用于大鼠环周性食管重建的组织工程移植物

摘要

食管重建是一项具有挑战性的手术，因此有必要开发一种组织工程食管，能够实现食管黏膜和肌肉的再生，并可作为人工移植物进行植入。本文中，我们介绍了人工食管的制备方案，包括支架制备、生物反应器培养以及多种外科技术。

摘要

使用生物相容性材料进行大鼠食管全周重建是一项技术上具有挑战性的任务，需要优化的植入技术和营养支持。近年来，尽管在食管组织工程方面已进行了诸多尝试，但由于在蠕动的特殊环境中难以实现早期上皮化，成功率仍然有限。本文中，我们开发了一种人工食管，通过双层管状支架、基于间充质干细胞的生物反应器系统以及改良胃造口术的旁路喂养技术，促进食管黏膜层和肌层的再生。该支架由聚氨酯（PU）纳米纤维制成圆柱形结构，外壁包裹三维（3D）打印的聚己内酯丝。移植前，将人源间充质干细胞接种于支架管腔内，并通过生物反应器培养以增强细胞活性。我们通过改进手术吻合方法，并用甲状腺瓣覆盖植入假体，结合临时非经口胃造口喂养，提高了移植物的存活率。组织学分析显示，这些移植物能够在植入部位周围重现早期上皮化和肌肉再生的特征。此外，在移植物周围还观察到弹性纤维增加和新生血管形成。因此，该模型为食管全周重建提供了一种潜在的新技术。

引言

食管疾病的治疗，例如先天性畸形和食管癌，可能导致食管结构节段的缺失。在大多数情况下，已采用自体替代移植物，如胃上提管状结构或结肠间置术^1,2。然而，这些食管替代方法存在多种手术并发症和再次手术的风险³。因此，使用模拟天然食管的组织工程食管支架，可能是最终再生缺失组织的一种有前景的替代策略^4,5,6。

尽管组织工程食管可能为目前食管缺损的治疗提供一种替代方案，但其在体内的应用仍存在重大障碍。术后吻合口漏和植入食管支架的坏死不可避免地会导致周围无菌区域（如纵隔）发生致命性感染⁷。因此，防止食物或唾液污染伤口及鼻胃管至关重要。在原发伤口愈合完成之前，应考虑行胃造瘘或静脉营养支持。迄今为止，食管组织工程研究主要在大型动物模型中进行，因为大型动物在支架植入后仅能通过静脉高营养维持2至4周⁸。然而，小型动物在食管移植术后早期存活阶段尚未建立非经口喂养模型。其原因是这些动物活动极为频繁且难以控制，无法长时间将饲管保留在胃内。由于这一原因，小型动物中....

方案

本文所述所有方法均已获得首尔国立大学医院机构动物护理和使用委员会（IACUC 编号：17-0164-S1A0）的批准。

1. 支架制造

注意：双层食管支架通过结合静电纺丝和3D打印技术制备。管状支架的内层膜采用聚氨酯（PU）通过静电纺丝技术制备，以旋转的不锈钢芯轴作为收集器⁹。

1. 制备管状聚氨酯（PU）纳米纤维时，将PU聚合物溶于N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，在室温下搅拌8小时，配制成20%（w/v）的PU溶液。
2. 将PU溶液装入带有钝头金属针（22 G）的注射器中，在针尖与旋转收集器之间距离为30 cm的条件下，于旋转的不锈钢芯棒（直径 = 2 mm）上进行静电纺丝。
   注：电源设置为15 kV的高压直流电。使用注射泵将溶液进样速率固定在0.5 mL/h。
3. 在以3.14 m/s速度旋转的芯棒表面形成管状纳米纤维层。
4. 将PU纳米纤维置于40 °C真空烘箱中过夜干燥，以彻底去除残留溶剂。
   注：食管支架的3D打印外壁使用快速成型系统制备。3D打印设备包括分配器、喷嘴、压缩/加热控制器、三轴转换平台和软件系统。
5. 将PCL颗粒在加热筒中于100 °C溶解，随后在生物绘图系统的控制下，以高压（7 bar）将其打印至纳米纤维表面。喷嘴尺寸为300 µm，丝线....

结果

图1展示了PU-PCL双层管状支架的制造过程示意图。将PU溶液通过18 G针头进行静电纺丝，形成厚度为200 µm的圆柱形内层结构。随后，在PU纳米纤维外壁上以一定间隔打印熔融的PCL。通过扫描电子显微镜图像可观察到所制备管状支架内外壁的表面形貌。

图2展示了在大鼠体内插入胃造口管以进行外部营养供给的过程（图2A）。将T形硅胶管插入胃壁并缝合固定（图2B）。随后将导管经由皮下隧道引至颈部背部，并连接肝素帽（图2C）。该导管便于注入液态食物，同时可防止胃内容物.......

讨论

目前关于人工食管的动物研究仍受到若干关键因素的限制。理想的人工食管支架应具备良好的生物相容性以及优异的物理性能。它应能在术后早期促进黏膜上皮的再生，以防止吻合口漏的发生。内层环形肌和外层纵行肌的再生对于实现功能性蠕动同样至关重要^12,13。

食管的力学特性至关重要，因为食管在呼吸过程中会塌陷，而在吞咽时则会开放，并持续经历最大程度的拉伸及回缩现象¹⁴。植入的支架也必须具备这些力学特性。植入食管的黏弹性应足以适应食管蠕动过程中反复的拉伸-松弛运动。力学性能过弱的支架可能发生破裂或渗漏，导致受体出现严重并发症（如纵隔炎）。相反，过于僵硬的支架可能向食管腔内膨出，阻碍食物通过。静电纺纳米纤维具有非常理想的物理特性，适用于食管重建。细胞外基质（ECM）的拓扑结构为食管各层上皮细胞的迁移和分化提供了有利环境¹⁵。此外，其纳米孔结构还能防止唾液和多种病原体的渗漏

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
代谢笼	TEUNGDO BIO & PLANT	JD-C-66
齐拉西酮（50 mg/g 剂量）	Virbac	1000000188
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25200-056
1 mL 注射器	BD	309659
2% 盐酸赛拉嗪（Rumpun）	Byely	Q-0615-035
4% 多聚甲醛	BIOSOLUTION	BP031
4-0 Vicryl	ETHICON	W9443
9-0 Vicryl	ETHICON	W2813
抗生素庆大霉素（Septopal）	Septopal	0409-1207-03
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	5470
柠檬酸缓冲液，pH6.0，10X	Sigma	C9999
DAB 过氧化物酶底物试剂盒	VECTOR	SK4100
结蛋白（Desmin）	Santa Cruz	sc-23879
弹性染色试剂盒	ScyTeK	ETS-1
乙醇	Merck	100983
乙醇	Merck	64-17-5
胎牛血清（FBS）	Gibco	16000-044
戊二醛	Sigma	354400
山羊抗小鼠 IgG（H+L）二抗	ThermoFisher	A-11001
肝素帽	Hyupsung Medical	HS-T-05
hMSC（STEMPRO）/生长培养基 （MesenPRO RSTM）	Invitrogen	R7788-110
辣根过氧化物酶偶联试剂盒（Vectastain）	VECTOR	PK7800
过氧化氢	JUNSEI	7722-84-1
角蛋白13（Keratin13）	Novus	NBP1-97797
LIVE/DEAD 活性检测试剂盒	Molecular Probes	L3224
Matrigel	Corning	354262
N,N-二甲基甲酰胺（DMF）	Sigma	227056
非粘附 24孔组织培养板	Corning	3738
OsO4	Sigma	O5500
培养皿	Eppendorf	3072115
磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco	10010-023
磷酸盐缓冲液（PBS），10X	BIOSOLUTION	BP007a
聚己内酯（PCL）聚合物	Sigma	440744
聚氨酯（PU+A2:A24）聚合物	Lubrizol	2363-80AE
电源	NanoNC	HV100
含 DAPI 的 ProLong Gold 抗荧光淬灭试剂	Invitrogen	P36931
Rumpun	Bayer	Q-0615-035
硅胶 T 型管	Sewoon Medical	2206-005
土霉素眼膏	Pfizer Pharmaceutical Korea	W01890011
替来他明/唑拉西泮（Zoletil）	Virbac Laboratories	Q-0042-058
三色染色试剂盒	ScyTeK	TRM-1
血管性血友病因子（vWF）	Santa Cruz	sc 14014