本文介绍了一种用于研究前列腺上皮类器官药理学反应的实验方案。类器官在生物学特性上高度模拟体内环境，并能重现患者的遗传特征，因此成为具有吸引力的模型系统。前列腺类器官可来源于野生型前列腺、基因工程小鼠模型、良性人前列腺组织以及晚期前列腺癌组织。
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本文内容
摘要
摘要
本文介绍了一种用于研究前列腺上皮类器官中药物动力学、干细胞潜能及癌症分化的实验方案。前列腺类器官是在明确成分的培养基中生长的具有雄激素响应性的三维（3D）培养体系，其结构类似于前列腺上皮。前列腺类器官可来源于野生型小鼠和基因工程小鼠模型、良性人组织以及晚期前列腺癌组织。重要的是，患者来源的类器官在遗传学和体内肿瘤生物学特性方面与原发肿瘤高度相似。此外，类器官可通过CRISPR/Cas9和shRNA系统进行遗传操作。这种可控的遗传背景使类器官培养体系成为快速评估基因型和突变谱对药理反应影响的理想平台。然而，为获得可重复的实验结果，实验方案必须针对类器官三维培养的特性进行专门优化。本文详细描述了进行接种实验以测定类器官形成能力的操作步骤。随后，报告展示了如何实施药物处理，并通过细胞活力检测、蛋白质提取和RNA提取来分析药理反应。最后，本方案说明了如何制备类器官用于异种移植，并通过皮下移植进行后续的体内生长实验。这些实验方案可产生高度可重复的数据，且广泛适用于各类三维培养系统。
引言
耐药性是癌症治疗中的主要临床问题之一。转移性前列腺癌（PCa）的治疗主要针对雄激素信号通路。新一代抗雄激素疗法（如恩杂鲁胺和阿比特龙）已显示出显著的临床疗效，但几乎所有前列腺癌最终都会进展为雄激素非依赖性状态，即去势抵抗性前列腺癌（CRPC）。
近期对去势抵抗性前列腺癌（CRPC）的基因组和转录组分析揭示了前列腺癌中存在三种主要的耐药机制：1）激活突变导致雄激素受体（AR）信号通路恢复1；2）旁路信号通路的激活，例如在下一代抗雄激素治疗耐药的临床前模型中，糖皮质激素受体（GR）的激活可补偿AR信号通路的缺失2；3）最近发现的谱系可塑性过程，即肿瘤细胞通过从依赖药物靶点的细胞类型转变为不依赖该靶点的其他细胞类型而获得耐药性（在前列腺癌中表现为AR阴性和/或神经内分泌表型[NEPC]）3,4。然而，导致药物耐药的分子机制尚不明确。此外，获得性抗雄激素耐药可能带来可被利用的治疗弱点。因此，有必要在能够模拟患者表型和基因型的模型系统中评估药物反应。
前列腺类器官是在三维蛋白质基质中使用特定培养基培养的类器官培养物。重要的是，前列腺类器官可来源于小鼠或人类的良性及癌变组织，并能保留体内存在的表型和基因型特征
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方案
本方案中描述的所有工作均使用已建立的小鼠类器官和患者来源的类器官完成。所有动物实验均遵循纪念斯隆-凯特琳癌症中心实验动物资源中心的指导原则（IACUC：06-07-012）。所有患者来源的组织均按照纪念斯隆-凯特琳癌症中心的规定和法规采集（IRB：12001）。
1. 培养基与缓冲液的配制
- 实验开始前，在 4 °C 条件下过夜解冻基底膜基质（例如 Matrigel）。使用时保持在冰上。
- 实验前 24 小时将培养板置于 37 °C 环境中，以促进基底膜基质形成凝胶（下文简称基质凝胶）并完成聚合。类器官的接种方法见步骤 2.1.2。
- 根据既定方案配制类器官培养基5。
- 配制不含表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF；组分见材料表）的类器官培养基。EGF 会抑制雄激素受体（AR）的转录活性，并导致抗雄激素耐药5。
- 配制含 10% 胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle medium, DMEM）。
注意：该培养基用于在第 2–4 节中抑制胰蛋白酶替代物的酶消化作用。 - 根据生产商说明书配制药物溶液。....
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结果
接种效率
类器官形成能力由表型和基因型决定。与腔内细胞（3%）相比，野生型（WT）前列腺基底细胞表现出更优的类器官形成能力（30%-40%）（图1A）。在类器官建立之后，其形成能力显著提高。通常，来源于一个野生型类器官的细胞中，有25%-30%能够形成新的类器官（图1B）。通过CRISPR/Cas9介导的Pten（PtenΔ/Δ）或p53（p53Δ/Δ）缺失仅导致类器官形成能力轻微增加。同时缺失p53和Pten则进一步提高了类器官的形成能力（图1B）。
药理学反应
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讨论
理解抗雄激素耐药性的分子机制并发现潜在的治疗弱点，需要在模拟前列腺癌的模型系统中测试药理学反应。本文介绍了一种详细的实验方案，用于可靠地分析患者来源和基因工程改造的前列腺类器官中的药理学反应，并制备这些类器官样本以用于后续应用。
本实验方案中有两个关键步骤。第一步是确定类器官的接种效率和生长速率。类器官的生长速度差异较大，这取决于物种：小鼠来源的类器官生长速度约为人类来源类器官的两倍。除物种因素外，生长速度还受基因型和表型的影响。然而，在明确接种效率和生长速度后，本方案可适用于所有类型的前列腺类器官。
第二个关键步骤是处理基于蛋白质基质的三维培养物，为后续的下游应用做好准备。通过使用稀释（70%）的基底膜基质，可避免因铺板时基底膜基质黏度导致的接种差异，具体方法如文中所述。文中还详细描述了如何在不显著扰动类器官的前提下，恰当地将聚合后的基质分散。本方案能够在不引入类器官检测结果变异的情况下实现基质的去除，适用于针对不同前列腺癌（PCa）遗传背景的药物文库筛选。此外，通过实施CRISPR/Cas9或shRNA介导的基因表达干扰，.......
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披露
C.L.S 在诺华公司董事会任职；是 ORIC Pharmaceuticals 的联合创始人，以及恩杂鲁胺和阿帕鲁胺的共同发明人；同时担任 Agios、百济神州、Blueprint、Column Group、Foghorn、Housey Pharma、Nextech、KSQ、Petra 和 PMV 的科学顾问；并且是 Seragon 的联合创始人，该公司于 2014 年被基因泰克/罗氏收购。W.R.K. 是类器官技术的共同发明人和专利持有者。
致谢
K.P. 由 NIH 1F32CA236126-01 资助。C.L.S. 由 HHMI；CA193837；CA092629；CA224079；CA155169；CA008748；以及 Starr Cancer Consortium 资助。W.R.K. 由荷兰癌症基金会/KWF Buit 2015-7545 和前列腺癌基金会 PCF 17YOUN10 资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| A83-01 | Tocris | 2939 | 类器官培养基组分：终浓度 200 nM |
| ADMEM/F12 | Gibco/Life Technologies | 12634028 | 类器官培养基组分 |
| B27 | Gibco/Life Technologies | 17504-044 | 类器官培养基组分 |
| 细胞培养板 | Fisher | 657185 | |
| Cell Titer Glo | 普洛麦格 | G7571 | |
| DHT | Sigma-Aldrich | D-073 | 类器官培养基组分：终浓度 1 nM |
| DMSO | Fisher | BP231-100 | |
| EGF | Peprotech | 315-09 | 类器官培养基组分：小鼠终浓度为 50 ng/ml，人终浓度为 5 ng/nl |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | 人源性类器官培养基组分：终浓度 10 ng/ml |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | 人源性类器官培养基组分：终浓度 5 ng/ml |
| Glutamax | Gibco/Life Technologies | 35050079 | 类器官培养基组分 |
| HEPES | 自制 | N/A | 类器官培养基组分：终浓度 10 mM |
| 基质胶（生长因子减量型） &和酚红-free） | 康宁 | CB-40230C | 类器官培养基成分 |
| N-乙酰半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | A9165 | 类器官培养基组分：终浓度 1.25 mM |
| 烟酰胺 | Sigma-Aldrich | N0636 | 人源性类器官培养基组分：终浓度 10 mM |
| NOGGIN | Peprotech 或稳定转染含 Noggin 构建体的 293t 细胞（Karthaus 等，2014） | 120-10C | 类器官培养基组分：终浓度为10%的条件培养基或100 ng/ml |
| 青霉素/链霉素 | Gemini Bio-Products | 400-109 | 类器官培养基成分 |
| 磷酸酶抑制剂 | 默克密理博 | 524629 | |
| 前列腺素 E2 | Tocris | 3632464 | |
| 蛋白酶抑制剂 | 默克密理博 | 539131 | |
| R-SPONDIN | Peprotech 或稳定转染携带 R-Spondin1 质粒的 293t 细胞（Karthaus 等，2014） | 120-38 | 类器官培养基组分：终浓度 10% 条件培养基或 500 ng/ml |
| RIPA缓冲液 | 默克 | 20-188 | |
| RNA-easy minikit | Qiagen | 74104 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | 152121-30-7 | 人源性类器官培养基组分：终浓度 10 μM |
| TryplE | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 | 类器官培养基组分：终浓度 10 μM |
参考文献
- Robinson, D., et al. Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer. Cell. 162 (2), 454(2015).
- Arora, V. K., et al. Glucocorticoid Receptor Confers Resistance to Antiandrogens by Bypassing Androgen Receptor Blockade. Cell. 155<....
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