用于精确细胞表征与精准蛋白定位的细菌细胞三维成像

摘要

本实验方案介绍了如何制备和装载细菌样品以进行活体三维成像，以及如何从这些图像中重建大肠杆菌（E. coli）的三维形态。

摘要

细菌的形态对其生理功能具有重要意义。细胞形态可影响细胞运动性、捕食行为以及生物膜形成等多种生理特性。细菌细胞是三维（3D）结构，尽管在研究中很少被当作三维对象处理。大多数显微镜技术仅能获得二维（2D）图像，导致与真实三维细胞形态及蛋白质定位相关的数据丢失。某些形态参数，例如高斯曲率（两个主曲率的乘积），只能在三维条件下测量，因为二维图像无法同时获取两个主曲率。此外，并非所有细胞在制片时都能完全平展，对弯曲细胞进行二维成像可能无法准确反映其真实形态。在三维空间中精确测量蛋白质定位有助于确定蛋白质的空间调控机制及其功能。目前已开发出一种前向卷积技术，利用显微镜的模糊函数来重建三维细胞形态并实现蛋白质的精确定位。本文描述了一种用于活体细菌三维成像的样品制备与制片实验方案，旨在重建准确的细胞形态并实现蛋白质定位。该方法基于简单的样品制备、荧光图像采集以及基于MATLAB的图像处理。许多高质量的荧光显微镜均可通过简单改装以实现此类测量。这些细胞三维重建过程计算量较大，建议但并非必须使用高通量计算资源。该方法已成功应用于多种细菌物种及其突变株、不同荧光成像模式以及不同厂商的显微镜系统。

引言

所有类型的细胞都会调节其形态以实现特定功能。例如，神经元的形态与血细胞不同，其功能也不同。同样，细菌细胞也具有多种多样的形态和大小，尽管这些形态的功能并不总是明确^1,2。因此，准确确定细菌细胞的形态至关重要。本文所述方法提供了一种易于实施的技术，可用于收集适用于大多数活体或固定细菌细胞三维分析的数据。

本方法可对细菌细胞进行三维成像，以准确呈现样品的三维细胞形态，并精确定位蛋白质在这些形态中的位置。传统的显微镜技术仅能获取二维图像，这在研究具有异常或非对称形状的细胞时存在局限性，例如大肠杆菌（Escherichia coli）的突变体，或霍乱弧菌（Vibrio cholerae）和幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）等弯曲形细菌。尽管高分辨率的三维图像是该方法的关键输入数据，但该方法并不输出分辨率增强的图像。相反，该方法利用主动轮廓模型和显微镜的表观模糊函数，通过前向卷积算法重建细胞的三维表面坐标和形态³（图1）。该方法已被用于研究大肠杆菌（E. coli）中的细菌肌动蛋白同源蛋白MreB^4,5,6,7、霍乱弧菌（V. cholerae）中的新型周质骨架元件CrvA⁸，以及幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）中假定的巴克托菲林蛋白CcmA⁹（图2）。

蛋白质的定位可以揭示其功能。例如，参与细胞分裂的蛋白质通常定位于细胞中部^10,11。已有高通量研究致力于定位细菌中的所有蛋白质，以期深入了解其功能¹²。然而，这些研究采用的是二维成像和一维或二维分析，因此无法测量蛋白质定位的某些特定方面，例如蛋白质向细胞几何特征结构的定位。

例如，MreB 是一种对多种细菌杆状形态至关重要的动态蛋白，据推测其作用机制是通过指导细胞壁合成的定位来实现的，且其定位模式与细胞壁合成的定位模式相一致^7,13。来自多个物种的 MreB 均表现出几何结构依赖性的富集特征^4,6,7,14,15。像 MreB 这样的动态表面聚合物可能将表面几何结构与时间平均的富集分布相耦合¹⁶，并可能通过最小化与膜结合相关的能量而定向排列至特定几何结构¹⁷。尽管目前对于 MreB 的扭曲、成束、弯曲及动态行为的重要性尚未完全阐明，但需要注意的是，准确测量表面的两个主曲率必须依赖于细胞的完整三维表征。因此，为了最准确地测量蛋白质定位所对应的曲率，优先采用三维成像而非二维成像。三维成像避免了在二维条件下无法直接测量曲率而需进行计算估计的必要性，而这种估计在不对称细胞中可能并不准确¹⁸。

尽管细胞的二维成像速度更快，且不需要大量的成像后计算处理，但三维成像能够更准确地呈现细胞结构，并可测量表面特征（如曲率），而这些特征在二维成像中无法获取。因此，随着三维成像技术日益普及，将有望获得关于细胞形态和蛋白质定位的新见解。

方案

1. 样品制备

1. 通过基因工程使E. coli表达细胞质荧光蛋白⁶ ，或使用膜染料⁵，使其在成像时具有荧光。也可使用其他细菌种类替代 E. coli。
   1. ​通过电穿孔将编码细胞质mCherry荧光蛋白的质粒转入细胞。
      注意：也可使用其他颜色的不同荧光蛋白。
   2. 在含有适当抗生素的LB平板上，于37 °C培养转化子。获取单菌落，并通过显微镜鉴定阳性克隆。在显微镜下呈红色的抗性菌落即含有携带mCherry的质粒。
2. 在37 °C振荡培养箱中，用含适当抗生素的LB液体培养基培养2 mL过夜培养物。接种物可使用平板上的单菌落或少量冻存菌液。
   注意：应使用适合实验所选细菌细胞的培养基。
3. 将过夜培养物按1:1,000比例转接到5 mL新鲜LB培养基中，在37 °C振荡培养箱中培养3−4小时，使细胞生长至对数期。测定细胞OD₆₀₀以确认其处于对数生长期（即OD₆₀₀ = 0.2−0.4）。
   注意：可根据具体实验需求，在任意生长阶段进行成像。

2. 载玻片制备

注意：必须使用自发荧光较低的培养基。任何自发荧光较低的培养基均可使用。本实验中，需使用1%琼脂糖M63最低培养基垫，并用VaLaP¹⁹密封，以实现细胞的三维成像。

1. 在20 mL最小培养基中配制1%的琼脂糖溶液。
   1. 将溶液放入微波炉加热，直至琼脂糖完全溶解，溶液呈透明状。
   2. 将溶液置于60 °C水浴中保温，待用。
      注意：该溶液可根据需要反复凝固和融化，也可分装成小份，按需融化。经过多次使用后，培养基可能变色，应予以更换。
2. 在80−100 °C的加热板上融化VaLaP封片剂。
   注意：制备VaLaP封片剂的方法为：在加热板上将50 g凡士林、50 g羊毛脂和50 g石蜡置于烧杯中，共同加热至80−100 °C使其融化。大量制备的VaLaP可在室温下长期保存，足以用于>500张载玻片。若加热温度超过>100 °C，VaLaP会发生降解并颜色加深。
3. 在载玻片两端各放置一组由三片20 mm × 20 mm盖玻片叠成的堆叠（共六片盖玻片）。
4. 用移液器将200 µL琼脂糖垫液滴加到载玻片上。
   注意：若未使用工程化荧光染料，可在本步骤前向琼脂糖垫液中添加膜染料。将染料溶于水中，并取适量加入1 mL琼脂糖垫液，终浓度为5 µg/mL。
5. 立即用力将另一张载玻片压在盖玻片堆叠上，使琼脂压平，并在室温下静置1分钟使其凝固。
6. 小心地将上层载玻片滑开。
7. 使用200 µL移液器吸头的粗端在载玻片上从凝胶中切出单个垫片（直径约5 mm），并丢弃形状不规则或不需要的凝胶部分。
   注意：若需对多个菌株或不同条件进行成像，每种情况需使用独立的垫片。若仅对一个菌株成像，建议制备3−4个垫片以更好地支撑盖玻片。
8. 反复吹吸细胞数次，以打散细胞团块并确保菌液充分混匀。从步骤1.3的亚培养物中取1 µL滴加至垫片上。
   注意：细胞形态重建需要单个细胞且细胞之间互不接触。若使用静止期或高密度培养物，可能需要在加样前将样品稀释1:10。
9. 让样品在空气中干燥5−10分钟。确保液滴完全被垫片吸收。若仍有液体残留，细胞将在液体中移动，无法进行成像。
10. 将盖玻片覆盖在垫片上方。
11. 用棉签蘸取熔化的VaLaP，轻轻涂抹于盖玻片边缘以进行封片 。注意避免涂抹到盖玻片顶部，以免物镜接触。VaLaP将在数秒内硬化，从而密封样品。
12. 立即对样品进行成像。
    注意：应在载玻片制备完成后尽快进行成像。细胞可在垫片上继续生长，若发生分裂，将增加形态重建的难度。

3. 成像要求

1. 确保显微镜的 z 轴（聚焦轴）能够实现小于 50 nm 的精确移动。请使用研究级显微镜上配备的压电 z 轴载物台（参见材料表），因为普通的电动聚焦装置无法达到此精度。
   注意：根据奈奎斯特-香农采样定理²⁰，需具备移动最小期望步长 0.5 倍的能力，即达到期望空间频率的 2 倍。本实验方案中需要 100 nm 的步长，因此要求载物台的精度达到 50 nm 或更高。
2. 确保显微镜配备数值孔径（NA）不低于 1.45 的 100 倍物镜。
   1. 采集 200−400 个不同细胞的 z 层切图像，以确保获得足够数量的细胞用于后续分析。
      注意：所需细胞数量取决于目标样本的内在变异性。在此阶段采集的部分细胞可能无法通过后续重建步骤。
3. 若检测第二荧光通道（如蛋白、代谢标记物等），需确保 z 层切图像的设置与形态学通道所用参数一致。

4. 成像

1. 将密封的载玻片放置到显微镜上，并静置5分钟，使其温度与周围环境达到平衡，因为显微镜室的温度可能与样品制备室不同。
2. 对样品采集荧光z轴层扫图像。
   注意： z轴层扫应完全覆盖样品，z轴步长应小于景深。对于1.45数值孔径（NA）的100倍物镜以及约1 μm厚的E. coli细胞，每步0.1 μm、共40步效果良好。对于较大的细胞或未能完全平铺在表面的细胞，可能需要50步或更多。应包含足够的层数，并确保样品在上下方向均完全模糊。
   1. 使用与显微镜配套的软件（参见材料表）控制显微镜。
   2. 使用显微镜的调焦旋钮将焦点对准细胞中部。在ND采集下勾选Z轴框以进行z轴层扫。点击Home按钮，将细胞中部设为起始点。将步长设为0.1 µm，将范围设为4 µm。确保Z轴装置设置为压电载物台。
   3. 在Lambda窗口下设置荧光通道，以匹配所成像荧光分子的参数。本实验中使用了GFP和mCherry。
      注意： 若需获取另一荧光通道的三维分布，应使用相同的步长和范围额外采集一组z轴层扫图像。本实验中，细胞质mCherry用于确定细胞形态，MreB-GFP作为第二荧光通道²¹。
   4. 确保实验顺序设置为“lambda（z序列）”，以便在切换通道前完成每个荧光通道的完整z轴层扫。
   5. 点击立即运行开始图像采集，并在完成一个或两个z轴层扫后保存文件。 
   6. 移动至垫片上的新区域，重复步骤4.2.2–4.2.5。

5. 细胞重建

1. 裁剪单个细胞，并将图像保存为堆叠的TIFF文件，确保每个文件中仅包含一个细胞。该细胞应与其他细胞充分分离（即在xy方向上距离至少约为模糊函数半高全宽的5倍）。
   注意： 这可以使用免费的图像分析软件完成（参见 材料表).
   1. 在单个细胞周围绘制一个方框 重复 将细胞复制两次，每个通道各复制一次。确保勾选“复制超栈”选项框，并将通道更改为1或2，同时确保切片包含完整的z栈。
      注意： 如果仅成像细胞的形态而不涉及额外的荧光蛋白，则只存在一个通道。
   2. 当两个堆栈都可用后，转到 图像 | 图像序列 | 工具 | 拼接 先将图像与蛋白通道合并，再与形态通道合并。
   3. 将新图像另存为 TIFF 文件。
2. 使用亚衍射极限荧光微球测量显微镜的模糊函数²²这需要针对每台显微镜和每个显微镜物镜进行，但可在成像目标样本之前或之后完成。
   1. 使用可用软件对多个独立的微珠进行平均处理，并结合一定程度的手动干预（参见 材料表).
      注意： 最终产物应是与感兴趣样本具有相同xyz间距的模糊函数的三维图像。
3. 使用可用软件运行前向卷积细胞形态重建脚本。这些脚本的最新版本可从以下网址免费下载： https://github.com/PrincetonUniversity/shae-cellshape-public
   1. 在桌面上创建一个文件夹，该文件夹内包含已裁剪图像的文件夹以及 cell_shape_settings_tri.txt 来自 shae-cellshape-public/exampleData_tri 的文件
   2. 编辑 细胞形态设置三.txt 以确保实验所需的正确设置。本实验的设置文件包含以下内容：
      nm_per_pixel 70
      Z轴比例 0.65
      stack_z_size 41
      stack_t_size 1
      Fstack_z_size 41
      Fstack_t_size 1
      stack_seperation_nm 100
      Fstack_seperation_nm 100
      psfScript -999 osuPSF20180726
      梯度 1
      
      注意： 该文本文件被划分为多个部分，每个部分被解析为独立的变量。尽管大多数设置在不同实验之间无需更改，但应确保 z-stack 的尺寸（堆栈z轴尺寸 形态 Fstack_z_size 目标蛋白），z轴堆叠的间距（堆栈分离纳米（nm）, Fstack_分离距离_纳米），显微镜的相对焦平面位移（Z轴比例尺)²³，xy方向上的像素尺寸（nm_per_pixel），以及加载显微镜模糊函数的脚本名称（psfScript）与实验相匹配。该 梯度 如果形态通道显示为细胞质填充，则该字段应设为1；如果为膜染色对象，则设为0。
   3. 运行 Cell_shape_detector3dConvTriFolder 函数（shae-cellshape-public/CellShapeDetectorTri/）后接文件夹路径，然后是起始细胞编号及细胞数量 细胞你想要运行的。
      注意： 三维卷积三角形文件夹细胞形态检测器的输入示例格式如下：Cell_shape_detector3dConvTriFolder（“裁剪后图像所在文件夹的路径”，文件夹中的起始索引，  细胞数量）。单个细胞的重建通常需要 5−20 分钟以达到收敛并完成。
4. 在将细胞重建结果用于任何统计分析之前，需对细胞重建进行筛选，以确保其准确性。
   1. 运行 ScreenFits （shae-cellshape-public/shae-fitViewerGui/）以直观地筛选单个细胞的重建结果。
   2. 当图形用户界面（GUI）打开后，点击“选择文件夹”按钮，然后选择在步骤 5.3 中生成的包含重建数据文件（TRI.mat）的文件夹。
   3. 如果细胞重建后出现形态异常或未完全收敛，请勾选其旁边的复选框图3）。这可能表现为细胞出现一个孔洞、一个扁平侧面，或从中伸出一个分支。这将附加“FLAG以避免其被纳入任何后续分析。
      注意： 重建的细胞可与原始图像进行比较。如果您的细胞来源于形态各异的异质性群体，这一点尤为重要。
5. 运行 enrichmentSmoothingSpline（shae-cellshape-public/）以生成目标蛋白相对浓度随表面高斯曲率变化的富集曲线。
   1. 选择在步骤 5.3.3 中创建的每个包含 TRI.mat 文件的文件夹。
   2. 选择新创建的（5.5.1）curve.mat 文件。
      注意： 在5.5.1中选定的每个文件夹都将生成一个curve.mat文件。 所有富集谱图将呈现在同一张图中。如果需要单独的图，则需对每个文件夹分别运行5.5步骤。
      注意： 除了对荧光蛋白进行精确的几何定位外，还有多种方法可用于分析来自第二通道的数据，包括对物体的数量、大小和方向进行统计⁴.

结果

细菌具有多种多样的形状和大小，这些形态特征可能决定其在自然界中的功能¹。本实验方法的最终结果是通过z轴图像堆栈的前向卷积，获得细胞的精确三维（3D）表征（图1）。当研究弯曲形细胞（图2）或形态异常的细胞（图4A）时，该方法尤为重要，因为二维（2D）表征无法准确反映细胞的曲率。为了应用前向卷积方法（图1A），细胞需进行周边染色或胞质染色（图2B 左图与右图对比）。

图4展示了MreB在细胞内的定位。为了研究MreB在野生型和突变型E. coli细胞中的精确定位，构建了细菌肌动蛋白MreB的GFP融合蛋白²¹⁴。由于MreB与细胞膜相关，因此需要三维成像来准确再现其在细胞内的位置。通过进行三维测量，我们能够重建野生型和rodZ突变型细胞的形态（图4A）。结果显示，MreB的定位富集于较小的高斯曲率区域，这是一种仅能在三维条件下测量的几何特征，并且该定位依赖于RodZ蛋白（图4B）。

图1：前向卷积方法无需细胞形态的先验知识即可重建细胞。 (A该方法的最终输出是通过将测试形状与显微镜的校准模糊函数进行比较而获得的三维细胞重建结果。通过不断调整，使观测到的z轴层析图像与假设的三维图像相匹配。此处所示图像为一次重建的三维渲染图 C. crescentus 细胞。B重建流程根据观测到的图像堆栈迭代更新表面元素的估计位置。有关该方法的完整算法细节，请参见 Nguyen³. (C重建流程从无开始 先验的 了解细胞的形状，并更新表面顶点的位置和数量以匹配观察到的z层图像。在三维重建过程中，每隔30步的代表性图像从三个不同角度展示了一个 V. cholerae 细胞。该形状的表面位置被更新，以最小化模拟堆栈与观测堆栈之间的差异。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 2：三种不同形态细菌物种的代表性三维重建。 可根据细胞膜被染色（左）或细胞质内填充荧光染料（右）的细胞进行三维重建。起始细胞的形态和曲率并不重要，因为弯曲杆状、扭曲杆状或直杆状细胞均可被准确重建。重建的表面根据其局部高斯曲率进行着色。比例尺 = 1 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：重建结果可能因多种原因失败。 必须对细胞进行筛选，以确保重建算法收敛到合理的结果。左侧 = 通过质量控制的代表性野生型（上方）和 rodZ 突变体（下方）E. coli 细胞；右侧 = 未能正确重建且未通过质量控制的细胞。图中展示了五类重建失败的情况：(i) 细胞过于靠近裁剪区域边缘，导致出现明显边界；(ii) 细胞过于靠近另一个细胞；(iii) 细胞重建后出现凹陷；(iv) 重建过程未能超出初始起点；(v) 其他未知错误。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：显示蛋白质定位于特定细胞几何结构的代表性数据。（A）野生型和rodZ E. coli细胞的三维重建图像，显示高斯曲率和MreB荧光强度。比例尺 = 1 µm。（B）来自野生型和rodZ E. coli细胞的MreB富集图。数值>1表示MreB在这些细胞区域相对于细胞均匀覆盖的富集，数值<1表示耗竭。阴影区域表示均值的±90%自助法置信区间。每条菌株的曲线为三次平滑样条曲线，并使用极端曲率的概率阈值p > 5 x 10^-3进行截断。本图改编自（Bratton等）⁴。请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

本方案中的一个关键步骤是获取高质量的图像。为了正确重建细胞，细胞上下方必须有足够的模糊范围。因此，所采集的z轴堆栈必须覆盖足够大的距离。在图像采集过程中，步数可根据每种菌株进行调整。例如，缺失rodZ基因的E. coli细胞更宽，需要比野生型细胞更多的步数，因此需要更大的成像距离。如果在图像采集过程中样品发生漂移，重建结果可能会出现严重误差。因此，在成像前应让载玻片与显微镜达到热平衡，以避免z轴堆栈采集过程中的漂移。细胞应在自发荧光较低的垫片上成像。培养基成分（如常用的LB培养基中的成分）具有自发荧光，可能在尝试重建细胞时造成干扰。成像垫片上的细胞密度非常重要，因为重建过程是对每个细胞独立进行的。细胞过少会增加获取足够数量细胞图像所需的时间，而细胞过多则会导致成像视野过于密集，难以单独裁剪出单个细胞。由于并非所有细胞都能成功重建，因此在采集阶段应多成像一些细胞，并在进行统计分析之前对所有输出结果进行筛选（图3）。

该方法的许多局限性属于技术层面。所使用的显微镜必须配备高数值孔径的物镜（通常>1.4），因为这能够实现细菌尺度上的光学切片。此外，显微镜需要配备压电载物台，以便在z方向上进行微小而精确的步进移动。另外，虽然并非必需，但建议使用高性能计算资源来运行图像分析软件，这将显著缩短细胞重建所需的处理时间。

该方法的一个概念性局限在于，必须选择合适的能量尺度，以权衡重构的平滑性与图像信噪比之间的关系。为了验证参数选择的合理性，应采用独立的方法（如透射电子显微镜（TEM）或原子力显微镜（AFM））测量细胞的大小和形状。作为原理验证，可在原子力显微镜（AFM）上进行细胞的三维重构，以检测其z轴精度（<50 nm），或在透射电子显微镜（TEM）载网上进行重构，以检测其xy平面精度（<30 nm）³。这种关联分析方法耗时且成本较高。一种更简便的方法是成像标准样品，例如野生型细胞或直径为1 µm的球形微珠。通过分析重构结果的直径和球形度，可确保重构过程中所使用的尺寸和能量尺度设置正确。

这并非唯一一种试图从荧光显微镜图像中提取高分辨率空间信息的方法。许多综述文章描述了超分辨率显微技术领域的最新进展^24,25。去卷积显微技术²⁶、转盘共聚焦显微技术²⁷、像素重分配²⁸以及结构光照明显微技术（SIM）²⁹等提升分辨率的技术，旨在提高显微镜所获取图像的分辨率。这些方法与本文所述方法并不冲突。最近，该方法已被改进以支持将基于SIM的图像作为输入⁹。尽管前向卷积方法在理论基础上与去卷积显微技术有一定共通之处，但其输出结果完全不同：去卷积显微等方法旨在提升图像分辨率，而本方法并不生成图像，而是重建出精度约为50 nm的细胞形态。基于稀疏标记样品的单分子主动控制显微技术可实现比本方法更高的空间精度。但在许多情况下，这些单分子方法需要优化荧光探针结构，且往往需要较长的采集时间，因而难以应用于活细胞或动态样品。上述每种方法都存在一种或多种本方法所不具备的局限性。例如，转盘共聚焦显微技术所宣称的优势在细菌细胞单层样品中并不显著，因为此类样品中几乎没有来自焦平面外的光信号。此外，本方法提供了一种无需任何特殊荧光染料即可获取精确三维细胞形态和蛋白质定位信息的分析流程。该方法对硬件要求极低（例如仅需配备z轴压电载物台和高数值孔径物镜），且每个时间点仅需采集数十张图像，因而可轻松用于研究动态三维结构⁶。

研究细菌细胞在三维结构中排列方式的方法日益增多。其中包括与本方法在概念上相似的技术，这些技术利用高质量的三维荧光图像进行分析^30,31,32。本方法要求细胞分离良好，且不对细胞几何形态做任何先验假设。然而，在研究致密的细胞聚集体或生物膜时，需假设细胞呈杆状。这种较低分辨率的观察仍可用于分析细胞的排列堆积方式，但由于生物膜中细胞密度较高，无法对特定因子的亚细胞定位进行分析。

未来，开发一个将单分子和宽场方法与这种三维重建技术相结合的框架可能会很有意义。此外，或许可以将这种前向卷积方法与机器视觉分割工具³²相结合，以实现对更密集细胞簇的重建。

细胞为何演化成特定形态是一个复杂的问题，这必然反映了细胞所处环境的复杂性。要理解细胞形态的演化及其功能，就需要对这些形态进行精确且准确的测量，而本方法正是提供了这种测量手段。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
50 nm 荧光微球	Invitrogen	F8795	用于测量显微镜的模糊函数
琼脂糖	sigma-Aldrich	A9539
棉签	Puritan Medical Products Company LLC	S304659	用于涂抹 VaLaP
盖玻片	VWR	16004-302
Fiji	ImageJ	https://fiji.sc	用于裁剪细胞图像
FM4-64	Invitrogen	LST3166	用于细胞染色的膜染料
Huygens 软件	Scientific Volume Imaging	Huygens essential 或 professional	用于测量显微镜的模糊函数
羊毛脂	Sigma-Aldrich	L7387	与石蜡和凡士林混合制备 VaLaP
LB 培养基	BD Difco	DF0446173
M63 培养基	US Biological	M1015
MATLAB	Mathworks		运行前向卷积脚本所需
载玻片	Fisher	12-550-133
NIS Elements	Nkon
石蜡	Sigma-Aldrich	327212
凡士林	Equate	49035-038-27
压电 Z 轴载物台	Nikon	77011589
移液器吸头 -p200	USA Scientific	1111-0730
移液器吸头 -p10	USA Scientific	1111-3730