立了可在免疫健全小鼠中产生显著肺转移的新ccRCC模型。第二种模型为鸡绒毛尿囊膜（CAM）系统。与小鼠模型相比，该模型在时间、人力和成本方面更具效率。该模型同样支持显著的肿瘤形成和肿瘤细胞入血（intravasation）。由于CAM模型中肿瘤生长周期较短（仅10天），在收集的胚胎组织中通过免疫组织化学（IHC）未观察到明显转移。然而，当在孵化出的鸡体内将肿瘤生长时间延长两周后，可通过IHC在肺组织中检测到微转移性ccRCC病灶。这两种新型临床前模型将有助于进一步研究转移的分子机制，并可用于建立新的患者来源异种移植模型（PDXs），从而推动针对转移性ccRCC的新型治疗方法的开发。
引言
肾细胞癌（RCC）是第7th 美国最常见的癌症。每年约有74,000名美国人被新诊断出该病，导致超过14,000人死亡（肾透明细胞癌（clear-cell histological subtype, ccRCC）是最常见的亚型，约占肾细胞癌（RCC）病例的80%。局限性恶性肿瘤患者接受肾切除术治疗，5年生存率良好，达73%1然而，25%至30%的患者会出现远处转移，累及肺等重要器官，导致中位生存期仅为13个月，5年生存率仅11%1,2,3. 要改善转移性ccRCC的致命预后，仍需进一步深入理解其转移机制。
VHL 抑癌基因的缺失是大多数人类 ccRCC 病例中观察到的标志性遗传损伤4,5,6,7。然而，VHL 缺失在 ccRCC 中确切的致癌机制尚不清楚。此外，VHL 的表达状态并不能预测 ccRCC 的预后8。值得注意的....
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方案
本文所述所有方法均已获得机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，该委员会指定为加州大学洛杉矶分校校长动物研究委员会（ARC）（ARC 2002-049-53 和 ARC 2017-102-01A）。2002-049-53 方案优化用于将 ccRCC 肿瘤细胞植入裸鼠或 BALB/c 小鼠的肾包膜内。在孵化前于受精鸡胚中进行的肿瘤植入实验无需 IACUC 批准。为延长肺转移形成的观察时间，允许带有 CAM 肿瘤的胚胎孵化并发育为雏鸡。2017-102-01A 方案涵盖此类动物实验。
1. 小鼠原位肿瘤研究
注意：本实验的时间线如图1A所示。这些实验步骤改编自先前的文献11,12。
- 准备用于移植的单细胞悬液
- 使用胰蛋白酶/EDTA将RENCA VHL-WT和VHL-KO细胞从培养皿中消化下来。
- 用血细胞计数板计数细胞，并将细胞重悬于预冷的PBS与细胞外基质溶液1:1混合液中，浓度为1 × 105 个细胞/µL。
注意：异质性移植使用VHL-WT与VHL-KO细胞按1:4的比例混合，同质性移植则仅使用VHL-....
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结果
每个实验至少重复3次，除非另有说明。数据以均值 ± 标准差（SD）表示。当比较两组时，采用配对的Student T检验确定显著性；当比较三组或更多组时，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。显著性阈值设为p值小于0.05。
通过生物发光成像（BLI）和苏木精-伊红（H&E）染色证实，原位移植的RENCA细胞在小鼠肾脏上成功生长（图2A-B）。尽管原发肿瘤生长无明显差异，但仅异质性转移性肿瘤表现出明显的肺转移，表现为强烈的BLI信号以及H&E染色中可见的转移性结节；而均质性非转移性肿瘤则未向远端器官发生转移。携带转移性肿瘤的小鼠循环肿瘤细胞（CTC）计数高于携带非转移性肿瘤的小鼠（图2C-D）。
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讨论
对于许多上皮性恶性肿瘤患者而言，转移至重要器官是导致死亡的主要原因。因此，寻找转移性疾病的潜在机制并开发新的治疗途径至关重要。然而，目前缺乏与转移性透明细胞肾细胞癌（ccRCC）相关的动物模型。这一挑战在很大程度上源于尽管已构建了多种靶向肾上皮细胞的VHL基因敲除转基因小鼠模型，但仍难以在小鼠中成功模拟ccRCC9,10。本文展示了在两种动物系统——小鼠和鸡胚尿囊膜（CAM）中建立可移植性转移性ccRCC肿瘤的方法。这些结果在两种不同的环境中验证了肿瘤的转移行为，从而为深入研究转移的分子机制提供了独特的机会。在第一种模型中，将异质性的RENCA细胞群体原位植入免疫功能健全小鼠的肾包膜下。6周后，这些小鼠出现广泛的肺转移。与小鼠模型一致，将异质性RENCA细胞接种于CAM后，肿瘤成功生长并侵入鸡胚血液循环。通过将肿瘤生长时间延长至孵化后2周，可在雏鸡中观察到与小鼠模型相似的肺转移病灶。
对于这两种模型，仔细关注每一步的技术细节并进行技术技能的练习，对于提高动物存活率以.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由加州大学洛杉矶分校琼森综合癌症中心（UCLA JCCC）种子基金、加州大学洛杉矶分校3R基金、加州大学洛杉矶分校临床与转化科学研究所（UCLA CTSI）以及加州大学烟草相关疾病研究项目（UC TRDRP）（LW）资助。我们感谢克兰普研究所的临床前成像设施、TPCL以及加州大学洛杉矶分校实验动物医学系（DLAM）在实验方法方面提供的帮助。流式细胞术在加州大学洛杉矶分校琼森综合癌症中心（JCCC）和艾滋病研究中心流式细胞术核心设施完成，该设施得到美国国立卫生研究院（NIH）资助项目P30 CA016042和5P30 AI028697，以及JCCC、加州大学洛杉矶分校艾滋病研究所、加州大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院、加州大学洛杉矶分校校长办公室和副校长研究办公室的支持。统计咨询与数据分析服务由加州大学洛杉矶分校临床与转化科学研究所（CTSI）生物统计学、流行病学与研究设计（BERD）项目提供，该项目受美国国立卫生研究院/国家转化科学促进中心资助，项目编号为UL1TR001881。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 不含钙、镁和碳酸氢钠的HBSS中的0.25%胰蛋白酶和0.1%EDTA | 康宁 | 25053CI | |
| 8050-N/18 微型 8V 最大工具包 | Dremel | 8050-N/18 | |
| 抗VHL抗体 | Abcam | ab135576 | |
| BD Lo-Dose U-100 胰岛素注射器 | BD 生物科学 | 14-826-79 | |
| BD Pharm Lyse | BD 生物科学 | 555899 | |
| BD通用型与精密滑动皮下注射针头 | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| DAB显色试剂盒 | Biocare Medical | DB801R | |
| D-荧光素酶底物，萤火虫，钾盐 | Goldbio | LUCK-1G | |
| 不含钙和镁的DPBS | Gibco | LS14190250 | |
| DYKDDDDK标签单克隆抗体（FG4R） | eBioscience | 14-6681-82 | |
| 乙醇 200 证明 | 圆柱体管理 | 43196-11 | 在水中配制70%的溶液 |
| 胎牛血清，经鉴定，美国农业部批准地区 | Fisher Scientific | 10-437-028 | |
| Fisherbrand 尖头解剖剪 | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Fisherbrand 无菌棉球 | Fisher Scientific | 22-456-885 | |
| Fisherbrand 高精度直头超细尖镊子/钳子 | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Fisherbrand Premium 微量离心管：1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 4% 甲醛溶液（缓冲液，pH 6.9，约10%福尔马林溶液），用于组织学 | MilliporeSigma | 1.00496.5000 | |
| 汉密尔顿定制注射器 | Hamilton | 80408 | 25 µL，型号 702 SN，规格：30，针尖类型：4，角度：30，针头长度：17 mm |
| HA-探针 抗体 (Y-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc805 | |
| 血细胞计数板 | 豪泽科学 | 3100 | |
| Hovabator Genesis 1588 豪华型孵蛋器组合套装 | 培养箱仓库 | HB1588D | |
| 异氟烷（Isothesia）溶液 | Henry Schein 动物健康 | 1169567762 | |
| IVIS Lumina II 活体成像系统 | Perkin Elmer | ||
| Matrigel GFR 基底膜基质 | 康宁 | C354230 | |
| Medline 外科器械罩巾，透明粘性，24" ×18" | Medex Supply | MED-DYNJSD2158 | |
| OmniPur BSA，第五组分［牛血清白蛋白］热休克分离 | MilliporeSigma | 2910-25GM | |
| 青霉素-链霉素溶液，100倍浓缩液，10,000 IU 青霉素，10,000 μg/mL 链霉素 | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| 戊巴比妥钠 | Sigma Aldrich | 57-33-0 | 用生理盐水配制1%溶液 |
| 辣根过氧化物酶标记的AffiniPure山羊抗小鼠IgG（H+L） | 杰克逊免疫研究实验室 | 115-035-062 | |
| 辣根过氧化物酶标记的AffiniPure山羊抗兔IgG（H+L） | 杰克逊免疫研究实验室 | 111-035-045 | |
| 聚维酮碘溶液 USP，10% (w/v)，含有效碘 1% (w/v)，用于实验室用途 | Ricca Chemical | 395516 | |
| pSicoR | Addgene | 11579 | |
| 嘌呤霉素二盐酸盐水合物，99%，ACROS Organics | Fisher Scientific | AC227420500 | |
| Renca | ATCC | CRL-2947 | |
| 含L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基（改良型），1× | 康宁 | 10040CV | |
| 科学级96孔无裙边平顶板 | Fisher Scientific | AB-0700 | |
| SHARP 精密屏障吸头，适用于 P-200，200 个 µ升，960（10个架子，每个96个） | 托马斯科学公司 | 1159M40 | |
| 多功能封箱胶带，1.89" 6卷装，每卷109.4码，棕色 | Office Depot | 220717 | |
| 缝合 | Ethicon | J385H | |
| Tegaderm 透明敷料 原装边框式 2 3/8" 2 3/4 倍" | 摩尔医学 | 1634 | |
| Thermo-Chicken 加热垫 | K&安和制造 | 1000 | |
| Tygon 透明实验室管路 - 1/4 英寸 × 3/8 英寸 × 1/16 英寸壁厚（50 英尺） | Tygon | AACUN017 | |
| VHL-KO | CRISPR/Cas9 介导的 VHL 敲除，随后通过慢病毒标记 Flag 标签的 EGFP &和萤火虫荧光素酶 | ||
| VHL-WT | 慢病毒标记的HA标签mStrawberry荧光蛋白 && 萤火虫荧光素酶 | ||
| World Precision Instrument FORCEPS IRIS 10CM CVD SERR | Fisher Scientific | 50-822-331 | |
| 伤口自闭合夹具套装 | Braintree Scientific, Inc. | ACS KIT | |
| 二甲苯（组织学用），Fisher Chemical | Fisher Scientific | X3S-4 |
参考文献
- Cohen, H. T., McGovern, F. J. Renal-cell carcinoma. The New England Journal of Medicine. 353 (23), 2477-2490 (2005).
- Bianchi, M., et al. Distribution of metastatic sites in renal cell carcinoma: a population-based analysis. Annals of Oncology. 23
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