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方法文章

前列腺类器官培养作为将基因型和突变谱转化为药理学反应的工具

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DOI：

10.3791/60346

⸱

2019年10月24日

 ,  ,  , 
1Human Oncology and Pathogenesis Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 2Howard Hughes Medical Institute

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于研究前列腺上皮类器官药理学反应的实验方案。类器官在生物学特性上高度模拟体内环境，并能重现患者的遗传特征，因此成为具有吸引力的模型系统。前列腺类器官可来源于野生型前列腺、基因工程小鼠模型、良性人前列腺组织以及晚期前列腺癌组织。

摘要

本文介绍了一种用于研究前列腺上皮类器官中药物动力学、干细胞潜能及癌症分化的实验方案。前列腺类器官是在明确成分的培养基中生长的具有雄激素响应性的三维（3D）培养体系，其结构类似于前列腺上皮。前列腺类器官可来源于野生型小鼠和基因工程小鼠模型、良性人组织以及晚期前列腺癌组织。重要的是，患者来源的类器官在遗传学和体内肿瘤生物学特性方面与原发肿瘤高度相似。此外，类器官可通过CRISPR/Cas9和shRNA系统进行遗传操作。这种可控的遗传背景使类器官培养体系成为快速评估基因型和突变谱对药理反应影响的理想平台。然而，为获得可重复的实验结果，实验方案必须针对类器官三维培养的特性进行专门优化。本文详细描述了进行接种实验以测定类器官形成能力的操作步骤。随后，报告展示了如何实施药物处理，并通过细胞活力检测、蛋白质提取和RNA提取来分析药理反应。最后，本方案说明了如何制备类器官用于异种移植，并通过皮下移植进行后续的体内生长实验。这些实验方案可产生高度可重复的数据，且广泛适用于各类三维培养系统。

引言

耐药性是癌症治疗中的主要临床问题之一。转移性前列腺癌（PCa）的治疗主要针对雄激素信号通路。新一代抗雄激素疗法（如恩杂鲁胺和阿比特龙）已显示出显著的临床疗效，但几乎所有前列腺癌最终都会进展为雄激素非依赖性状态，即去势抵抗性前列腺癌（CRPC）。

近期对去势抵抗性前列腺癌（CRPC）的基因组和转录组分析揭示了前列腺癌中存在三种主要的耐药机制：1）激活突变导致雄激素受体（AR）信号通路恢复1；2）旁路信号通路的激活，例如在下一代抗雄激素治疗耐药的临床前模型中，糖皮质激素受体（GR）的激活可补偿AR信号通路的缺失2；3）最近发现的谱系可塑性过程，即肿瘤细胞通过从依赖药物靶点的细胞类型转变为不依赖该靶点的其他细胞类型而获得耐药性（在前列腺癌中表现为AR阴性和/或神经内分泌表型[NEPC]）3,4。然而，导致药物耐药的分子机制尚不明确。此外，获得性抗雄激素耐药可能带来可被利用的治疗弱点。因此，有必要在能够模拟患者表型和基因型的模型系统中评估药物反应。

前列腺类器官是在三维蛋白质基质中使用特定培养基培养的类器官培养物。重要的是，前列腺类器官可来源于小鼠或人类的良性及癌变组织，并能保留体内存在的表型和基因型特征5,6。目前的类器官集合中包含了抗雄激素敏感的前列腺癌（PCa）细胞和去势抵抗性前列腺癌（CRPC）细胞。此外，前列腺类器官可通过CRISPR/Cas9和shRNA技术方便地进行遗传操作5。因此，前列腺类器官是测试药物反应和阐明耐药机制的合适模型系统。本文详细描述了利用前列腺类器官进行药物测试和分析药理学反应的实验方案。

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方案

本方案中描述的所有工作均使用已建立的小鼠类器官和患者来源的类器官完成。所有动物实验均遵循纪念斯隆-凯特琳癌症中心实验动物资源中心的指导原则（IACUC：06-07-012）。所有患者来源的组织均按照纪念斯隆-凯特琳癌症中心的规定和法规采集（IRB：12001）。

1. 培养基与缓冲液的配制

  1. 实验开始前，在 4 °C 条件下过夜解冻基底膜基质（例如 Matrigel）。使用时保持在冰上。
  2. 实验前 24 小时将培养板置于 37 °C 环境中，以促进基底膜基质形成凝胶（下文简称基质凝胶）并完成聚合。类器官的接种方法见步骤 2.1.2。
  3. 根据既定方案配制类器官培养基5。
  4. 配制不含表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF；组分见材料表）的类器官培养基。EGF 会抑制雄激素受体（AR）的转录活性，并导致抗雄激素耐药5。
  5. 配制含 10% 胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle medium, DMEM）。
    注意：该培养基用于在第 2–4 节中抑制胰蛋白酶替代物的酶消化作用。
  6. 根据生产商说明书配制药物溶液。对于恩杂鲁胺/mdv3100（下文简称第二代抗雄激素药物），用二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）配制 100 µM 的储存液。储存液可在 -20 °C 保存长达 6 个月，无需新鲜配制。

2. 类器官的分离、酶消化及建立

  1. 根据先前建立的方案，从小鼠或人类组织中分离前列腺类器官5,7以下提供简要说明。
    1. 将前列腺组织切碎并进行酶消化，以制备单细胞悬液。本实验中，使用1 mL含5 mg/mL II型胶原酶的ADMEM/F12培养基消化50 mg前列腺组织。
    2. 通过离心收集细胞，离心条件为300 × g x g 孵育5分钟，计数细胞，重悬于基底膜基质中，并以适当密度接种5,7 在预热的类器官培养板的基质圆顶中（接种方法如图所示） 图1A).
    3. 让穹顶状结构凝固，并将培养基加入穹顶顶部，使其完全覆盖。
  2. 培养类器官至下游应用所需的数量。细胞数量可采用常规计数方法确定。有关密度的更多细节，请参见方案中针对具体应用的章节。
  3. 使用 P1000 移液器吸取培养基，反复吹打以破坏基质。当基底膜基质完全解离后，将悬液转移至 15 mL 圆锥形离心管中。每个 15 mL 圆锥形离心管中不得放置超过 10 个类器官团块。在 300 ×g 条件下离心 x g 5 分钟。
  4. 吸去上清液，用 5 mL PBS 洗涤细胞沉淀。300 × g 离心 x g 5 分钟。
  5. 吸去上清液，将沉淀物重悬于4 mL胰蛋白酶替代液中，37 °C振荡消化5-10分钟。加入等体积类器官培养基加10%胎牛血清以终止胰蛋白酶替代液的作用。300 × g离心 x g 5 分钟。
  6. 吸除上清液，并用1 mL PBS重悬。
  7. 使用40 µm滤器过滤悬液，以确保获得单细胞悬液。使用血细胞计数板或同等计数装置对细胞数量进行定量。
    注意：如果难以获得有活力的单细胞，可使用流式分选来获取单细胞悬液。

3. 评估类器官形成能力

注意：为了确定能够形成类器官的细胞百分比，可进行接种实验作为干细胞/祖细胞潜能的替代指标。类器官形成能力对于确定活力检测中的细胞接种数量也至关重要。

  1. 使用含有10 µM Rho激酶抑制剂Y-27632的类器官培养基，将步骤2.7中获得的细胞悬液稀释至每10 µL悬液中含有100个细胞。
  2. 将1,100个细胞（110 µL悬液）转移至新的锥形管中。
  3. 加入285 µL基底膜基质，并重悬细胞。最终基质浓度约为70%。
    注意：在接种过程中稀释基底膜基质可显著减少因蛋白质基质黏度导致的类器官穹顶大小差异。
  4. 在预热的24孔板中，以每孔35 µL基质形成穹顶的方式接种细胞，每孔含200个细胞。每个样本接种3–5个复孔（另见图1A和步骤2.1.2中的接种方法）。
  5. 为确保细胞保留在基质穹顶内，将培养板翻转后放入细胞培养箱中，使基底膜基质固化。
  6. 10分钟后，从培养箱中取出培养板，并加入含有Rho激酶抑制剂的培养基。
  7. 每2天更换一次培养基。7天后，对类器官数量进行定量统计。整个实验过程中，培养基中均需保留Rho激酶抑制剂。
  8. 统计每个穹顶中形成的类器官数量，并计算形成的类器官数占接种总细胞数（200个细胞）的百分比。
    注意：类器官形成率因细胞类型和基因型不同而异，通常在3%–60%之间。

4. 确定类器官的药理学反应

  1. 从步骤2.7继续，在基质小滴中接种1,000–10,000个细胞。以类器官形成效率和生长速度作为参考，确定最终接种的细胞数量。
    注意：推荐的细胞数量见表1。每种条件每次分析应设置三到五个重复。使用终浓度为70%的基底膜基质，以减少因黏稠度导致的移液误差。
  2. 在24孔板中接种35 µL基质小滴，并按照第3节所述方法让小滴凝固（另见图1A和步骤2.1.2中的铺板方法）。加入含有Rho激酶抑制剂及所选药物的培养基。该方法适用于所有药物，但在本方案中以10 µM浓度的第二代抗雄激素药物为例进行说明。为测定半数最大抑制浓度（IC50），应进行以10为底的对数梯度稀释，并以药物溶解所用溶剂作为对照。
  3. 每隔两到三天更换一次培养基，并在第7天分析类器官，以评估药物的药理反应。具体检测时间点可能因实验设计和所用药物的不同而有所调整。
    注意：进行这些检测时，类器官无需胰酶消化处理。
  4. 为保持类器官完整性，使用P1000移液器吸取培养基，并反复吹打以破坏基底膜基质。
  5. 当基底膜基质完全解离后，将悬液转移至15 mL锥形离心管中。每15 mL锥形离心管转移的基质小滴不得超过10个。
  6. 以300 x g离心5分钟。吸除上清液，并用5 mL PBS洗涤一次。
  7. 将类器官重悬于1 mL PBS中，使用玻璃巴斯德移液管通过反复吹打使类器官进一步解离。
  8. 定量统计类器官碎片数量。按照步骤2.1.2所述方法，接种5个重复样本，每个样本含100个类器官碎片。
  9. 按照下文第7节所述方法进行细胞活力检测。

5. 类器官中RNA的提取

注意：市面上可购得的柱式方法可获得良好产量和质量的RNA。为确保获得足量RNA，每个样本至少使用一个细胞层；但建议使用三个细胞层，可将其接种于12孔板中的单个孔内。

  1. 向RNA提取试剂盒中的谷胱甘肽裂解缓冲液中加入β-巯基乙醇（1%）。
  2. 吸除含有类器官的基底膜穹顶中的培养基，加入750 µL该缓冲液。使用P1000移液器反复吹打。检查是否所有基底膜基质均已溶解。
  3. 加入750 µL 70%乙醇，通过移液混合。随后将700 µL混合液转移至柱中，在12,000 x g下离心1分钟，并对剩余裂解液重复此步骤。
  4. 根据制造商说明书进行洗涤及柱上DNase处理。用30–50 µL无RNA酶的水洗脱RNA。
  5. 使用荧光计在OD = 260 nm和280 nm处测定浓度，并于-80 °C保存或直接进行后续应用。

6. 类器官中蛋白质的分离

注意：进行蛋白质分离时，需准备含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂的标准 RIPA 缓冲液（材料表）。建议使用至少三个类器官，可接种于一个 12 孔板中。

  1. 使用 P1000 移液器吸取含有类器官及基底膜穹顶的细胞培养基，反复吹打以破坏基底膜基质。
  2. 待基质完全解离后，将悬液转移至 15 mL 圆锥形离心管中，在 300 x g 条件下离心 5 分钟。
  3. 吸除上清液，并用 5 mL 冰冷的 PBS 洗涤沉淀物，随后在 300 x g 条件下离心 5 分钟。
  4. 吸除上清液，将沉淀物重悬于 4 mL 胰蛋白酶替代液中，在 37 °C 振荡条件下消化 5–10 分钟。
  5. 加入等体积含 10% 胎牛血清（FCS）的类器官培养基以终止胰蛋白酶替代液的作用，在 300 x g 条件下离心 5 分钟。
    注意：离心后，沉淀中不应观察到可见的基底膜基质。
  6. 吸除上清液，用 5 mL 冰冷的 PBS 洗涤一次，再次吸除上清液后，使用 P1000 移液器将细胞沉淀重悬于 300 µL 裂解缓冲液中，然后转移至 1.5 mL 微量离心管。
  7. 冰上孵育 10 分钟，随后在 4 °C 冷却的水中进行超声处理，每次 30 秒，共 2 次。将离心管放回冰上，采用标准方法进行蛋白质定量。
  8. 加入含十二烷基硫酸钠（SDS）的上样染料使蛋白质变性，并在 95 °C 下煮沸 5 分钟。裂解产物可储存于 -80 °C，或直接用于后续实验。

7. 类器官细胞活力检测

注意：可使用市售的细胞活力检测试剂盒和化学发光仪来评估细胞活力。请按照制造商的说明配制缓冲液。建议每种条件设置五个重复：每个重复包含一个24孔板中单个孔内的35 µL基底膜基质圆顶。

  1. 吸出类器官培养物的培养基，注意保持基质小滴完整。
  2. 加入 65 µL PBS，上下吹打以破坏基质小滴。
  3. 加入 100 µL 细胞活力检测试剂盒缓冲液，通过吹打重悬细胞。
  4. 室温（RT）振荡孵育 10 分钟。
  5. 将 100 µL 混合液转移至适合化学发光仪检测的不透光板中，按照细胞活力检测试剂盒的制造商说明进行检测读数。

8. 准备受体移植的类器官

注意：类器官既可移植到免疫缺陷动物体内，也可移植到同基因型小鼠体内进行皮下移植。为了确保注射的类器官在体内可被区分，建议使用持续表达的荧光蛋白对类器官进行标记5。建议使用每针5 × 105至2 × 106个细胞进行预实验，每次递增5 × 105个细胞，因为不同类器官品系的移植效率存在差异。

  1. 使用 P1000 移液器吸取培养基，并反复吹打以破坏基底膜基质。当基质完全解离后，将悬液转移至 15 mL 圆锥形离心管中。在 300 x g 条件下离心 5 分钟。
    注意：每个 15 mL 圆锥形离心管中转移的基质凝胶块不得超过 10 个。
  2. 吸除上清液，并用 5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。在 300 x g 条件下离心 5 分钟。
  3. 吸除上清液，将沉淀重悬于 4 mL 胰蛋白酶替代液中。在 37 °C 振荡条件下消化 5–10 分钟。
  4. 加入等体积的类器官培养基 + 10% 胎牛血清（FBS）以终止胰蛋白酶替代液的消化作用。在 300 x g 条件下离心 5 分钟。
  5. 吸除上清液，将沉淀重悬于 1 mL PBS 中。使用 40 µm 滤膜过滤悬液，以确保获得单细胞悬液。采用标准方法对细胞进行定量。
  6. 离心后将细胞沉淀重悬于含 Rho 抑制剂的 PBS 中，调整细胞浓度至每 100 µL 含 2 × 106 个细胞（不同浓度所需的细胞浓度和绝对细胞数量参见 表 2）。加入等体积的基底膜基质，形成 1:1 的混合悬液。将悬液置于冰上保存。
  7. 根据标准操作流程接种细胞，并采用标准方法监测异种移植瘤的生长情况8。

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结果

接种效率
类器官形成能力由表型和基因型决定。与腔内细胞（3%）相比，野生型（WT）前列腺基底细胞表现出更优的类器官形成能力（30%-40%）（图1A）。在类器官建立之后，其形成能力显著提高。通常，来源于一个野生型类器官的细胞中，有25%-30%能够形成新的类器官（图1B）。通过CRISPR/Cas9介导的Pten（PtenΔ/Δ）或p53（p53Δ/Δ）缺失仅导致类器官形成能力轻微增加。同时缺失p53和Pten则进一步提高了类器官的形成能力（图1B）。

药理学反应

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讨论

理解抗雄激素耐药性的分子机制并发现潜在的治疗弱点，需要在模拟前列腺癌的模型系统中测试药理学反应。本文介绍了一种详细的实验方案，用于可靠地分析患者来源和基因工程改造的前列腺类器官中的药理学反应，并制备这些类器官样本以用于后续应用。

本实验方案中有两个关键步骤。第一步是确定类器官的接种效率和生长速率。类器官的生长速度差异较大，这取决于物种：小鼠来源的类器官生长速度约为人类来源类器官的两倍。除物种因素外，生长速度还受基因型和表型的影响。然而，在明确接种效率和生长速度后，本方案可适用于所有类型的前列腺类器官。

第二个关键步骤是处理基于蛋白质基质的三维培养物，为后续的下游应用做好准备。通过使用稀释（70%）的基底膜基质，可避免因铺板时基底膜基质黏度导致的接种差异，具体方法如文中所述。文中还详细描述了如何在不显著扰动类器官的前提下，恰当地将聚合后的基质分散。本方案能够在不引入类器官检测结果变异的情况下实现基质的去除，适用于针对不同前列腺癌（PCa）遗传背景的药物文库筛选。此外，通过实施CRISPR/Cas9或shRNA介导的基因表达干扰，...

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披露

C.L.S 在诺华公司董事会任职；是 ORIC Pharmaceuticals 的联合创始人，以及恩杂鲁胺和阿帕鲁胺的共同发明人；同时担任 Agios、百济神州、Blueprint、Column Group、Foghorn、Housey Pharma、Nextech、KSQ、Petra 和 PMV 的科学顾问；并且是 Seragon 的联合创始人，该公司于 2014 年被基因泰克/罗氏收购。W.R.K. 是类器官技术的共同发明人和专利持有者。

致谢

K.P. 由 NIH 1F32CA236126-01 资助。C.L.S. 由 HHMI；CA193837；CA092629；CA224079；CA155169；CA008748；以及 Starr Cancer Consortium 资助。W.R.K. 由荷兰癌症基金会/KWF Buit 2015-7545 和前列腺癌基金会 PCF 17YOUN10 资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
A83-01Tocris2939类器官培养基组分：终浓度 200 nM
ADMEM/F12Gibco/Life Technologies12634028类器官培养基组分
B27Gibco/Life Technologies17504-044类器官培养基组分
细胞培养板Fisher657185
Cell Titer Glo普洛麦格G7571
DHTSigma-AldrichD-073类器官培养基组分：终浓度 1 nM
DMSOFisherBP231-100
EGFPeprotech315-09类器官培养基组分：小鼠终浓度为 50 ng/ml，人终浓度为 5 ng/nl
FGF10Peprotech100-26人源性类器官培养基组分：终浓度 10 ng/ml
FGF2Peprotech100-18B人源性类器官培养基组分：终浓度 5 ng/ml
GlutamaxGibco/Life Technologies35050079类器官培养基组分
HEPES自制N/A类器官培养基组分：终浓度 10 mM
基质胶（生长因子减量型） &和酚红-free）康宁CB-40230C类器官培养基成分
N-乙酰半胱氨酸Sigma-AldrichA9165类器官培养基组分：终浓度 1.25 mM
烟酰胺Sigma-AldrichN0636人源性类器官培养基组分：终浓度 10 mM
NOGGINPeprotech 或稳定转染含 Noggin 构建体的 293t 细胞（Karthaus 等，2014）120-10C类器官培养基组分：终浓度为10%的条件培养基或100 ng/ml
青霉素/链霉素Gemini Bio-Products400-109类器官培养基成分
磷酸酶抑制剂默克密理博524629
前列腺素 E2Tocris3632464
蛋白酶抑制剂默克密理博539131
R-SPONDINPeprotech 或稳定转染携带 R-Spondin1 质粒的 293t 细胞（Karthaus 等，2014）120-38类器官培养基组分：终浓度 10% 条件培养基或 500 ng/ml
RIPA缓冲液默克20-188
RNA-easy minikitQiagen74104
SB202190Sigma-Aldrich152121-30-7人源性类器官培养基组分：终浓度 10 μM
TryplEThermoFisher12605036
Y-27632SelleckchemS1049类器官培养基组分：终浓度 10 μM

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