通过反相液相-质谱法对无细胞蛋白合成代谢的绝对定量

无细胞蛋白质合成（CFPS）是制造蛋白质和化学品的有前途的平台，这种应用传统上是为活细胞保留的。无细胞系统来自粗细胞提取物，并消除与细胞生长相关的^{并发症1。}此外，CFPS 允许直接访问代谢物和生物合成机械，无需细胞壁干扰。然而，对无细胞过程的性能限制缺乏基本的了解。高通量代谢物定量方法对代谢表征有价值，对代谢计算^{模型2、3、4}的构建至关重要。用于确定代谢物浓度的常见方法包括核磁共振 （NMR）、傅立叶变换红外光谱 （FT-IR）、基于酶的测定法和质谱 （MS）^{5、6、7 ，8}.然而，这些方法往往受限于它们无法同时有效地测量多种化合物，并且通常需要比典型的无细胞反应更大的样本大小。例如，基于酶的检测通常只能用于在运行中量化单个化合物，并且在样本量较小时（如无细胞蛋白合成反应（通常在 10-15 μL 尺度上运行）时受到限制。同时，NMR需要高丰度代谢物来检测和^定量5。 针对这些缺点，色谱方法与质谱（LC/MS）结合提供了几个优点，包括高灵敏度和同时测量多个物种^的能力9;然而，分析复杂性随着被测量物种的数量和多样性而大大增加。因此，开发能够充分实现LC/MS系统高通量潜力的方法非常重要。样品中的化合物通过液相色谱分离，并通过质谱法进行鉴定。化合物的信号取决于其浓度和电电化效率，其中电电化在化合物之间可能有所不同，也可能取决于样品矩阵。

在使用LC/MS对分析物进行量化时，在样品和标准之间实现相同的电电化效率是一项挑战。此外，由于质子亲和力和极^性10的信号分裂和异质性，代谢物多样性的定量变得更加具有挑战性。最后，样品的共解基质也会影响化合物的电电化效率。为了解决这些问题，代谢物可以化学衍生，提高LC/MS系统的分离分辨率和灵敏度，同时在某些情况下减少信号^{分裂10，11}。化学衍生的工作原理是标记代谢物的特定功能组，以调整其物理特性，如电荷或疏水性，以提高电化^效率11。各种标记剂可用于针对不同的功能组（例如，胺、羟基、磷酸盐、碳化物酸等）。Aniline，一种这样的衍生剂，一次瞄准多个功能组，并在亲水分子中加入疏水成分，从而提高其分离分辨率和^信号12。为了解决共发基质电抑制效应，杨和同事开发了一种基于组特定内部标准技术 （GSIST） 标签的技术，其中标准标有^{13 C}阴宁同位素，并与样品^{混合12，13}.代谢物和相应的内部标准自共溶以来具有相同的电化效率，其强度比可用于定量实验样品中的浓度。

在这项研究中，我们开发了一个协议来检测和量化参与糖解的40种化合物，磷酸五氯苯星通路，三聚碳酸循环，能量代谢和CFPS反应中的副因子再生。该方法基于GSIST方法，^{我们使用12种C-}单一素^和13种C-aniline来标记、检测和量化代谢物，使用逆相LC/MS。所有化合物的线性范围跨越2-3个数量级，平均相关系数为0.988。因此，该方法是一种可靠而准确的方法，用于询问无细胞代谢，以及可能全细胞提取物。

1. 制备用于使用线标的的试剂

1. 在 pH 4.5 下制备 6 M 丙琳溶液。在发动机罩中工作，将 550 μL 的苯氨酸与 337.5 μL 的 LCMS 级水和 112.5 μL 的 12 M 盐酸 （HCl） 组合在离心管中。涡旋井，储存在4°C。
   注:Aniline 可在 4°C 下储存 2 个月。
   注意:Aniline 是剧毒的，应在烟罩中使用。盐酸具有很强的腐蚀性
2. 在 pH 4.5 下制备 6 M ¹³C 丙宁溶液。将 250 mg^{的 13}C₆- 阴宁与 132 μL 的水和 44 μL 的 12 M HCl 涡流井结合，并储存在 4°C。
3. 制备200mg/mL N-（3-二甲基氨基）-N-乙基甲酰盐酸（EDC）溶液。将2毫克EDC溶解在10μL水中，用于每个样品被标记和涡旋井。
   注:EDC溶液应在反应当天制备。EDC是使用一氧化^{二线的化合物}衍生的催化剂。

2. 制定标准

1. 对溶解在LC/MS级水中的所有化合物进行单独的库存溶液（表1）。
2. 准备内部标准库存解决方案
   1. 除烟酰胺腺苷二核苷酸（NAD）、烟酰胺腺苷二核苷酸（NADP）、弗拉文腺苷二核苷酸（FAD）、乙酰辅酶A（ACA）和甘油3-磷酸盐（Gly3P）外的所有化合物，并适当体积为所有化合物创建 2 mM 库存溶液。
3. 将 NAD、NADP、FAD、ACA 和 Gly3P 与适当的卷相结合，创建 2 mM 库存解决方案。

3. 样品制备（图1）

1. 在无细胞蛋白合成反应中，通过在反应中加入同等量的冰冷100%乙醇，将蛋白质淬火和沉淀。在4°C下将样品在12，000 x g下离心15分钟。将上清液转移到新的离心管中。
   注:此时样品可储存在-80°C，稍后分析

4. 贴标反应

1. 带有^{12 种}C-单线溶液的标记样品
   1. 将6μL样品转移到新的离心管中，用水将体积调到50μL。
      注: 体积样本大小可能取决于特定的 CFPS 反应。
   2. 加入5μL的200毫克/毫克EDC溶液。
   3. 加入5 μL^的12种C-单一碱溶液。
      注: 单一线溶液分为两个阶段。加入反应之前，先混合好。
   4. 在室温下，用轻柔的晃动涡旋反应2小时。
   5. 2小时后，从摇床中取出管子，并在烟机罩中向反应中加入1.5 μL的三乙胺（TEA）。
      注: Triethylamine 提高溶液的pH，从而停止苯胺标记反应并稳定化合物。
      注意:三乙胺是有毒的，会引起眼睛和呼吸道的刺激。
   6. 13，500 x g离心 3 分钟。
2. 使用^{13 种}C-单一解决方案标记内部标准
   1. 将内部库存溶液稀释至 80 μM，最终体积为 50 μL。
      注:内部标准的浓度可以调整到接近实验样品的水平。
   2. 加入5μL的200毫克/毫克EDC溶液。
   3. 加入5 μL^的13种C-单一醇溶液。
   4. 在室温下，用轻柔的晃动涡旋反应2小时。
   5. 2小时后，从摇床中取出管子，在烟机罩中向反应中加入1.5 μL的TEA。
   6. 13，500 x g离心 3 分钟。
3. 组合带标签的内部标准和带标签的样本
   1. 将 25 μL^{的 12 个}C-aniline 标记样品与 25 μL 的^{13 个}C-aniline 标配标准混合。
   2. 转移到自动取样器小瓶，并通过LC/MS程序进行分析。
4. 为未标记的代谢物创建标准曲线
   1. 未标记代谢物（NAD、NADP、FAD、ACA 和 Gly3P）的稀释库存溶液，最终浓度为 320 μM、80 μM、20 μM 和 5 μM，体积为 50 μL。
   2. 加入5μL的200毫克/毫克EDC溶液。
   3. 加入5 μL^的12种C-单一碱溶液。
   4. 在室温下，用轻柔的晃动涡旋反应2小时。
   5. 2小时后，从摇床中取出管子，在烟机罩中向反应中加入1.5 μL的TEA。
   6. 13，500 x g离心 3 分钟。
   7. 将上清液转移到自动取样器小瓶，并通过 LC/MS 程序进行分析。
      注: 未标记的代谢物遵循与样本相同的过程来复制样本矩阵，以保持类似的电电化效率。

5. LC/MS 程序的设置

1. 溶剂制备
   1. 用醋酸制备5mM三丁胺（TBA）水溶液，经调节至pH 4.75。
      注:移动相中的TBA帮助分析物实现良好的分辨率和^分离14。
   2. 在醋酸酯 （ACN） 中制备 5 mM TBA。
4. 2. 
      

作为概念验证，我们使用该协议对表达绿色荧光蛋白（GFP）的基于大肠杆菌的CFPS系统中的代谢物进行量化。 CFPS反应（14μL）用乙醇淬火和脱蛋白。然后，CFPS 样本用12 个C-aniline 标记，而标准用13 个C-aniline 标记。然后，将标记的样本和标准组合起来并注入 LC/MS（图 1）。该协议使用内部标准检测并量化了40种参与中央碳和能源代谢的代谢物，同时开发了5种未贴有甲酰甲酰标签的代谢物的标准曲线（图2）。这些途径所涉及的各种代谢物是一类磷酸化糖、磷脂酸、碳水化合物酸、核苷酸和辅助因子。利用苯氨酸的衍生，将疏水性莫伊蒂引入亲水分子中，使用反相色谱12促进更有效的分离。此外，该方法还实现了结构异构体对的分离，如葡萄糖6-磷酸盐和果糖6磷酸盐在一次LC/MS运行。在实验之前，通过一次注射1 mM的化合物并将质量谱与空白进行比较，确定了每种化合物的质量过充（m/z）比率和保留时间（表1）。

通过生成从 0.10 μM 到 400 μM 之间的标准曲线（表 2）， 估计所有化合物的检测极限和线性范围。所有化合物的平均相关系数（R2）为0.988，大多数化合物的线性范围为3级。三种化合物具有显著的饱和效应，特别是α-酮谷酸，其线性范围为0.1 μM至25 μM。

图 1:用于 aniline 标记的工作流架构。无细胞蛋白合成反应脱蛋白，并贴上12种C-苯基苯，标准库存混合物用13种C-苯二系标记。然后，两种混合物以1:1的体积比混合，并由LC/MS进行分析。

图2:40个代谢物的重叠选定环状色谱图。从单个 LC/MS 运行到 40 μM 标准混合物的 40 代谢物的质量色谱图。峰值由每个化合物的保留时间和 m/z 值标识。完整的复合名称及其缩写列在表1中。请点击此处查看此图的较大版本。

表1:代谢物的识别和标记结果。每个化合物的相应峰值数、保留时间、未标记的 m/z 值、标记 12C 和13C 以及 MS 物种。MS 物种，A 代表 Aniline 标签。

表2:具有代表性的CFPS样本中的代谢物定量。每个代谢物的浓度和标准偏差。从标准曲线中识别的检测极限、线性范围和相关系数。

作者没有什么可透露的。