肺炎链球菌在持续流动条件下感染原代人内皮细胞

摘要

本研究描述了在定义的流动条件下，通过剪切应力作用于分化的人原代内皮细胞表面产生的血管性血友病因子串，对肺炎球菌黏附进行显微监测的方法。通过应用差异免疫染色程序，该方案可进一步扩展至对特定细胞结构的详细可视化及细菌的定量分析。

摘要

肺炎链球菌与内皮细胞表面的相互作用在血流中通过机械敏感性蛋白（如血管性血友病因子（VWF））介导。这种糖蛋白会响应剪切应力而改变其分子构象，从而暴露出多种宿主配体相互作用的结合位点。通常，在确定的剪切流条件下培养原代内皮细胞，可促进特定的细胞分化，并形成稳定且紧密连接的内皮层，类似于血管内壁的生理状态。因此，对涉及机械敏感性蛋白的细菌病原体与宿主血管系统之间相互作用的功能分析，需要建立能够模拟影响血管细胞表面的生理流体剪切力的泵系统。

本研究中使用的微流控装置能够以定义的流速实现流体的连续、无脉冲循环。计算机控制的气压泵系统通过产生连续、单向且可控的培养基流动，在内皮细胞表面施加定义的剪切应力。利用专为显微观察设计的通道载玻片，可在流动条件下对细胞的形态变化及细菌黏附进行显微监测与定量分析。与通常需要在免疫标记和显微分析前对样品进行固定的静态细胞培养感染相比，微流控载玻片既可在样品固定后实现基于荧光的蛋白质、细菌和细胞组分检测、连续免疫荧光染色，也可进行实时的荧光直接检测。结合荧光标记的细菌和特异性荧光标记抗体，该感染方法为涉及血管过程的广泛科学研究应用提供了一种高效的多组分可视化系统。

引言

肺炎链球菌感染的发病机制表现为与多种细胞外基质成分以及人体止血系统组分（如纤溶酶原和血管性血友病因子VWF）之间复杂的相互作用^{1,2,3,4,5,6,7,8}。多结构域糖蛋白VWF通过介导血小板募集以及在血管血栓形成部位促进纤维蛋白整合，从而在维持止血平衡中发挥关键调控作用⁹。功能性活性VWF在止血控制和伤口愈合中的重要性，可通过冯·威勒布兰德病（von Willebrand’s disease）得以证实，该病是一种常见的遗传性出血性疾病¹⁰。

球形血管性血友病因子（VWF）在人体血液循环系统中以最高达 14.0 µg/mL 的浓度循环存在^11,10<....

方案

微流控细胞培养实验采用商业化的原代人脐静脉内皮细胞（HUVEC）进行。该公司在供体知情同意的情况下分离了这些细胞。本研究已获得德国巴登-符腾堡州医师协会伦理委员会批准，批准编号为219-04。

注意：实验所需材料请参见材料表。

1. 原代内皮细胞的预培养

1. 在37 °C下轻轻解冻一支含有1 × 10⁵个来自三位不同供体的原代HUVEC的冻存甘油管，将细胞接种于25 cm²细胞培养瓶中，加入7 mL预热的内皮细胞生长培养基（ECGM，含补充剂，即用型）。
   注意：原代内皮细胞在经历超过5次增殖周期后会丧失分化能力。因此，若需要高程度的细胞分化，仅可使用传代次数少于5次的细胞。
2. 将细胞置于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养60分钟，以促进细胞贴壁，随后更换ECGM培养基，以去除冷冻保存残留物。
3. 继续在37 °C、5% CO₂的环境中培养细胞，直至形成亚融合的细胞层。
   注意：HUVEC不可生长至完全融合状态，因为紧密的细胞间连接会影响后续在流动条件下形成稳定细胞层的能力。

结果

在持续单向流动条件下培养原代人脐静脉内皮细胞（HUVEC），可形成融合且紧密排列的细胞层，促进细胞内生成富含对机械力敏感的血管性血友病因子（VWF）的魏贝尔-帕拉德小体（WPBs）^13,14。本方案描述了一种基于气压泵的无脉冲循环系统，用于感染分析，该系统可模拟人体血流中的剪切应力环境。

该系统能够设定明确且由软件控制的流动条件。流动方案如下 图1 展示了主要工作流程，从原代内皮细胞的预培养开始（图1，插图1）以及肺炎链球菌的预培养（图1，插图2）。所应用的微流控系统（图1, 插图3）由一种特殊的通道载玻片组成，该载玻片通过鲁尔接头连接至带有两个培养基储液器的灌注管路。灌注管路组件置于一个流体控制.......

讨论

模拟细菌与机械敏感性宿主蛋白（如VWF）的相互作用，需要一种可灌注的细胞培养系统，以实现液体的明确定向、持续流动，从而产生可靠的剪切应力。已有多种微流控泵系统被报道。Bergmann 等人的一篇综述全面总结了不同二维和三维细胞培养模型的关键特征¹⁷。

微流控技术是一项始于20世纪90年代初的新兴技术，其特点是在微米甚至纳米尺度上构建可控、可重复且可灌注的微环境¹⁸。本文介绍的微流控方法也可用于研究广泛的细菌黏附机制及其相关蛋白。该技术尤其适用于涉及力学响应型黏附组分（如VWF）的相互作用研究，而这类过程通常无法通过标准的细胞培养技术进行探究。例如，已知多种细胞外基质蛋白的构象会因其所在位置的不同而发生变化。在血液循环系统中，纤维连接蛋白等糖蛋白以球状构象存在，而在细胞外基质中，这些蛋白则呈现为多连接的二聚体及多聚体支架结构^19,20。此外，多家微流控设备供应商提供已预包被.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 鲁尔注射器	Fisher Scientific	10303002	用于通过载片的鲁尔接头注入明胶，容量为 1 mL
2 mL 鲁尔注射器	Sarstedt	9077136	用于向通道载片的鲁尔连接处移液或注入液体
Accutase	eBioscience 现属 Thermo Fisher	00-4555-56	用于轻柔解离内皮细胞的蛋白酶混合物
AlexaFluor350 标记的鬼笔环肽	Abcam	ab176751	厂家未提供浓度，原液可满足 300 次检测，公司建议使用 1:1,000 稀释液 100 µL，蓝色荧光（DAPI 滤光片设置）
AlexaFluor488 标记的山羊抗小鼠抗体	Thermo Fisher Scientific	A11001	原液浓度：2 mg/mL，用于微流控载片中人 VWF 经 PFA 固定后的免疫染色，绿色荧光
AlexaFluor568 标记的山羊抗兔抗体	Thermo Fisher Scientific	A-11011	原液浓度：2 mg/mL，用于微流控载片中肺炎链球菌经 PFA 固定后的免疫染色，红色荧光
胰蛋白胨大豆肉汤（Bacto Todd-Hewitt-Broth）	Becton Dickinson GmbH	BD 249210	复杂的细菌培养基
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma Aldrich	A2153-25G	溶解后用于配制封闭缓冲液
带滤器的细胞培养瓶	TPP	90026	用于在 25 cm2 表面积的未包被细胞培养瓶中继代培养 HUVEC
Allegra X-12R 离心机	Beckman Coulter Life Sciences	392304	用于离心沉淀细菌（体积大于 >2 mL）
Allegra X-30 离心机	Beckman Coulter Life Sciences	B06314	用于离心沉淀真核细胞
Z 216 MK 离心机	Hermle	305.00 V05 - Z 216 M	用于离心沉淀细菌（体积小于 2 mL）
氯霉素	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	3886.2	以 0.2 mg/mL 浓度用于培养携带红色荧光蛋白和氯霉素抗性盒的遗传构建体转化的肺炎链球菌
灌注管路夹具	ibidi	10821	在将载片连接至泵系统前，用于夹住管路中的液体
CO2 培养箱	Fisher Scientific	MIDI 40	培养箱尺寸与连接通道载片的流体单元完全匹配，用于在 37 °C 和 5% CO2 条件下进行流动培养
CO2 培养箱	Sanyo	MCO-18 AIC	用于在 5% CO2 和 37 °C 条件下，在特定气氛中培养细菌和细胞
哥伦比亚血琼脂平板	Becton Dickinson GmbH	PA-254005.06	含 7% 羊血的琼脂基复杂培养基，用于S. pneumoniae培养
计算机	Dell	Latitude 3440	配备压力泵软件的计算机
共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）	Leica	DMi8	倒置显微镜，配备可加热培养室的载物台，以及带有荧光滤光片、氙光源（SP8, DMi8）和 DFC 365 FX 相机（1392 x 1040，140 万像素）的荧光单元
磷酸氢二钾（KH2PO4）	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	3904.1	用于配制 PBS 缓冲液
干燥材料	Merck	101969	橙色硅胶珠，用于带管路接头的玻璃瓶中干燥
ECGM 补充剂混合液	Promocell	C-39215	ECGM 培养基补充剂混合液，用于内皮细胞的预培养：0.02 mL/mL 胎牛血清，0.004 mL/mL 内皮细胞生长补充剂，0.1 ng/mL 表皮生长因子，1 ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子，90 µg/mL 肝素，1 µg/mL 氢化可的松
ECGMS	Promocell	C-22010	ECGM 培养基中添加 5% [w/w] FCS 和 1 mM MgSO4 以增强细胞黏附
内皮细胞生长培养基（ECGM，即用型）	Promocell	C-22010	HUVEC 培养基，已添加所有补充剂组分
胎牛血清（FCS）	biochrome 现属 Merck	S 0415	细胞培养补充剂，用于感染分析
FITC 标记的山羊抗人 VWF 抗体	Abcam	ab8822	原液浓度：10 mg/mL，用于流动条件下球状及多聚体 VWF 的免疫检测
流体单元	ibidi	10903	用于流动培养的流体单元
明胶（猪源）	Sigma Aldrich	G-1890-100g	用于微载片通道表面的预包被
盐酸组胺	Sigma Aldrich	H-7250-10MG	用于诱导内皮细胞 Weibel-Palade 小体分泌 VWF
人脐静脉内皮细胞（HUVEC）	Promocell	C-12203 批号 396Z042	来自混合供体的原代内皮细胞，液氮中冷冻保存
小鼠来源的人 VWF 特异性抗体（单克隆）	Santa Cruz	sc73268	原液浓度：200 µg/mL，用于 PFA 固定后微流控载片中 VWF 的免疫染色
注射口	ibidi	10820	用于在流动循环过程中向储液管路中注入组胺或细菌
光学显微镜	Zeiss	Axiovert 35M	倒置光学显微镜，配备 40 倍水镜，可实现 400 倍放大，用于检测真核细胞的脱落和细胞计数
Luer 载片 I0.4（ibiTreat472microslides）	ibidi	80176	经物理改性的载片，用于流体培养（μ–Slide I0.4Luer，通道高度 0.4 mm，通道体积 100 μl，生长面积 2.5 cm，包被面积 25.4 cm2），适用于各类流动实验，物理处理可产生亲水且具黏附性的表面
硫酸镁（MgSO4，无水）	Sigma Aldrich	M7506-500G	用于配制 ECGMS 培养基
微流控泵	ibidi	10905	气压泵
Neubauer 细胞计数板	Karl Hecht GmbH&Co KG	40442002	用于 HUVEC 的显微镜下细胞计数
16% 戊二醛（PFA）	Electron Microscopy Sciences	15710-S	用于样品交联
灌注套装	ibidi	10964	黄色/绿色灌注套装，管路内径 1.6 mm，管长 50 cm，总工作体积 13.6 mL，死体积 2.8 mL，储液器容量 10 mL。与 µ-slide L0.4Luer 配合使用，在 37 °C、黏度为 0.0072 dyn x s/cm2 的条件下，可实现 3.8 mL/min 至 33.9 mL/min 的流速范围，剪切应力范围为 3.5 dyn/cm2 至 31.2 dyn/cm2。适用于微流控，管长 50 cm
磷酸盐缓冲液（PBS）			使用以下试剂配制：0.2 g/L KCl，1.44 g/L Na2HPO4，0.24 g/L KH2PO4，pH 7.4
塑料比色皿	Sarstedt	67,741	（双光路），用于 600 nm 处光密度（OD）测定
肺炎链球菌特异性抗血清	Pineda		以热灭活的Streptococcus pneumoniae NCTC10319 和 D39 免疫兔制备，经蛋白 A-Sepharose 柱纯化 IgG
聚苯乙烯或泡沫塑料板			此为预防措施，避免通道载片中接种的细胞受到冷应激。任何类型的泡沫塑料（如包装箱材料）均可使用。板厚约 0.5 cm，尺寸应为 20 cm2。
氯化钾（KCl）	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	6781.1	用于 PBS 缓冲液
泵控制软件（PumpControl v1.5.4）	ibidi	v1.5.4	用于控制压力泵、设定流动条件并启动/停止流动的计算机软件
1.5/2.0 mL 反应管	Sarstedt	72.706/ 72.695.500	用于抗体稀释
50 mL 反应管	Sarstedt	6,25,48,004
表达 RFP 的肺炎链球菌	英国国家典型培养物保藏中心（Public Health England）	10,319	47 型肺炎链球菌，基因组中整合了与组蛋白样蛋白融合的 RFP
5 mL、10 mL 移液管	Sarstedt	86.1253.025/ 86.1254.025	用于移取较大体积液体
碳酸钠（Na2CO3，无水）	Sigma Aldrich	451614-25G	用于配制 100 mM 碳酸钠缓冲液
磷酸二氢钠（NaH2PO4）	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	P030.2	用于 PBS 缓冲液
光谱光度计 Libra S22	Biochrom	80-2115-20	用于测定细菌悬液在 600 nm 处的光密度（OD）
蔗糖	Sigma Aldrich	S0389-500G	用于配制封闭缓冲液
吐温 X-100	Sigma Aldrich	T9284-500ML	使用 0.1% 终浓度，溶于 dH20，用于 PFA 固定后真核细胞的通透处理
酵母提取物	oxoid	LP0021	在含 1% [w/w] 酵母提取物的 THB 培养基中培养细菌 = 完整细菌培养基 THY