本实验方案的目标是建立一种低水平毒物暴露的小鼠模型，该模型不会引起明显的肝损伤，而是加剧已存在的肝脏损害。这一范式能更好地模拟人类对毒物的暴露情况，以及在接触被认为安全浓度的毒物后所发生的细微变化。
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摘要
摘要
氯乙烯（VC）是一种常见的环境污染物，在高浓度下可导致脂肪性肝炎，但在较低浓度下通常被认为安全。尽管已有若干研究探讨了氯乙烯作为直接肝毒性物质的作用，但氯乙烯可能改变肝脏对其他因素（例如由高脂饮食（HFD）引起的非酒精性脂肪性肝病（NAFLD））的敏感性这一概念尚属新颖。本实验方案描述了一种评估长期低剂量氯乙烯暴露效应的暴露范式。小鼠在开始吸入暴露前一周即适应低脂或高脂饮食，并在整个实验期间持续维持相应饮食。小鼠每天在吸入染毒舱中暴露于氯乙烯（低于OSHA限值：<1 ppm）或普通空气中，每日6小时，每周5天，最长持续12周。每周监测动物体重增长和食物摄入情况。单独氯乙烯吸入暴露在此模型中未引起明显的肝损伤。然而，氯乙烯与高脂饮食联合作用显著加剧了肝脏疾病的发展。该共暴露模型的一个技术优势在于实现了无束缚的全身暴露。此外，该实验条件更接近人类常见的实际情况，即在已有非酒精性脂肪性肝病的基础上同时暴露于氯乙烯，从而支持了氯乙烯是肥胖相关肝损伤（即NAFLD）环境危险因素这一新假说。本研究挑战了当前氯乙烯暴露限值（职业性和环境性）是安全的传统观念。该模型的使用可为氯乙烯暴露风险带来新的认识和警示。这种毒物诱导的肝损伤模型也可用于其他挥发性有机化合物的研究，以及探索可能影响肝脏及其他器官系统的其他相互作用。
引言
我们呼吸的空气中存在多种低浓度的有毒物质。氯乙烯（VC）是一种工业上用于生产聚氯乙烯（PVC）塑料制品的单体气体1。它是一种常见的环境性肝毒性物质，已被确认为致癌物，并在ATSDR危险物质优先清单中位列第4位2。为了更好地理解其对人类健康的毒性影响以及与现有共病之间的相互作用，建立能够模拟人类暴露情况的暴露模型至关重要。本研究团队的主要兴趣在于研究低浓度氯乙烯长期暴露对肝脏的影响。氯乙烯的主要靶器官是肝脏，在高浓度暴露下已被证实可导致脂肪变性、伴有坏死、纤维化和肝硬化的毒性相关性脂肪性肝炎（TASH）3,4，以及肝细胞癌（HCC）和极为罕见的肝血管肉瘤5。TASH可能已在人群中存在数十年，但长期以来未被充分表征，也未受到研究者的足够重视4,6。由于研究已表明氯乙烯暴露具有明确的直接毒性风险，美国职业安全与健康管理局（OSHA）已将8小时工作日内可接受的暴露限值降低至1 ppm7。尽管暴露限值已被下调，但该浓度的氯乙烯对人类健康的具体影响仍不明确7。此外，氯乙烯暴露对已有共病（如肝脏疾病）的影响在很大程度上尚不清楚8。这一知识空白在当前尤为关键，因为非酒精性脂肪性肝病（NALFD）在全球范围内的患病率正不断上升4,6,7,9,10,11,12。重要的是，最近的研究表明，氯乙烯是其他原因所致肝病的独立危险因素13。因此，本实验方案的目标是建立一种与人体暴露情况相关的吸入模型，用于研究在已有肝损伤背景下挥发性环境毒物氯乙烯的暴露效应，以模拟人类实际暴露条件，并识别氯乙烯诱导或加剧肝损伤的潜在新机制。
许多环境毒物和污染物的主要暴露途径是通过吸入。一旦被吸入，化合物可通过肺部进入体循环，随后到达肝脏，并在排泄前由肝酶进行代谢活化14,15,16。通常正是这些活性代谢产物在体内引起毒性与损伤。本课题组及其他研究团队此前曾使用氯乙烯（VC）的代谢产物作为暴露于氯乙烯气体的替代指标17,18。其他研究组则采用了氯乙烯吸入模型；然而，这些模型需使用极高的暴露浓度（>50 ppm）才能诱导急性毒性、严重肝损伤及肿瘤形成19。尽管这些研究提供了关于氯乙烯致癌机制的关键信息，但它们无法再现细微的生物学效应以及与其他影响因素之间的复杂相互作用，因此与人类实际暴露情况的相关性较低。
本文所述的氯乙烯（VC）吸入联合高脂饮食（HFD）模型（时间线见图1），是首个模拟慢性低剂量氯乙烯暴露（即低于OSHA规定的浓度）的小鼠模型，其暴露条件更接近人类实际暴露情况。事实上，该模型所得数据重现了在暴露于氯乙烯的人群中观察到的结果，例如对代谢通路20、氧化应激及线粒体功能障碍的影响4。其他小鼠吸入模型，如头部仅暴露或鼻部仅暴露模型21，需将动物固定，从而导致动物产生应激反应。而本研究采用的全身暴露方法无需注射，也避免了对动物造成不必要的应激。实验动物可自由摄取食物和饮水，每日按预定小时数、每周按预定天数置于较大的吸入暴露舱内。此外，氯乙烯可改变机体对其他肝毒性物质敏感性的概念是一项新颖的发现，首次由本研究团队证实12，该发现提示，即使在远低于直接引起肝毒性的浓度下，氯乙烯暴露仍可能具有潜在健康影响。
这种吸入暴露方法可用于模拟暴露于环境中存在的多种气态毒物，包括其他挥发性有机化合物。事实上，挥发性有机化合物是一类重要的环境毒物，在工业化地区更为普遍，导致某些人群面临更高的慢性暴露风险22。本实验方案可根据不同的研究问题进行调整，暴露时间和化合物浓度均可变化。尽管该模型最初用于肝损伤的评估，但其他器官系统也已应用此模型开展研究23。旨在研究动物慢性暴露且希望尽量减少动物应激的研究人员，应考虑采用此模型。
方案
所有动物/载体对照实验均经环境卫生部门批准，并由当地机构动物护理与使用委员会批准实验操作规程。
1. 实验设置及对纯化实验饮食的适应
- 确定C56Bl/6J小鼠的总数量（每组至少6−8只小鼠）。
注意：每种饮食组的动物将进一步细分为不同的暴露组。在规划研究时，务必计算所需动物的总数。 - 识别并称量动物体重，记录这些数据。
- 在开始吸入实验前一周，将小鼠饮食从普通饲料转换为纯化低脂饮食（LFD）或高脂饮食（HFD），以使小鼠适应新的饮食（实验时间线见图1）。
- 自由供应食物和饮水。通过称量并记录每笼分配的食物量，以及在每次喂食日称量并记录剩余食物量，来监测食物消耗情况。若每笼饲养4只小鼠，每周提供约50 g食物两次；若每笼饲养5只小鼠，每周提供约60 g食物两次。
注意：在喂食纯化饮食期间，应每天检查食物量，以确保小鼠有足够的饲料颗粒。若饲料不足，小鼠倾向于“囤积”食物并增加摄入量。此外，尤其是HFD比LFD更容易碎裂，从而产生类似影响。 - 在整个实验过程中监测动物状况，以确保动物健康。
注意：可进行每周体重增长、食物消耗量以及代谢监测，以评估动物整体健康状况。
2. 氯乙烯吸入暴露系统
注意：市面上有多种可购买的吸入暴露系统，从“仅鼻部暴露”到“全身暴露”以及从手动到自动系统不等。本研究团队先前发表的数据来自一种手动全身暴露系统12,23,24。自动化吸入暴露系统的示意图见图2。
- 确保实验舱和对照舱中的稀释空气在进入各自的流量测量装置（质量流量控制器 [MFC]–实验舱，转子流量计–对照舱）之前，均已通过高效微粒空气（HEPA）过滤、活性炭过滤、干燥并进行压力调节。
注：在对照舱中，转子流量计用于调节进入小鼠舱的气流。空气从舱体顶部进入，流经小鼠所在区域，随后在小鼠下方排出，并通过HEPA过滤器后进入化学通风橱。舱内需监测温度和相对湿度（RH）。在实验舱中，稀释空气与来自氯乙烯（VC）气罐的空气混合，两种气流均由质量流量控制器（MFC）调节。两种气流的比例决定了实验舱中氯乙烯的浓度。氯乙烯气体通过一个带有七个朝向不同方向喷嘴的分散器从舱体顶部进入，流经小鼠所在区域后，从笼架下方的12个独立排气口排出。此前研究已证实，该舱体设计可实现毒物浓度的均匀分布25。 - 确保对实验舱和对照舱内部的压力、温度和相对湿度（RH）进行实时监测。
- 确认舱体排出的气体在进入化学通风橱的排气区域前，依次经过HEPA过滤器、CO2探头和活性炭过滤器，并持续监测CO2水平，以确保小鼠获得可接受的通风条件。
- 使用定制软件在吸入暴露过程中调节、监测并记录环境参数。
注：若使用手动系统，则应在暴露期间定期监测并在必要时校准步骤2.1−2.4中所述的各项参数。
3. 暴露前准备
- 为确保技术人员安全，请关闭实验舱和对照舱中的所有气流。
- 对于每个舱体，打开舱门，并将吸水性垫料（吸水面朝上）放置在排泄物托盘上方。润湿垫料以在整个暴露期间维持适宜的湿度水平（40−60% RH）。
- 设定舱内氯乙烯（VC）的期望暴露浓度。若需设定低于OSHA限值的浓度，请使用0.85 ppm的VC。可通过软件控制、基于检测器反馈的自动调控方式向舱内输送VC，也可采用手动调节系统的方式。
注意：后一种方法需要了解舱体体积、舱体换气速率、气流速率以及来自储备气源的VC气体输送速率；这些参数计算后必须通过稳态下舱内VC浓度的实测结果进行验证和校准12,24。测量舱内VC浓度最常用的技术是通过气相色谱法分析空气样品12,24。软件驱动方法在VC输送的准确性和精确性方面具有明显优势。然而，已有研究表明手动方法同样具有准确性和一致性12,24。
警告：VC在高浓度下为已知的毒性物质和致癌物。在开启和关闭舱体时，务必正确使用个人防护装备并规范操作该气体。
4. 暴露笼和动物准备
- 将小鼠从饲养箱中取出，放入吸入暴露室笼架的独立笼具中（对照组小鼠使用一个笼架，暴露组小鼠使用另一个笼架）。每天随机调整每只小鼠在笼架中的位置，以确保每只小鼠在暴露室内接受均匀的暴露。在实验记录本中标注每只动物的编号及其在笼具中的位置。
- 将每个笼架放入相应的暴露室中，并关闭暴露室门。
5. 进行暴露实验
- 确保氯乙烯（VC）气瓶的阀门处于打开状态。确保实验舱的稀释气流速设置为 25 L/min。
- 启动实验舱内的稀释气流。确保控制舱的转子流量计设置为 25 L/min。
- 确保所有传感器（气流、温度、湿度、舱内压力、CO2 浓度）在实验舱和控制舱中均正常工作，并显示预期结果。
注意：氯乙烯（VC）气流根据稀释气流速和目标 VC 浓度进行计算并设定。 - 确保在整个暴露过程中，实验舱内的暴露时间、稀释气流速、VC 气流速、温度、湿度、舱内压力、CO2 浓度以及理论 VC 浓度均被实时显示、绘图并记录。确认控制舱的温度和湿度也同时被显示、绘图和记录。
注意：若使用手动系统，在暴露期间应定期检查并根据需要调整 VC 气流。 - 若在暴露过程中出现任何问题，应立即将 VC 气流调至零，并将稀释气流增至最大值，以快速清除舱内气体。
- 当达到设定的暴露时长（例如每天 6 小时）后，软件将自动关闭 VC 气流。随后，安全计时器开始 15 分钟的延时，以确保实验舱内的 VC 被充分清除。当确认可安全取出动物时，点击对话框中的 OK 按钮。系统将停止向文件记录数据，暴露过程结束。
注意：若使用手动系统，操作人员需在暴露结束时手动关闭 VC 气流，并自行计算暴露结束后所需的 VC 清除时间。
6. 暴露后处理
- 将VC气瓶阀门上的旋塞转至关闭位置，并关闭暴露室内的所有气流。调节转子流量计，直至控制室内无气流通过。
- 从每个舱室中移除舱门，以确保小鼠通风。将笼架从舱室中取出。在通风橱内，将小鼠从暴露笼中取出，并放回饲养笼中。将所有小鼠运送回饲养室，在常规笼具中过夜饲养。
- 将粪便盘中的任何废弃物丢弃至环境卫生部门 & 安全（DEHS）批准的生物危害容器，因为这些物品可能被机构环境健康服务部门视为化学危害物。清洁实验组和对照组的舱门、排泄物托盘、暴露笼架以及暴露舱。
7. 暴露期间验证腔室内维生素C浓度
- 在每次暴露进行到一半时（3 小时），对实验舱内的氯乙烯（VC）浓度进行一次测量。
- 折断氯乙烯检测管和预处理管的玻璃尖端。将氯乙烯检测管的出气端连接到检测管泵上。用一段短管将氯乙烯检测管的进气端与预处理管的出气端连接。在预处理管的进气端连接一段短管。
- 取下靠近小鼠呼吸区的一个采样口的塞子。将预处理管进气端的连接管接到该采样口上。
- 将检测管泵活塞的手柄从完全推入位置拉至完全拉出位置。此操作将在 90 秒内从舱内抽取 100 mL 气体样品进入氯乙烯检测管。等待 90 秒后，将手柄重新推回到底。
- 重复步骤 7.4 三次，使总共抽取 400 mL 气体进入氯乙烯检测管。
- 将检测管从舱体采样口拆下，并将塞子重新插入采样口。观察氯乙烯检测管的颜色变化，以确定舱内氯乙烯的浓度。
- 在实验记录本中记录氯乙烯检测管的读数，并与理论值进行比较。将使用过的氯乙烯检测管和预处理管丢弃至合适的容器中。
8. 吸入暴露实验的终止
注意：在预期的暴露时间点（例如，开始吸入暴露后的6周、8周和/或12周）结束实验，随后对动物实施安乐死（时间线见图1）。
- 在实施安乐死前 4 小时对小鼠进行禁食。
注：该步骤可用于测定空腹血糖和胰岛素水平，以进行代谢分析。 - 采用符合美国兽医协会（AVMA）指南的安乐死方法，例如麻醉后放血。
- 通过腹腔注射给予每只小鼠氯胺酮/赛拉嗪（100/15 mg/kg），以诱导麻醉。
注：避免使用戊巴比妥钠作为安乐死前的麻醉剂，因为氯乙烯暴露可能影响其效果。 - 从下腔静脉采集血液至含柠檬酸钠溶液（终浓度 0.38%）的容器中，以防止血液凝固并保存样本。
- 取出肝脏和/或任何其他所需器官。解剖肝脏后，将部分组织在液氮中速冻，部分包埋于冷冻切片包埋剂中，部分固定于 10% 缓冲福尔马林中用于组织学分析。
- 通过离心分离血浆，并将柠檬酸化血浆转移至合适试管中，于 -80 °C 保存直至分析使用。
- 为评估肝脏损伤的组织学指标，对 5 µM 福尔马林固定石蜡包埋的肝组织切片进行苏木精和伊红（H&E）染色，并使用明场显微镜获取图像。
- 为测定血浆转氨酶水平，使用市售试剂盒对柠檬酸化血浆进行丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）动力学检测。
注：质量控制方面，C57Bl/6J 小鼠的 LFD+VC 组血浆转氨酶水平应处于正常范围（35−45 IU/L），而 HFD+VC 组的数值应升高（约 150 IU/L）（图 3C）。
结果
在实验过程中，每周监测动物的体重和食物摄入量，以确保动物健康并评估体内代谢情况。图3A展示了为期12周实验的体重和食物摄入量数据。所有组别的小鼠每周测量一次体重，每周测量两次食物摄入量。在整个研究期间，所有小鼠体重均有所增加。正如预期，高脂饮食（HFD）组小鼠的体重增加幅度大于低脂饮食（LFD）组小鼠，但暴露于VC的小鼠体重增加幅度并未高于相应对照组。各组之间的食物摄入量无显著差异12,24。
图3B 显示了用H&E染色的肝组织切片的代表性显微照片，用于分析一般形态。在LFD组中，VC未引起明显的病理改变。HFD喂养显著增加了脂肪变性（脂肪积聚），而VC暴露加剧了这一效应。此外，在HFD组中暴露于VC导致出现一些炎性病灶12,24。
血浆转氨酶（ALT 和 AST）水平被用作肝损伤的指标，转氨酶水平升高提示存在肝损伤。在低脂饮食（LFD）组中，维生素C（VC）未引起转氨酶水平升高。单独高脂饮食（HFD）轻微升高转氨酶水平，而维生素C显著增强了这一效应（图3C）12,24。
各组的肝脏重量与体重比值已计算得出。高脂饮食（HFD）显著增加了肝脏与体重的比值，但维生素C（VC）并未显著增强这一效应。图3D)12.
图1：吸入模型实验流程概述。 小鼠自由摄取相应的低脂饮食（13%饱和脂肪）或高脂饮食（42%饱和脂肪）持续1周，以适应纯化饮食。一周后，开始吸入干预。实验期间，小鼠被置于先进的全身吸入暴露舱中，每天暴露于低于OSHA标准的挥发性化合物（VC）浓度（<1 ppm，0.85 ppm ± 0.1 ppm）或普通空气（对照组）6小时，每周5天，持续12周。在吸入暴露过程中，小鼠可自由获取食物和饮水。12周后，于早晨处死小鼠。该模型可扩展用于更长时间的慢性暴露研究。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：吸入暴露舱设计。 图示为一种可提供均匀毒物浓度的自动化吸入暴露系统。定制软件允许用户在吸入暴露过程中调节、监测和记录环境参数。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：氯乙烯单独暴露不会引起明显的肝损伤，但会加剧饮食诱导的肝脏疾病。（A）每周监测体重和食物摄入量。（B）显示苏木精-伊红（H&E）染色的肝脏一般形态的代表性显微照片（放大倍数 = 200x）。（C）在暴露期结束时采集枸橼酸盐抗凝血浆，检测转氨酶酶活性以评估肝损伤程度。（D）在不同实验时间点测定肝脏重量，并与整体体重进行比较。结果以均值 ± 标准误表示。a，与相应LFD对照组比较，p < 0.05；b，与无氯乙烯暴露组比较，p < 0.05。每组样本量 n = 8−10。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
该VC增强型NAFLD模型是一种新颖的方法，用于评估在整体吸入暴露模式下低于OSHA限值的VC暴露效应。该模型使研究人员能够单独研究低水平VC引起的亚肝毒性及致敏效应。事实上，这种共暴露模型可导致肝脏损伤加重、血浆ALT和AST水平升高以及中度炎症反应，而在该浓度下基本不影响心脏等其他器官系统。23该慢性模型需要使用全身吸入式暴露舱，但可最大限度地减少应激反应和暴露浓度。尽管本文所述方案采用软件驱动的方式，但我们的经验表明，手动操作同样是一种准确且稳定的暴露方法。12,24此外，该方法可轻松应用于包括其他器官损伤在内的多个研究领域。23 由挥发性有机化合物暴露引起22值得注意的是，该模型可能更接近于人类同时暴露于环境化学物质与潜在疾病时的发病机制。5.
为了获得类似的结果，必须完成某些关键的方案优化步骤。例如，研究人员必须确认暴露舱内维生素C（VC）或其他毒物的浓度处于预期的暴露水平范围内（即低剂量、低于OSHA标准或急性暴露水平）。优化吸入暴露舱的这一步骤对于成功建立感兴趣的人类暴露模型至关重要。其次，每天的暴露时间以及实验持续时间也可进行调整。根据本研究团队的关注点，已实现了职业暴露条件，并额外研究了饮食这一参数。然而，该方案也可用于模拟环境暴露和急性暴露情况。
本研究挑战了目前氯乙烯（VC）暴露限值（职业性和环境性）是安全的这一传统观念。事实上，尽管目前美国职业安全与健康管理局（OSHA）规定的VC暴露限值为1 ppm，但本模型已证明，低于该限值浓度的VC暴露足以加重高脂饮食（HFD）诱导的小鼠肝脏损伤。本实验方案可使研究人员研究并表征一种新型毒物暴露模式，并建立TASH模型。
这是首个慢性低剂量氯乙烯（VC）暴露模型。以往的研究采用非常高剂量的推注浓度、急性暴露或活性代谢物作为氯乙烯暴露的替代方式。这些方法均降低了研究结果与人类实际暴露情况的相关性。因此，这一新型TASH-NAFLD相互作用模型为研究人员提供了必要的平台，用以探究低水平氯乙烯暴露的复杂相互作用。
这种毒物诱导的肝损伤模型也可用于研究其他挥发性有机化合物，以及可能影响肝脏和其他器官系统的其他相互作用8,22,23。此外，该模型已用于并可进一步用于研究针对这种常见毒物的干预疗法及其作用机制的深入研究24。由于氯乙烯（VC）是一种已知的致癌物26,27,28，该暴露范式也可加以改进，用于研究氯乙烯诱导的癌症。其他共病情况，如酒精性肝病，也可能因氯乙烯共暴露而加重。此外，研究该模型中不同类型的脂肪（如多不饱和脂肪18,29,30）或不同类型的碳水化合物31与氯乙烯的共暴露效应也具有重要意义。事实上，所有这些因素均已知对肝损伤的发展具有不同的影响，并可能在氯乙烯诱导的肝病中发挥作用。
综上所述，这是一种新型的环境毒物诱导肝损伤的吸入模型，建立了一种慢性低水平氯乙烯（VC）暴露的实验范式。该模型所使用的氯乙烯浓度本身低于肝毒性阈值，但在小鼠中可加重由其他因素（如高脂饮食，HFD）引起的肝损伤。该模型将有助于研究人员探讨慢性氯乙烯毒性的机制及干预措施，并可能对针对暴露人群的转化医学研究以及高风险暴露人群的研究提供帮助。
披露
WT Goldsmith 对 IEStechno 拥有财务利益，IEStechno 是本文所述系统的模板。其余作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助（资助号：K01 DK096042 和 R03 DK107912），授予 Juliane Beier。研究还获得了美国国立卫生研究院普通医学科学国家研究所通过资助号 P20GM113226 提供的机构发展奖（IDeA），以及美国国立卫生研究院酒精滥用与酒精中毒国家研究所通过资助号 P50AA024337 提供的支持。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ALT/AST 试剂 | Thermo Fisher | TR70121, TR71121 | |
| C57Bl/6J 小鼠 | The Jackson Laboratory | 000664 | 动物实验必须符合所有相关的伦理和动物福利法规，并须经相应的政府和机构动物护理与使用委员会审查和批准。 由于本研究为慢性实验，建议使用 4–6 周龄的雄性或雌性小鼠。 |
| CO2 监测仪 | IEStechno | Ex-Sens | |
| 伊红 | Sigma | E6003 | |
| 苏木精 | Sigma | HHS16 | |
| 吸入暴露室系统 | IEStechno | GasExpo | 吸入暴露室系统包含定制软件、接口和控制器集线器 |
| 饱和脂肪（13%）对照饮食 | Teklad Diets | TD.120336 | |
| 饱和脂肪（42%）饮食 | Teklad Diets | TD.07511 | |
| 柠檬酸钠 | Sigma | 71497 | |
| 氯乙烯 | MATHESON TRI-GAS | Series 3590-CGA* | 操作气体时需谨慎 |
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