本文介绍了三种用于研究人源化小鼠中 HIV 感染动态的实验方法。第一种方法可用于研究慢性感染过程，而另外两种方法则适用于研究初次感染或病毒再激活后的急性事件。
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本文内容
摘要
摘要
人源化 NOD/SCID/IL-2 受体 γ 链null 小鼠可模拟人类免疫系统的某些特征，因此可用于传染病的基础研究和临床前研究。本文描述了三种用于研究 HIV 感染动态的人源化免疫缺陷小鼠模型。第一种模型基于在新生小鼠中肝内注射 CD34+ 造血干细胞，可重建多种血液细胞和局限于淋巴组织的细胞，随后接种标准 HIV 毒株。该模型可在感染后持续监测长达 36 周，因此被称为慢性模型。第二和第三种模型分别称为急性模型和再激活模型，均通过向成年小鼠腹腔注射外周血单个核细胞建立。在急性模型中，通过腹腔途径移植健康供体的细胞，随后接种标准 HIV 毒株。而在再激活模型中，则通过腹腔途径移植正在接受抗逆转录病毒治疗的 HIV 感染者供体的细胞。由于小鼠体内无药物作用，可促使病毒再激活并导致病毒载量上升。本文提供的实验方案描述了 HIV 感染人源化免疫缺陷小鼠模型的常规实验方法。
引言
人源化的NOD/SCID/白细胞介素（IL）-2受体γ链null（下文简称huNS γ链null）小鼠模型已被广泛用于感染、自身免疫和癌症的发病机制研究，以及药物和人源细胞治疗的临床前研究1,2。这些小鼠基于非肥胖型糖尿病（NOD）遗传背景，携带scid突变以及IL-2受体γ链基因座（即IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21的共同γ链）的靶向突变，导致小鼠T细胞、B细胞和自然杀伤（NK）细胞的发育严重受损1。因此，该模型能够支持人源组织、人CD34+造血干细胞（HSCs）以及人外周血单个核细胞（PBMCs）的移植3,4,5。此外，通过转基因表达人源造血因子，如干细胞因子（SCF）、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和IL-3，可进一步促进人源髓系细胞群体的植入6,7,8。
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方案
本研究中所有动物护理和操作均按照马里兰大学医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）审查并批准的方案进行（方案编号：1018017、1018018 和 0318009）。
1. 新生小鼠中人CD34+造血干细胞的移植
- 始终使用一次性个人防护装备（PPE），包括无菌刷手服、手套、专用鞋、鞋套、口罩、护目镜、头罩/胡须罩以及无菌实验服。
- 重悬 1 x 106 冻存的CD34+ HSCs（参见 材料表在10 mL含10% FBS的RPMI 1640培养基中，于认证的生物安全柜内操作，并保持无菌条件。
- 取10 µL悬液，用台盼蓝排染法在血细胞计数板中进行细胞计数（以确认细胞数量符合预期）并检测细胞活力。
- 400离心 x g 室温（RT）孵育15分钟。弃去上清液，用预冷的1×PBS重悬至所需浓度（1.4 × 10⁶）。5 CD34的+ 50 µL中的HSCs）。将细胞置于冰上直至注射。
- 将幼鼠（NS γ链）null 1至4日龄的雌雄幼鼠）放入无菌的100 mm2 培养皿及来自繁殖笼的一小部分垫料。此外，将干净的垫料在手中揉搓，以进一步掩盖受体幼崽身上可能存在的外来气味。
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结果
如上所述，在造血干细胞（HSC）注射后14周（慢性模型）或外周血单个核细胞（PBMC）注射后3周（急性和再激活模型），对小鼠进行采血，通过流式细胞术检测人源细胞嵌合水平。用于评估1）人源CD45+细胞重建情况以及2）CD4+和CD8+ T细胞百分比的代表性设门策略见图1A。通常，在CD34+ HSC注射后，嵌合水平（人源CD45+细胞百分比）范围为10%–80%，具体数值取决于注射途径和小鼠品系等多种前述因素（图1B）。在PBMC注射后，嵌合水平（人源CD45+或CD3+细胞百分比）范围为5%–65%，不同小鼠品系之间也存在差异（图1B）。此外，使用来自健康供体与HIV感染供体的PBMC注射的小鼠之间也可观察.......
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讨论
在用于人源化研究的免疫缺陷小鼠品系开发方面已取得重要进展，目前有多种不同选择可根据研究需求进行使用1。本文提供了一种通用方案，用于对NS γ-chainnull小鼠及其遗传背景相似品系进行人源化，以应用于三种不同的HIV感染研究模型。在第一种实验方法中，对新生小鼠进行照射后，注射来源于脐带血、胎儿肝脏或动员后外周血的人源CD34+造血干细胞（HSCs）3,21。对NS γ-chainnull小鼠进行适当的照射是关键步骤，因其可清除小鼠骨髓及其他前体细胞，从而实现人源细胞群体的有效重建。然而，已有部分研究报告显示，在某些小鼠品系中无需照射亦可实现人源细胞的重建27。在此方面，必须提供合适的照射剂量，因为NS γ-chainnull小鼠具有放射敏感性，过高的γ射线照射可能诱发胸腺淋巴瘤的发生21<.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由IHV临床部门内部资金资助JCZ。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5 ml 微量离心管 | Neptune | 3735.S.X | |
| 1.5 ml 微量离心管 | Neptune | 3745.S.X | |
| 10 ml 血清移液管 | Stellar Scientific | VL-4090-0010 | |
| 15 ml 锥形管 | Stellar Scientific | T15-600 | |
| 25 ml 血清移液管 | Stellar Scientific | VL-4090-0025 | |
| 5 ml 血清移液管 | Stellar Scientific | VL-4090-0005 | |
| 50 ml 锥形管 | Stellar Scientific | T50-600 | |
| ACK 裂解缓冲液 | Quality Biological | 118-156-101 | |
| 酒精消毒片 | Fisher Scientific | 06-669-62 | 无菌 |
| 抗人 CD3 单克隆抗体 UCHT1 | Biolegend | 300439 | APC 标记 |
| 抗人 CD4 单克隆抗体 OKT4 | Biolegend | 317420 | AF488 标记 |
| 抗人 CD45 单克隆抗体 2D1 | Biolegend | 368522 | BV421 标记 |
| 抗人 CD8 单克隆抗体 SK1 | Biolegend | 344710 | PerCP-Cy5.5 标记 |
| 生物安全柜二级 | 处理异氟烷时，如有可能应连接排风烟囱 | ||
| 头罩 | Fisher Scientific | 17-100-900 | 一次性使用，用于基本防护 |
| Cavicide | Metrex | 13-1000 | 表面消毒剂 |
| CD34+ 细胞 | Lonza | 2C-101 | 来自单一供体的尽可能多的小瓶 |
| 离心机 | Beckman | 65-6KR | |
| 透明广口瓶 | Amazon | 77977 | |
| 无菌棉纱垫 | Fisher Scientific | 22-415-468 | 无菌 |
| 一次性实验服 | Fisher Scientific | 19-472-422 | |
| EDTA 微量管 | Greiner Bio-One | 450480 | |
| 口罩 | Fisher Scientific | 17-100-897 | |
| FACS 溶血液 | BD | 340202 | |
| 优质灭活胎牛血清（FBS） | Atlanta Biologicals | S1115OH | |
| Ficoll | GE Health One | 17-1440-02 | |
| 流式细胞仪 | 我们使用的是 FACS Aria II | ||
| 流式细胞术专用管 | Falcon | 352054 | 5 ml 聚苯乙烯圆底管 |
| HIV BaL | 由本单位 uQUANT 核心设施制备 | ||
| 人外周血单个核细胞（PBMCs） | HIV 阳性和阴性志愿者提供 | ||
| 红外加热垫 | Venet Scientific | DCT-25 | 用于小型动物的临时治疗性加热垫 |
| Isentress（拉替格韦） | Merck | NSC 0006-0227061 | 抗逆转录病毒药物，用于治疗人类免疫缺陷病毒（HIV）感染，为整合酶抑制剂 |
| 异氟烷 | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Mark I 照射仪 | 马里兰大学所属设备 | ||
| 微量移液器 | |||
| 微量离心机 | Eppendorf | ||
| 小鼠耳标 | National Band & Tag Company | 1005-1L1 | |
| Natelson 血液采集管 | Fisher Scientific | 02-668-10 | |
| NOG-EXL | Taconic | HSCFTL-13395-F | |
| NSG 小鼠 | Jackson | 5557 | 用于 CD34 植入的妊娠雌鼠及用于 PBMC 植入的幼鼠 |
| NSG-SGM3 | Jackson | 13062 | |
| 16% 多聚甲醛 | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| PBS 1×，pH 7.4 | Gibco | 100-10-023 | |
| 培养皿 | Fisher Scientific | 08-757-28 | |
| QuantStudio qPCR 仪 | Thermo | QS3 | |
| 试剂储液槽 | Costar | 4870 | |
| RPMI 1640 培养基 1× | Gibco | 11875-093 | |
| 鞋套 | Fisher Scientific | 17-100-911 | |
| 无菌一次性手套 | Microflex | SUF-524 | |
| SuperScript II 第一链合成预混液 | Invitrogen | 10080-400 | cDNA 合成 |
| 28-G × 1/2 注射器 | BD | 329-461 | |
| 29-G × 1/2 注射器 | BD | 324-702 | |
| Truvada（恩曲他滨和替诺福韦） | Gilead | NDC 61958-0701-1 | 抗逆转录病毒药物，用于治疗人类免疫缺陷病毒（HIV）感染，为核苷类逆转录酶抑制剂 |
| 台盼蓝 | Sigma | T8154 | 细胞计数和活力检测 |
| Vicks Vaporub | School Health | 43214 | 以薄荷醇和桉叶油为主要成分的软膏 |
| 分子生物学级水 | Quality Biological | 351-029-131 |
参考文献
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7, 118-130 (2007).
- Koboziev, I., et al. Use of humanized mice to study the pathogenesis of autoimmune and inflammatory....
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重印与许可
