浦肯野细胞在离体小脑切片培养中的存活

摘要

器官型脑片培养是研究神经发育或变性/再生过程的有力工具。本文描述了一种在小鼠小脑脑片培养中模拟浦肯野细胞神经发育性死亡的实验方案。该方法可能有助于神经保护药物发现领域的研究。

摘要

器官型脑片培养是一种强大的体外模型，相较于解离的原代细胞培养，能更接近地模拟体内环境。在出生后早期发育阶段，小脑浦肯野细胞已知会经历一个易损期，在此期间发生程序性细胞死亡。本文提供了在此关键时期进行小鼠器官型小脑脑片培养的详细实验方案。通过进一步标记脑片，可评估浦肯野细胞的存活情况以及神经保护治疗的效果。该方法对于筛选新的神经活性分子具有极高的应用价值。

引言

体外建模是生物医学研究中的重要工具。它使研究人员能够在特定的细胞类型或分离的系统/器官中研究并严格控制特定机制。器官型脑片培养是一种广泛应用的体外技术，尤其在神经科学领域¹。该方法最初由Gähwiler建立，他采用滚管技术培养脑片²，随后Yamamoto等人进行了改进，引入微孔膜用于进行皮层脑片培养³。与原代细胞培养相比，器官型脑片培养的优势在于能够保留组织的细胞结构以及组织切片平面上的天然细胞间连接。

已从中枢神经系统的多个部位培养出器官型脑片，例如海马体⁴、大脑皮层⁵、纹状体⁶、小脑^4,7以及脊髓^8,9等。此类脑片已被证实是药物发现研究中的有力工具¹⁰。神经活性分子的作用可通过多种方式进行评估：利用免疫染色和生物化学检测评估细胞存活与神经退行性变，或通过电生理学和活体成像技术评估神经环路的形成或破坏。

....

方案

所有涉及动物的实验均按照西北大学动物研究委员会的规定进行。

1. 器官型小脑切片培养前的准备

1. 在事先用70%乙醇喷洒过的细胞培养超净台内，于连接无菌接收瓶的250 mL瓶顶式真空过滤器中制备200 mL培养基。加入100 mL基础培养基Eagle（BME）、50 mL Hank平衡盐溶液（HBSS）、50 mL热灭活马血清、1 mL 200 mM L-谷氨酰胺（终浓度1 mM）以及5 mL 200 g/L葡萄糖溶液（终浓度5 mg/mL）。将培养基经真空过滤后，置于+4 °C保存，可使用长达一个月。
2. 在无菌生物安全柜中，从包装中取出一个6孔细胞培养板，每孔加入1 mL培养基。若需进行处理，向处理孔中加入药理试剂，对照孔中加入等体积的溶剂对照溶液。本研究中，向处理孔加入1 µL无菌3 M KCl溶液（终浓度30 mM），向对照孔加入1 µL无菌水。
3. 将所需数量的独立包装、带有亲水性聚四氟乙烯（PTFE）膜（孔径=0.4 µm）的细胞培养小室移入细胞培养超净台内。小心拆开包装，用无菌镊子取出细胞培养小室，逐个放入6孔板的孔中，避免小室膜与培养基界面产生气泡。将小室置于37 °C、5% CO₂培养箱中至少平衡2小时后再进行细胞培养。
   注意：组织切片机长期放置于细胞培养超净台内。
4. 准备两个200 mL烧杯，一个装有150 mL无菌水....

结果

如图4所示，本方案可制备小脑组织切片培养物，通过免疫荧光染色和图像采集步骤评估浦肯野细胞的存活情况。浦肯野细胞使用抗-Calbindin D-28K抗体（稀释度1/200）与Alexa594标记的抗小鼠二抗（稀释度1/300）联合标记。图像拼接由显微镜采集软件（NIS-Elements）自动完成，以获得完整小脑切片的图像。每片切片中的浦肯野细胞数量被输入Prism 8软件，用于生成图表并进行统计分析。在P6阶段，对照组中浦肯野细胞的存活率较低，这与其已知的易损期一致⁴（图4A,E）。随着供体动物年龄增长并度过该关键时期，细胞存活率逐渐升高（图4C,E）。通过高浓度KCl处理小脑切片，可成功诱导其去极化并促进细胞存活¹⁴（图4.......

讨论

小脑脑片培养是研究出生后发育过程中程序性浦肯野细胞死亡的有力工具。该技术可用于快速筛选候选分子的神经保护潜力。其主要优点在于操作简便、成本效益高，且对设备的投入要求较低（振动切片机的价格可能比组织切片器高出3倍以上）。此外，每只幼鼠可制备10至15片健康的脑片，仅需一只动物即可同时进行多种不同的实验分析。

为了获得一致且可重复的实验结果，必须尽可能高效地进行培养，并选择健康的 cerebellar 组织切片用于培养。该方法也适用于长期培养（可长达数月）。因此，在解剖和切片过程中必须采用良好的无菌操作技术，以避免污染，从而无需在培养中添加抗生素。

小脑切片培养模型可保留组织切片平面内及培养区域中的原有细胞间相互作用。但需注意：与培养区域外靶区的连接可能被切断。传入纤维提供的神经营养因子供应也可能中断，从而影响神经元的存活。这一问题可通过进行器官型切片共培养部分克服。已有研究表明，当与下橄榄核切片共同培养时，攀爬纤维能够侵入出生后的小脑切片培养物^14,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor 594 驴抗小鼠 IgG 二抗	ThermoFisher scientific	A21203
基础Eagle培养基（BME）	ThermoFisher scientific	21010046
II级A2型生物安全柜	NuAire	NU-540-400
牛血清白蛋白	Millipore Sigma	A2153
刷子
抗钙结合蛋白D-28K抗体（CB-955）	Abcam	ab82812
CO2培养箱	NuAire	NU-5700
Corning Costar 平底6孔细胞培养板	Fisher Scientific	07-200-83
盖玻片，22 × 50 mm	Fisher Scientific	12-545-E
直型持针钳	Harvard Apparatus	72-8949
双刃刀片	Fisher Scientific	50949411
200度乙醇	Decon Labs, Inc	2701
直型眼科剪	Harvard Apparatus	72-8428
精细镊子	Fisher Scientific	16-100-127
L-谷氨酰胺 100X	ThermoFisher scientific	25030149
葡萄糖溶液	ThermoFisher scientific	A2494001
Hanks’ 平衡盐溶液	ThermoFisher scientific	14025092
Hoechst 33342 三盐酸盐三水合物	Fisher Scientific	H21492
马血清，热灭活，新西兰来源	ThermoFisher scientific	26050088
ImageJ
McIlwain组织切片机	Fisher Scientific	NC9914528
微电极	Fisher Scientific	08-850
Millicell细胞培养插入式培养皿	Millipore Sigma	PICM0RG50
Nalgene Rapid-Flow 一次性无菌PES膜滤器，250 mL	ThermoFisher scientific	168-0045
Nikon A1R 共聚焦激光显微镜系统	Nikon
NIS-Elements 成像软件	Nikon
多聚甲醛	Acros Organics	41678-0010
巴斯德吸管	Fisher Scientific	13-678-20D
氯化钾	Fisher Scientific	BP366-500
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂	ThermoFisher scientific	P10144
直型手术剪	Harvard Apparatus	72-8403
轨道摇床 Belly Dancer	IBI Scientific	BDRLS0003
Prism 8	GraphPad
Superfrost Plus 显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-550-15
组织培养皿，60 mm 带握环	Fisher Scientific	FB012921
24孔细胞培养板	Falcon/Corning	353047
无菌移液管	ThermoFisher scientific	13-711-21
Triton X-100	ThermoFisher scientific	BP151-500