采用反相液相色谱-质谱法对无细胞蛋白合成代谢进行绝对定量

摘要

本文介绍了一种可靠的实验方案，用于定量无细胞蛋白合成反应中涉及中心碳代谢和能量代谢的40种化合物。通过苯胺对无细胞合成混合物进行衍生化处理，以实现反相液相色谱的有效分离，随后使用同位素标记的内标物结合质谱法进行定量分析。

摘要

无细胞蛋白质合成（CFPS）是系统生物学和合成生物学中用于体外蛋白质生产的新兴技术。然而，若要使CFPS走出实验室，成为广泛应用且标准化的即时制造技术，我们必须深入了解这些系统的性能极限。针对这一问题，我们开发了一种稳健的实验方案，用于定量CFPS反应中涉及糖酵解、磷酸戊糖途径、三羧酸循环、能量代谢以及辅因子再生的40种化合物。该方法使用¹³C-苯胺标记的内标物，而样品中的化合物则用¹²C-苯胺进行衍生化。将内标物与样品混合后，采用反相液相色谱-质谱联用技术（LC/MS）进行分析。化合物的共洗脱消除了离子抑制效应，从而实现了在2至3个数量级范围内的代谢物浓度准确定量，平均相关系数达0.988。在40种化合物中，有5种未用苯胺标记，但仍可在CFPS样品中被检测，并通过标准曲线法进行定量。色谱分析运行时间约为10分钟。综上所述，我们建立了一种快速、稳健的方法，可在单次LC/MS运行中分离并准确定量CFPS中涉及的40种化合物。该方法为全面、准确地表征无细胞代谢提供了有效手段，有助于我们最终理解并提升无细胞系统的蛋白产率、生产效率和能量利用效率。

引言

无细胞蛋白质合成（CFPS）是一种用于生产蛋白质和化学品的有前景的平台，这类应用传统上由活细胞完成。无细胞系统来源于粗制细胞提取物，避免了与细胞生长相关的复杂性¹。此外，CFPS能够直接获取代谢物和生物合成机制，且不受细胞壁的干扰。然而，目前对无细胞过程性能极限的基本理解仍然不足。高通量的代谢物定量方法对于代谢表征至关重要，并且是构建代谢计算模型的关键^2,3,4。常用于测定代谢物浓度的方法包括核磁共振（NMR）、傅里叶变换红外光谱法（FT-IR）、酶法检测以及质谱法（MS）^5,6,7,8。然而，这些方法通常受限于无法高效地同时测量多种化合物，且往往需要比典型的无细胞反应更大的样品量。例如，酶法检测通常一次只能定量一种化合物，当样品量较小时（如无细胞蛋白质合成反应，通常在10–15 μL规模下进行）其应用受到限制。同时，NMR需要较高的代谢物丰度才能实现检测和定量⁵。  针对上述局限性，色谱....

方案

1. 苯胺标记试剂的制备

1. 配制 pH 4.5 的 6 M 苯胺溶液。在通风橱中，将 550 µL 苯胺、337.5 µL 液相色谱-质谱级水和 112.5 µL 12 M 盐酸（HCl）加入离心管中混合。充分涡旋混匀后，于 4 °C 保存。
   注意：苯胺溶液可在 4 °C 下保存 2 个月。
   警告：苯胺具有高毒性，操作时必须在通风橱中进行。盐酸具有强腐蚀性。
2. 配制 pH 4.5 的 6 M ¹³C 苯胺溶液。将 250 mg ¹³C₆-苯胺与 132 µL 水和 44 µL 12 M HCl 混合。充分涡旋混匀后，于 4 °C 保存。
3. 配制 200 mg/mL 的 N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）溶液。每份待标记样品中加入 2 mg EDC 溶于 10 µL 水中，充分涡旋混匀。
   注意：EDC 溶液需在反应当天配制。EDC 可作为化合物与苯胺衍生化反应的催化剂¹²。

2. 标准品的制备

1. 使用液相色谱-质谱级水分别配制所有化合物的储备液（表1）。
2. 内标储备液的配制
   1. 除烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、烟....

结果

作为概念验证，我们使用该方案对表达绿色荧光蛋白（GFP）的大肠杆菌（E. coli）无细胞蛋白合成（CFPS）系统中的代谢物进行了定量分析。CFPS反应液（14 μL）用乙醇淬灭并去蛋白化。随后，CFPS样品用¹²C-苯胺进行标记，而标准品则用¹³C-苯胺标记。标记后的样品与标准品混合后注入液相色谱-质谱联用仪（LC/MS）（图1）。该方案利用内标法检测并定量了40种参与中心碳代谢和能量代谢的代谢物，同时针对其中5种无法用苯胺标记的代谢物建立了标准曲线（图2）。这些代谢通路中涉及的多种代谢物包括磷酸化糖类、磷酸羧酸类、羧酸类、核苷酸以及辅因子。通过苯胺衍生化，将疏水性基团引入亲水性分子中，从而在反相色谱中实现更有效的分离¹²。此外，该方法能够在一次LC/MS运行中实现结构异构体对的分离，例如葡萄糖-6-磷酸与果糖-6-磷酸。在实验前，通过依次注入1 mM的单一化合物，并将其质谱图与空白对照进行比较，确定了每种化.......

讨论

无细胞系统没有细胞壁，因此可以直接接触代谢物和生物合成机制，无需复杂的样品制备。然而，目前尚缺乏系统且稳健的定量分析无细胞反应体系的实验方案。在本研究中，我们开发了一种快速、稳健的方法，用于定量无细胞反应混合物中的代谢物，并可能扩展至全细胞提取物中的代谢物定量。在复杂混合物（如无细胞反应体系或全细胞提取物）中对单个代谢物进行定量具有多重挑战，其中最主要的原因是化学多样性。这些混合物中同时存在的多种官能团（例如羧酸、胺基、磷酸基、羟基等）显著增加了分析的复杂性。为克服这一难题，我们采用苯胺衍生化方法，并结合¹³C内标，向代谢物混合物中引入疏水性组分。利用该方法，我们通过单次液相色谱-质谱（LC/MS）分析，稳健地检测并定量了无细胞反应体系中的40种代谢物。本研究中，该方案成功标记了40种化合物中的35种，其余5种则采用标准曲线法进行定量。先前研究表明，反应条件下可能在胺基与磷酸基之间形成分子内盐，从而抑制衍生化反应¹²。目前尚未确定可同时衍生化全部40种化合物的反应条件；然而，现有替代方法即为标准曲线法。尽管本技术是在无细胞反应混合物中验证的，但其同样可能适用于全细胞提.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
12C 苯胺	Sigma-Aldrich	242284	苯胺 12C
13C 标记苯胺	Sigma-Aldrich	485797	苯胺 13C6
3-磷酸甘油酸	Sigma-Aldrich	P8877	3PG
乙酸	FisherScientific	AC222140010	ACE
乙腈，LCMS级	JT BAKER	9829-03	ACN
乙酰辅酶A	Sigma-Aldrich	A2056	ACA
Acquity UPLC BEH C18 1.7 μm，2.1 × 150 mm 色谱柱	Waters	186002353	色谱柱
腺苷二磷酸	Sigma-Aldrich	A2754	ADP
腺苷一磷酸	Sigma-Aldrich	A1752	AMP
腺苷三磷酸	Sigma-Aldrich	A2383	ATP
α-酮戊二酸	Sigma-Aldrich	K1128	aKG
柠檬酸	Sigma-Aldrich	251275	CIT
胞苷二磷酸	Sigma-Aldrich	C9755	CDP
胞苷一磷酸	Sigma-Aldrich	C1006	CMP
胞苷三磷酸	Sigma-Aldrich	C9274	CTP
D-甘油醛-3-磷酸	Sigma-Aldrich	39705	GAP
赤藓糖-4-磷酸	Sigma-Aldrich	E0377	E4P
乙醇	Sigma-Aldrich	EX0276	EtOH
Fisher Scientific accuSpin Micro 17 离心机	FisherScientific		离心机
黄素腺嘌呤二核苷酸	Sigma-Aldrich	F6625	FAD
果糖-1,6-二磷酸	Sigma-Aldrich	F6803	F16P
果糖-6-磷酸	Sigma-Aldrich	F3627	F6P
延胡索酸	Sigma-Aldrich	F8509	FUM
6-磷酸葡萄糖酸	Sigma-Aldrich	P7877	6PG
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270	GLC
葡萄糖-6-磷酸	Sigma-Aldrich	G7879	G6P
甘油-3-磷酸	Sigma-Aldrich	G7886	Gly3P
鸟苷二磷酸	Sigma-Aldrich	G7127	GDP
鸟苷一磷酸	Sigma-Aldrich	G8377	GMP
鸟苷三磷酸	Sigma-Aldrich	G8877	GTP
盐酸	Sigma-Aldrich	258148	HCl
异柠檬酸	Sigma-Aldrich	I1252	ICIT
乳酸	Sigma-Aldrich	L1750	LAC
苹果酸	Sigma-Aldrich	02288	MAL
myTXTL - Sigma 70 主混合试剂盒	ArborBiosciences	507024	无细胞蛋白合成
N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐	Sigma-Aldrich	03449	EDC
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸	Sigma-Aldrich	43410	NAD
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸	Sigma-Aldrich	N5755	NADP
还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸	Sigma-Aldrich	481973	NADPH
还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸	Sigma-Aldrich	N8129	NADH
草酰乙酸	Sigma-Aldrich	O4126	OAA
磷酸烯醇式丙酮酸	Sigma-Aldrich	P0564	PEP
丙酮酸	Sigma-Aldrich	P5280	PYR
核糖-5-磷酸	Sigma-Aldrich	R7750	R5P
核酮糖-5-磷酸	CarboSynth	MR45852	RL5P
景天庚酮糖-7-磷酸	CarboSynth	MS07457	S7P
琥珀酸	Sigma-Aldrich	S3674	SUCC
三丁胺	Sigma-Aldrich	90780	TBA
三乙胺	FisherScientific	O4884	TEA
超纯水	FisherScientific	10977-015	水
尿苷二磷酸	Sigma-Aldrich	U4125	UDP
尿苷一磷酸	Sigma-Aldrich	U6375	UMP
尿苷三磷酸	Sigma-Aldrich	U6625	UTP
VWR 高强度涡旋振荡器	VWR		涡旋振荡器
水，LCMS级	JT BAKER	9831-03	WATER
Waters Acquity H UPLC 四元溶剂管理系统	Waters		LCMS
Waters Acquity H UPLC 样品管理器 FTN	Waters		LCMS
Waters Acquity Qda 检测器	Waters		LCMS
Waters Empower 3	Waters		软件
Waters LCMS 全回收小瓶	Waters	186000384c	LCMS 小瓶