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方法文章

浦肯野细胞在离体小脑切片培养中的存活

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DOI：

10.3791/60353

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2019年12月18日

 , 
1Department of Physiology, Northwestern University, Feinberg School of Medicine

本文内容

摘要

器官型脑片培养是研究神经发育或变性/再生过程的有力工具。本文描述了一种在小鼠小脑脑片培养中模拟浦肯野细胞神经发育性死亡的实验方案。该方法可能有助于神经保护药物发现领域的研究。

摘要

器官型脑片培养是一种强大的体外模型，相较于解离的原代细胞培养，能更接近地模拟体内环境。在出生后早期发育阶段，小脑浦肯野细胞已知会经历一个易损期，在此期间发生程序性细胞死亡。本文提供了在此关键时期进行小鼠器官型小脑脑片培养的详细实验方案。通过进一步标记脑片，可评估浦肯野细胞的存活情况以及神经保护治疗的效果。该方法对于筛选新的神经活性分子具有极高的应用价值。

引言

体外建模是生物医学研究中的重要工具。它使研究人员能够在特定的细胞类型或分离的系统/器官中研究并严格控制特定机制。器官型脑片培养是一种广泛应用的体外技术，尤其在神经科学领域1。该方法最初由Gähwiler建立，他采用滚管技术培养脑片2，随后Yamamoto等人进行了改进，引入微孔膜用于进行皮层脑片培养3。与原代细胞培养相比，器官型脑片培养的优势在于能够保留组织的细胞结构以及组织切片平面上的天然细胞间连接。

已从中枢神经系统的多个部位培养出器官型脑片，例如海马体4、大脑皮层5、纹状体6、小脑4,7以及脊髓8,9等。此类脑片已被证实是药物发现研究中的有力工具10。神经活性分子的作用可通过多种方式进行评估：利用免疫染色和生物化学检测评估细胞存活与神经退行性变，或通过电生理学和活体成像技术评估神经环路的形成或破坏。

本研究的目的是描述一种简单的器官型小脑切片培养方法，该方法被公认为是体外模拟小脑发育的相关模型。特别是，我们聚焦于浦肯野细胞发育性死亡的研究。在体内，浦肯野细胞在出生后第一周发生凋亡，峰值出现在出生后第3天（P3）11。在小脑切片培养中也观察到相同的模式：当小脑取自出生后第1至第8天（P1–P8）的动物时，浦肯野神经元通过凋亡方式死亡，死亡高峰同样出现在P34,12。器官型小脑切片培养的应用已帮助鉴定出多种神经营养保护分子7,13，并部分揭示了这种程序性细胞死亡所涉及的机制14,15,16。本文所述方案基于Stoppini等17在海马组织中的研究，并由Dusart等4针对小脑组织进行了改良。该方案包括出生后小脑的快速解剖与切割；将小脑切片置于含有微孔膜的细胞培养插入式培养板上进行培养，可选择性地添加神经营养保护处理；以及通过免疫荧光染色评估神经元存活情况。

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方案

所有涉及动物的实验均按照西北大学动物研究委员会的规定进行。

1. 器官型小脑切片培养前的准备

  1. 在事先用70%乙醇喷洒过的细胞培养超净台内，于连接无菌接收瓶的250 mL瓶顶式真空过滤器中制备200 mL培养基。加入100 mL基础培养基Eagle（BME）、50 mL Hank平衡盐溶液（HBSS）、50 mL热灭活马血清、1 mL 200 mM L-谷氨酰胺（终浓度1 mM）以及5 mL 200 g/L葡萄糖溶液（终浓度5 mg/mL）。将培养基经真空过滤后，置于+4 °C保存，可使用长达一个月。
  2. 在无菌生物安全柜中，从包装中取出一个6孔细胞培养板，每孔加入1 mL培养基。若需进行处理，向处理孔中加入药理试剂，对照孔中加入等体积的溶剂对照溶液。本研究中，向处理孔加入1 µL无菌3 M KCl溶液（终浓度30 mM），向对照孔加入1 µL无菌水。
  3. 将所需数量的独立包装、带有亲水性聚四氟乙烯（PTFE）膜（孔径=0.4 µm）的细胞培养小室移入细胞培养超净台内。小心拆开包装，用无菌镊子取出细胞培养小室，逐个放入6孔板的孔中，避免小室膜与培养基界面产生气泡。将小室置于37 °C、5% CO2培养箱中至少平衡2小时后再进行细胞培养。
    注意：组织切片机长期放置于细胞培养超净台内。
  4. 准备两个200 mL烧杯，一个装有150 mL无菌水，另一个装有150 mL 70%乙醇。使用前，先将手术器械浸入70%乙醇中，再浸入水中冲洗。
    注意：手术器械接触乙醇后不可立即使用。
  5. 将双刃刀片在70%乙醇烧杯中消毒，用无菌镊子将其安装至刀片架上，并使用刀片夹紧扳手固定。晾干后备用。
  6. 将组织切片机配套的塑料圆盘在70%乙醇烧杯中消毒。放置圆盘前，用70%乙醇喷洒切割台表面，晾干后备用。

2. 解剖与小脑器官型切片培养

  1. 将小鼠幼崽放入细胞培养超净台中进行解剖操作。
  2. 使用直型手术剪迅速剪下幼崽头部（图1A）。
  3. 用直型敷料镊夹住幼崽鼻部固定头部，从后端开始，沿头侧至中线方向，使用直型眼科剪剪开头皮。
  4. 颅骨的切开操作步骤相同。
    注意：解剖过程中务必使剪刀尖端朝外，以避免损伤小脑。
  5. 取出脑组织并转移至盛有冷HBSS + 5 mg/mL葡萄糖的60 mm培养皿中。
  6. 使用无菌直型精细镊小心分离出小脑（图1B），再用无菌弯型精细镊将其转移至组织切片机切割台上的塑料载片上。
  7. 通过旋转切割台调整组织方向，以进行旁矢状切面切割。
  8. 向右拉动切割台释放旋钮，移动切割台，使刀片位于组织边缘。
  9. 将切片厚度调整为350 µm，刀片速度设为中等。
  10. 启动切片机。待整个小脑完全切片后（图1C），关闭切片机。
  11. 用无菌镊子取出塑料载片。
  12. 小心将塑料载片靠近盛有HBSS + 5 mg/mL葡萄糖的60 mm培养皿。使用无菌移液管将冷HBSS + 5 mg/mL葡萄糖溶液滴加到组织上，使小脑切片落入缓冲液填充的培养皿中以便收集。
  13. 使用微探针将小脑切片彼此分离。用移液管取出质量良好的切片（建议选用靠近蚓部的组织切片），并将其放入预先平衡的细胞培养插入式培养器中（图1D）。
  14. 使用微探针将小脑切片在细胞培养插入式培养器上定位，然后用移液管小心吸除多余的HBSS + 5 mg/mL葡萄糖溶液。
    注意：此阶段组织极为脆弱，易受物理损伤。每插入式培养器可培养的小脑切片最大数量取决于供体动物的年龄。P0–P4龄动物可培养6–8片，P5以上龄动物可培养4–6片。
  15. 将培养皿放入培养箱中，每2–3天完全更换一次培养基。
  16. 为评估浦肯野细胞存活情况，可在体外培养5天时即收集切片。若用于其他目的，切片可在培养中维持数周（图1F）。
    注意：在进行浦肯野细胞存活实验时，更换细胞培养基时无需重新添加药理学处理剂（图1F）。

3. 免疫荧光

  1. 从培养箱中取出6孔板，吸去细胞培养基，用1× PBS洗涤细胞培养插件，并在插件下方加入1 mL、上方加入500 µL冷的4%多聚甲醛溶液，于4℃固定1小时。
  2. 在旋转摇床上用1× PBS对插件进行4次洗涤，每次10分钟，每次在插件下方加入1 mL、上方加入500 µL。
  3. 用刷子将小脑切片从一个细胞培养插件转移至已预装含有1× PBS、0.25% Triton X-100和3% BSA（PBS-TB）的24孔板中的一个孔内，每孔500 µL。
  4. 在室温下用PBS-TB溶液孵育切片1小时，进行通透和封闭处理。
  5. 将一抗用PBS-TB溶液稀释后加入，每孔200 µL，在4℃下于旋转摇床上避光孵育过夜。
  6. 次日，在旋转摇床上用1× PBS进行4次洗涤，每次10分钟，每孔500 µL。
  7. 加入用PBS-TB溶液稀释的二抗，每孔200 µL，在室温下于旋转摇床上避光孵育2小时。
  8. 在旋转摇床上用1× PBS进行4次洗涤，每次10分钟，每孔500 µL。
  9. 使用Hoechst 33342（用1× PBS稀释至2 µg/mL）对切片进行核复染，在室温下避光孵育10分钟，每孔500 µL。
  10. 用移液管将小脑切片转移至显微镜载玻片上，避光完全自然晾干。用1× PBS重新润湿切片后，滴加数滴封片剂（约80 µL）覆盖盖玻片，注意避免产生气泡。
  11. 待封片剂完全固化后，小脑切片即可用于成像。

4. 细胞存活的成像与定量分析

  1. 根据制造商和/或成像核心设施的说明，打开显微镜和激光器。
  2. 启动图像采集软件。
  3. 使用10倍物镜，定位未发生改变的小脑切片，这些切片通常包含9–10个叶（一般为靠近小脑蚓部的小脑切片）。
  4. 启动z轴层扫采集功能。设定z轴层扫范围，以涵盖小脑切片中所有存在的浦肯野细胞。设置步长为2 µm，并开始采集。将采集的图像以采集软件制造商指定的格式保存，以保留相关元数据。
  5. 使用Bio-formats插件18在ImageJ中打开采集的文件。
  6. 进入 图像 > 堆栈 > Z轴投影…（图2A）。
  7. 在“投影类型”下拉菜单中选择 最大强度投影，然后点击 确定（图2B）。
  8. 将生成一幅扁平化的二维图像。双击 多点 工具，使 点工具 窗口出现。取消勾选 标记点 选项，以便更清晰地观察已计数的细胞。随后，直接点击浦肯野细胞的胞体开始计数（图1E）。已计数细胞的总数将显示在 点工具 窗口的底部（图3）。
    注意：通常，每个细胞培养插件中至少可量化3个无损伤且包含9–10个叶的切片。为评估药理学试剂的神经保护作用，应至少进行3次独立实验。

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结果

如图4所示，本方案可制备小脑组织切片培养物，通过免疫荧光染色和图像采集步骤评估浦肯野细胞的存活情况。浦肯野细胞使用抗-Calbindin D-28K抗体（稀释度1/200）与Alexa594标记的抗小鼠二抗（稀释度1/300）联合标记。图像拼接由显微镜采集软件（NIS-Elements）自动完成，以获得完整小脑切片的图像。每片切片中的浦肯野细胞数量被输入Prism 8软件，用于生成图表并进行统计分析。在P6阶段，对照组中浦肯野细胞的存活率较低，这与其已知的易损期一致4（图4A,E）。随着供体动物年龄增长并度过该关键时期，细胞存活率逐渐升高（图4C,E）。通过高浓度KCl处理小脑切片，可成功诱导其去极化并促进细胞存活14（图4...

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讨论

小脑脑片培养是研究出生后发育过程中程序性浦肯野细胞死亡的有力工具。该技术可用于快速筛选候选分子的神经保护潜力。其主要优点在于操作简便、成本效益高，且对设备的投入要求较低（振动切片机的价格可能比组织切片器高出3倍以上）。此外，每只幼鼠可制备10至15片健康的脑片，仅需一只动物即可同时进行多种不同的实验分析。

为了获得一致且可重复的实验结果，必须尽可能高效地进行培养，并选择健康的 cerebellar 组织切片用于培养。该方法也适用于长期培养（可长达数月）。因此，在解剖和切片过程中必须采用良好的无菌操作技术，以避免污染，从而无需在培养中添加抗生素。

小脑切片培养模型可保留组织切片平面内及培养区域中的原有细胞间相互作用。但需注意：与培养区域外靶区的连接可能被切断。传入纤维提供的神经营养因子供应也可能中断，从而影响神经元的存活。这一问题可通过进行器官型切片共培养部分克服。已有研究表明，当与下橄榄核切片共同培养时，攀爬纤维能够侵入出生后的小脑切片培养物14,

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

成像工作在西北大学先进显微镜中心完成，该中心由授予罗伯特·H·卢里综合癌症中心的美国国家癌症研究所癌症中心支持专项基金（NCI CCSG P30 CA060553）慷慨资助。我们感谢肖恩·麦克德莫特提供的技术协助与支持，以及玛雅·爱泼斯坦为图1提供的手绘插图。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Alexa Fluor 594 驴抗小鼠 IgG 二抗ThermoFisher scientificA21203
基础Eagle培养基（BME）ThermoFisher scientific21010046
II级A2型生物安全柜NuAireNU-540-400
牛血清白蛋白Millipore SigmaA2153
刷子
抗钙结合蛋白D-28K抗体（CB-955）Abcamab82812
CO2培养箱NuAireNU-5700
Corning Costar 平底6孔细胞培养板Fisher Scientific07-200-83
盖玻片，22 × 50 mmFisher Scientific12-545-E
直型持针钳Harvard Apparatus72-8949
双刃刀片Fisher Scientific50949411
200度乙醇Decon Labs, Inc2701
直型眼科剪Harvard Apparatus72-8428
精细镊子Fisher Scientific16-100-127
L-谷氨酰胺 100XThermoFisher scientific25030149
葡萄糖溶液ThermoFisher scientificA2494001
Hanks’ 平衡盐溶液ThermoFisher scientific14025092
Hoechst 33342 三盐酸盐三水合物Fisher ScientificH21492
马血清，热灭活，新西兰来源ThermoFisher scientific26050088
ImageJ
McIlwain组织切片机Fisher ScientificNC9914528
微电极Fisher Scientific08-850
Millicell细胞培养插入式培养皿Millipore SigmaPICM0RG50
Nalgene Rapid-Flow 一次性无菌PES膜滤器，250 mLThermoFisher scientific168-0045
Nikon A1R 共聚焦激光显微镜系统Nikon
NIS-Elements 成像软件Nikon
多聚甲醛Acros Organics41678-0010
巴斯德吸管Fisher Scientific13-678-20D
氯化钾Fisher ScientificBP366-500
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂ThermoFisher scientificP10144
直型手术剪Harvard Apparatus72-8403
轨道摇床 Belly DancerIBI ScientificBDRLS0003
Prism 8GraphPad
Superfrost Plus 显微镜载玻片Fisher Scientific12-550-15
组织培养皿，60 mm 带握环Fisher ScientificFB012921
24孔细胞培养板Falcon/Corning353047
无菌移液管ThermoFisher scientific13-711-21
Triton X-100ThermoFisher scientificBP151-500

参考文献

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