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方法文章

用于大鼠环周性食管重建的组织工程移植物

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DOI：

10.3791/60349

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2020年2月10日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Seoul National University, College of Medicine, 2Department of Biomedical Engineering, Inje University, Gimhae, 3Department of Nature-Inspired Nanoconvergence Systems, Korea Institute of Machinery and Materials

本文内容

摘要

食管重建是一项具有挑战性的手术，因此有必要开发一种组织工程食管，能够实现食管黏膜和肌肉的再生，并可作为人工移植物进行植入。本文中，我们介绍了人工食管的制备方案，包括支架制备、生物反应器培养以及多种外科技术。

摘要

使用生物相容性材料进行大鼠食管全周重建是一项技术上具有挑战性的任务，需要优化的植入技术和营养支持。近年来，尽管在食管组织工程方面已进行了诸多尝试，但由于在蠕动的特殊环境中难以实现早期上皮化，成功率仍然有限。本文中，我们开发了一种人工食管，通过双层管状支架、基于间充质干细胞的生物反应器系统以及改良胃造口术的旁路喂养技术，促进食管黏膜层和肌层的再生。该支架由聚氨酯（PU）纳米纤维制成圆柱形结构，外壁包裹三维（3D）打印的聚己内酯丝。移植前，将人源间充质干细胞接种于支架管腔内，并通过生物反应器培养以增强细胞活性。我们通过改进手术吻合方法，并用甲状腺瓣覆盖植入假体，结合临时非经口胃造口喂养，提高了移植物的存活率。组织学分析显示，这些移植物能够在植入部位周围重现早期上皮化和肌肉再生的特征。此外，在移植物周围还观察到弹性纤维增加和新生血管形成。因此，该模型为食管全周重建提供了一种潜在的新技术。

引言

食管疾病的治疗，例如先天性畸形和食管癌，可能导致食管结构节段的缺失。在大多数情况下，已采用自体替代移植物，如胃上提管状结构或结肠间置术1,2。然而，这些食管替代方法存在多种手术并发症和再次手术的风险3。因此，使用模拟天然食管的组织工程食管支架，可能是最终再生缺失组织的一种有前景的替代策略4,5,6。

尽管组织工程食管可能为目前食管缺损的治疗提供一种替代方案，但其在体内的应用仍存在重大障碍。术后吻合口漏和植入食管支架的坏死不可避免地会导致周围无菌区域（如纵隔）发生致命性感染7。因此，防止食物或唾液污染伤口及鼻胃管至关重要。在原发伤口愈合完成之前，应考虑行胃造瘘或静脉营养支持。迄今为止，食管组织工程研究主要在大型动物模型中进行，因为大型动物在支架植入后仅能通过静脉高营养维持2至4周8。然而，小型动物在食管移植术后早期存活阶段尚未建立非经口喂养模型。其原因是这些动物活动极为频繁且难以控制，无法长时间将饲管保留在胃内。由于这一原因，小型动物中成功实现食管移植的案例极少。

鉴于食管组织工程的现状，我们设计了一种双层管状支架，由静电纺丝纳米纤维（内层；图1A）和3D打印丝状结构（外层；图1B）组成，并结合了一种改良的胃造口技术。内部的纳米纤维由聚氨酯（PU）——一种不可降解的聚合物——制成，可防止食物和唾液渗漏。外部的3D打印丝状结构由可生物降解的聚己内酯（PCL）制成，能够提供机械柔韧性并适应蠕动运动。将人脂肪来源的间充质干细胞（hAD-MSCs）接种于支架的内层，以促进再上皮化。纳米纤维结构可通过为细胞迁移提供类似细胞外基质（ECM）的结构环境，促进黏膜的初始再生。

我们还通过生物反应器培养提高了接种细胞的存活率和生物活性。植入的支架被甲状腺瓣覆盖，以实现食管黏膜层和肌层更稳定的再生。本报告中，我们描述了大鼠模型中用于食管组织工程技术的方案，包括支架制备、基于间充质干细胞的生物反应器培养、改良胃造口旁路喂养技术，以及环周食管重建的改良外科吻合技术。

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方案

本文所述所有方法均已获得首尔国立大学医院机构动物护理和使用委员会（IACUC 编号：17-0164-S1A0）的批准。

1. 支架制造

注意：双层食管支架通过结合静电纺丝和3D打印技术制备。管状支架的内层膜采用聚氨酯（PU）通过静电纺丝技术制备，以旋转的不锈钢芯轴作为收集器9。

  1. 制备管状聚氨酯（PU）纳米纤维时，将PU聚合物溶于N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，在室温下搅拌8小时，配制成20%（w/v）的PU溶液。
  2. 将PU溶液装入带有钝头金属针（22 G）的注射器中，在针尖与旋转收集器之间距离为30 cm的条件下，于旋转的不锈钢芯棒（直径 = 2 mm）上进行静电纺丝。
    注：电源设置为15 kV的高压直流电。使用注射泵将溶液进样速率固定在0.5 mL/h。
  3. 在以3.14 m/s速度旋转的芯棒表面形成管状纳米纤维层。
  4. 将PU纳米纤维置于40 °C真空烘箱中过夜干燥，以彻底去除残留溶剂。
    注：食管支架的3D打印外壁使用快速成型系统制备。3D打印设备包括分配器、喷嘴、压缩/加热控制器、三轴转换平台和软件系统。
  5. 将PCL颗粒在加热筒中于100 °C溶解，随后在生物绘图系统的控制下，以高压（7 bar）将其打印至纳米纤维表面。喷嘴尺寸为300 µm，丝线间距为700 µm。
  6. 将双层支架从芯棒上取下后，在紫外光照射下浸泡于70%乙醇中进行灭菌。
    注：该支架更详细的特性已在先前的研究中报道10。

2. 移植物上的细胞接种与生物反应器培养

注意：实验所用的人脂肪来源间充质干细胞（hMSCs）购自公司，未经修饰。

  1. 在细胞移植前，将3D打印的食管支架置于紫外线下灭菌1小时，用乙醇润湿10分钟，并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次。
  2. 在生长培养基（基础培养基/生长添加剂）中培养并扩增人骨髓间充质干细胞（hMSCs）。将双层管状支架转移至无黏附性的24孔组织培养板中。
  3. 为了将细胞附着于支架内表面，以 1 × 10⁶ 细胞/mL 的密度轻轻加入 hMSC 悬液6 细胞/mL，置于含有生长培养基的基底膜基质中。
  4. 将基底膜基质悬液均匀地涂布于双层管状支架的内表面。
  5. 使用脉动流生物反应器系统，将接种了hMSC的管状支架牢固地固定在生物反应器培养室的丙烯酸支架上。
    注意：定制设计的生物反应器系统由泵、除泡阱、流室、压力计、可控阀门和培养基储液器组成。在培养室中施加剪切应力时，需留出1-2分钟的静置时间11.
  6. 向培养室中加入生长培养基，并施加 0.1 dyne/cm 的力2 在含有5% CO的加湿气氛下由流动诱导的剪切应力210.
    注意：流致剪切应力的数值是通过模拟既往研究中源自人体的食管组织蠕动而计算得出的10.
  7. 使用LIVE/DEAD细胞活性检测试剂盒，按照制造商说明书，在无生物反应器培养条件下培养5天后，检测双层管状支架内表面的细胞反应。通过共聚焦显微镜结合Z轴扫描工具获取图像。
  8. 第三天，通过扫描电子显微镜（SEM）观察接种hMSC的管状支架表面形貌。
    1. 将与hMSC共孵育的支架用2.5%戊二醛和OsO4固定24小时，随后用乙醇脱水。
    2. 在氩气气氛条件下，使用溅射镀膜仪将固定的人骨髓间充质干细胞（hMSCs）镀上铂层，并在25 kV加速电压下获取扫描电子显微镜（SEM）图像。

3. 动物手术的外科准备

注意：在胃造口术和食管移植术之前均需进行外科准备。

  1. 准备无菌外科手术器械：手术刀片、韦特兰纳牵开器、显微持针器、显微缝合镊、显微组织镊、显微剪、梅奥-赫加持针器、手术剪、虹膜剪、敷料镊、组织镊、 splinter forceps、虹膜镊、5 mL 注射器（21 G 针头）、10 mL 注射器（22 G 针头）、9-0 聚酰胺缝线、4-0 聚乳酸-羟基乙酸共聚物缝线。
  2. 通过肌肉注射替来他明/唑拉西泮（剂量为 50 mg/g）和 2% 盐酸赛拉嗪（剂量为 2 mg/kg）对动物进行麻醉。
    注：食管移植实验使用体重为 398–420 g 的成年 Sprague-Dawley（SD）大鼠。
  3. 在将动物转移至手术巾之前，用镊子轻夹其尾部以检查动物是否达到适当的麻醉状态。
  4. 将动物仰卧位放置于无菌手术巾上，并使用电推剪去除颈部（用于食管移植）或腹部（用于胃造口术）的毛发。随后用聚维酮碘和 70% 乙醇对术区进行消毒。
  5. 切开前，皮下注射镇痛药（如布托啡诺，0.05–0.1 mg/kg）以缓解疼痛。

4. 在大鼠中使用T管进行胃造口术

注意：对所有实验动物均实施了改良胃造口术，以实现暂时性非经口管饲（n = 5）。

  1. 手术前一天使大鼠禁食。按照第3节准备手术。
  2. 通过在麻醉大鼠的皮肤和腹肌上做正中切口暴露胃部。
  3. 使用手术刀片在胃前壁创建一个3 mm的开口。
  4. 将硅胶T型管的尖端插入缺损部位，将其固定在胃壁上。
  5. 妥善缝合，确保T型管不会从胃壁脱落。
  6. 将植入的T型管远端经皮下隧道引出至颈部背部。
  7. 在T型管末端安装肝素帽，防止胃内容物反流。
    注意：使用套管针将T型管末端与肝素帽连接。
  8. 使用4-0聚乳酸羟基乙酸缝线缝合腹壁和皮肤各层。
  9. 胃造口术完成后，将所有实验大鼠单独饲养于代谢笼中。

5. 食管移植

注意：在胃造口术后 1 周进行双层管状支架的食管移植（n = 5）。移植前，在生物反应器系统中将人源间充质干细胞（hMSCs）接种至各支架内壁（细胞密度：1 × 106 个细胞/mL，置于基底膜基质中），并培养 3 天。手术步骤如下。

  1. 去除模型动物颈部的毛发，并对手术区域进行标准的无菌手术铺巾。
    注意：建议创建较大的剃毛区域，以确保动物在手术过程中维持无菌状态。
  2. 在颈部做前正中切口后，分离带状肌，暴露气管食管结构。
  3. 在切除食管节段前，需钝性分离迷走神经与食管，否则会影响动物的呼吸功能。
  4. 在放大镜下，将食管左侧与气管分离，并小心地将上段食管与甲状腺分离。
  5. 使用手术剪在食管上制作一个长度为5 mm的全周性缺损，缺损需贯穿食管所有层次。
    注意：在进行食管移植前，应使用手术剪将预先准备好的支架修剪至与移植部位长度相匹配。
  6. 在显微镜下，使用9-0缝线对远端食管缺损的两端进行显微吻合。首先在上段食管残端右下后缘与支架之间缝合第一针，随后从右至左继续在上段食管残端与支架之间缝合。下段食管残端与支架的吻合方式与上段相同。
    注意：应采用临床食管移植手术中常用的显微血管吻合技术。使用显微镜进行精确、严密的缝合，确保植入部位无渗漏。
  7. 移植完成后，将周围甲状腺组织瓣覆盖于移植部位，以确保移植物的稳定固定和血液供应。
  8. 移植术后，使用4-0薇乔缝线缝合皮下肌肉和皮肤组织。
  9. 所有实验大鼠均单独饲养于代谢笼中。

6. 术后操作

注意：术后操作在胃造口术和食管移植术后均需进行。

  1. 关闭腹腔切口后，将大鼠放入单独的代谢笼中，并将笼子置于红外线加热装置上，以防止低体温。
  2. 持续监测动物，直至其达到并维持胸卧位（即直立俯卧姿势）。
  3. 为减少手术部位的炎症反应，每日给予大鼠庆大霉素（20 mg/kg）抗生素治疗。
  4. 术后第3天开始经口给予液体喂养，直至研究终点。自术后次日起，通过肝素帽每日3次给予全营养配方（20.6 g/100 ml [g%] 碳水化合物，3.8 g% 蛋白质，0.2 g% 脂肪）。
  5. 每日检查动物外观及体重变化。观察其行为表现，如自残切口部位或抗拒管饲等情况，以及各种术后并发症。当大鼠模型体重迅速下降20%或以上时，采用CO2吸入法实施安乐死。

7. 组织学与免疫组织化学

注意：进行组织学分析时，使用手术剪刀取出安乐死动物的全部食管组织。采用标准组织学技术进行苏木精和伊红染色以及马松三色染色。免疫组织化学实验按照以下方案进行。

  1. 用4%多聚甲醛固定包含移植部位的完整食管组织，制备石蜡包埋块并切成4 µm厚的切片。
  2. 脱蜡组织切片，并通过梯度乙醇脱水。将组织切片浸入柠檬酸缓冲液中，在微波炉中加热10分钟。用冷PBS冷却20分钟，再浸入3%过氧化氢溶液中6分钟，最后用PBS洗涤10分钟。
  3. 在室温下用3%牛血清白蛋白（BSA）孵育1小时，以阻断组织切片的非特异性反应。
  4. 用PBS洗涤3次，每次5分钟。在4 °C下与抗Desmin抗体（1:200稀释）、抗角蛋白13抗体（1:100稀释）和抗血管性血友病因子抗体（vWF；1:100稀释）在4 °C下孵育过夜。
  5. 用PBS洗涤3次，每次15分钟。在室温下加入针对Desmin和角蛋白13的适当二抗（1:500浓度）孵育。随后用PBS洗涤2次，每次10分钟。
    注意：vWF的组织切片使用辣根过氧化物酶标记的试剂盒（见材料表）进行孵育，并用3,3'-二氨基联苯胺（DAB）显色。
  6. 使用含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂和玻璃盖玻片封片。

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结果

图1展示了PU-PCL双层管状支架的制备工艺示意图。将PU溶液通过18 G针头进行静电纺丝，形成厚度为200 µm的圆柱形内层结构。随后，将熔融的PCL以一定间距打印在PU纳米纤维的外壁上。扫描电子显微镜图像中可观察到所制备的管状支架内外壁的表面形貌。

图2展示了在大鼠体内插入胃造口管以进行外部营养供给的过程（图2A）。将T形硅胶管插入胃壁并缝合固定（图2B）。随后将导管经皮下隧道引至颈部背部，并连接肝素帽（图2C）。该导管便于注入液态食物，同时可防止胃内容...

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讨论

目前关于人工食管的动物研究仍受到若干关键因素的限制。理想的人工食管支架应具备良好的生物相容性以及优异的物理性能。它应能在术后早期促进黏膜上皮的再生，以防止吻合口漏的发生。内层环形肌和外层纵行肌的再生对于实现功能性蠕动同样至关重要12,13。

食管的力学特性至关重要，因为食管在呼吸过程中会塌陷，而在吞咽时则会开放，并持续经历最大程度的拉伸及回缩现象14。植入的支架也必须具备这些力学特性。植入食管的黏弹性应足以适应食管蠕动过程中反复的拉伸-松弛运动。力学性能过弱的支架可能发生破裂或渗漏，导致受体出现严重并发症（如纵隔炎）。相反，过于僵硬的支架可能向食管腔内膨出，阻碍食物通过。静电纺纳米纤维具有非常理想的物理特性，适用于食管重建。细胞外基质（ECM）的拓扑结构为食管各层上皮细胞的迁移和分化提供了有利环境15。此外，其纳米孔结构还能防止唾液和多种病原体的渗漏

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披露

本研究设计的生物反应器系统已实现商业化（型号：ACBF-100）。

致谢

本研究由韩国卫生科技研发计划（Korea Health Technology R&D项目，由韩国健康产业开发院（KHIDI）资助，资金来源于保健福祉部 &韩国保健福祉部（资助编号：HI16C0362）以及韩国国家研究基金会通过教育科学技术部资助的基础科学研究中心项目（2017R1C1B2011132）。本研究使用的生物样本和数据由首尔国立大学医院生物样本库（韩国生物样本库网络成员单位）提供。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
代谢笼TEUNGDO BIO & PLANTJD-C-66
齐拉西酮（50 mg/g 剂量）Virbac1000000188
0.25% 胰蛋白酶-EDTAGibco25200-056
1 mL 注射器BD309659
2% 盐酸赛拉嗪（Rumpun）ByelyQ-0615-035
4% 多聚甲醛BIOSOLUTIONBP031
4-0 VicrylETHICONW9443
9-0 VicrylETHICONW2813
抗生素庆大霉素（Septopal）Septopal0409-1207-03
牛血清白蛋白（BSA）Sigma5470
柠檬酸缓冲液，pH6.0，10XSigmaC9999
DAB 过氧化物酶底物试剂盒VECTORSK4100
结蛋白（Desmin）Santa Cruzsc-23879
弹性染色试剂盒ScyTeKETS-1
乙醇Merck100983
乙醇Merck64-17-5
胎牛血清（FBS）Gibco16000-044
戊二醛Sigma354400
山羊抗小鼠 IgG（H+L）二抗ThermoFisherA-11001
肝素帽Hyupsung MedicalHS-T-05
hMSC（STEMPRO）/生长培养基
（MesenPRO RSTM）		InvitrogenR7788-110
辣根过氧化物酶偶联试剂盒（Vectastain）VECTORPK7800
过氧化氢JUNSEI7722-84-1
角蛋白13（Keratin13）NovusNBP1-97797
LIVE/DEAD 活性检测试剂盒Molecular ProbesL3224
MatrigelCorning354262
N,N-二甲基甲酰胺（DMF）Sigma227056
非粘附
24孔组织培养板		Corning3738
OsO4SigmaO5500
培养皿Eppendorf3072115
磷酸盐缓冲液（PBS）Gibco10010-023
磷酸盐缓冲液（PBS），10XBIOSOLUTIONBP007a
聚己内酯（PCL）聚合物Sigma440744
聚氨酯（PU+A2:A24）聚合物Lubrizol2363-80AE
电源NanoNCHV100
含 DAPI 的 ProLong Gold 抗荧光淬灭试剂InvitrogenP36931
RumpunBayerQ-0615-035
硅胶 T 型管Sewoon Medical2206-005
土霉素眼膏Pfizer Pharmaceutical KoreaW01890011
替来他明/唑拉西泮（Zoletil）Virbac LaboratoriesQ-0042-058
三色染色试剂盒ScyTeKTRM-1
血管性血友病因子（vWF）Santa Cruzsc 14014

参考文献

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